多糖结构构象及生物活性概述

析以及糖含量测定，通常选用示差检测器。
3·3·3 质谱法
•
在糖类的研究中质谱法显示出不可替代的作
用。GC-MS已广泛应用于糖组成分析和甲基化分
析，以确定糖残基连接方式。上世纪80年代各软
电离技术的诞生，如快原子轰击质谱（FAB-
MS）、电喷雾质谱（ESI-MS）、基质辅助激光
解析离子化质谱（MALDI-MS）等，使糖结构分
3·3·2 气相色谱法（GC）
•
气相色谱法主要用于单糖组成、糖醛酸种类
和组成、Smith降解产物等分析。GC具有样品用
量少、分辨率强、灵敏度高、分析速度快等优点，
然而该法需要对多糖样品进行处理，衍生成易挥
发、对热稳定的衍生物后再进行分析。液相色谱
法（HPLC）也可用于糖的分析，如多糖纯化及
其相对分子质量测定，单糖组成、糖醛酸种类分
直 链 淀 粉 的 二 级 结 构
• 1·1·3 三级和四级结构
• 多糖链一级结构的重复顺序,由于糖单位的羟 基、羧基、氨基以及硫酸基之间的非共价相互作 用,导致有序的二级结构空间有规则而粗大的构象, 即是多糖链的三级结构。多糖的四级结构是指多 聚链间非共价键结合形成的聚集体。
2 多糖结构的研究趋势
3·2·5 甲基化分析
•
甲基化分析是确定寡糖和多糖中单糖间糖苷
键位置的重要手段。其原理是：先将多糖中各种
单糖残基中的游离羟基全部甲基化，将甲基化多
糖水解得到甲基化的单糖进行衍生处理，最后用
GC-MS（气相色谱衍生物的归属，
从而确定单糖残基的连接位点。同时根据不同甲
现性好等优点，在国内外得到广泛使用。
3·2 化学降解分析方法
3·2·1 单糖组成测定
多糖水解后生成的单糖混合物或单糖甲基糖 苷混合物可以用TLC（薄层色谱法）、HPLC （高效液相色谱法）或GC（气相色谱法）等方法 作定性鉴定和定量分析。GC分析时，待测样品要 转换成易挥发、热稳定性好的衍生物，如糖三甲 基硅醚、糖醇乙酸酯、糖三氟乙酸酯等。样品的 水解方法有甲醇水解、盐酸水解、硫酸水解和三 氟乙酸水解等，其中三氟乙酸水解法最为常用。
（1）提高巨噬细胞吞噬能力。
植物多糖对巨噬细胞的免疫调节作用主要表现 在影响巨噬细胞活性氧的产生、细胞因子的分泌 （如白细胞介素IL、肿瘤坏死因子TNF、干扰素IFN 集落刺激因子CSF等）、细胞增殖和吞噬活性等，从 而起到对天然免疫和适应性免疫的调控作用。从 Aloe barbadensis分离得到的甘露聚糖表现出显著 的刺激单核巨噬细胞生成的效应，车前子多糖具有 抑制小鼠腹腔巨噬细胞吞噬活性、刺激体外 RAW264.7巨噬细胞增殖并提高NO释放的作用。
在完全水解前，终止水解，可得到不同的寡糖片
段和可能的多糖主链，然后综合采用单糖测定、
甲基化分析和核磁共振等方法可深入解析多糖结
构。
3·2·3高碘酸氧化
•
高碘酸及其盐可以选择性地断裂糖分子中的连二羟基或
连三羟基，生成相应的多糖醛、甲醛或甲酸。糖的非还原末
端或非末端的（1→6）-键与邻三元醇相似，其与过碘酸盐作
疫生物化学、PCR等现代分子生物学技术,进行多
糖化学结构与活性的系统研究;
•
二是借助最新的仪器与计算机模拟技术,研究
和模拟多糖在溶液中的构象变化,以研究糖类物质
在参与生命活动、产生生物效应时的精细结构。
3 多糖结构的分析方法
与其它生物大分子一样， 糖链的二级以上高级结构 是以一级结构为基础的。 不同的是，与蛋白质或核酸大 分子相比，糖链的一级结构“含义”要丰富得多。 测定 糖链的一级结构，要解决以下几个问题：
天然产物活性多糖的结构与构象 及生物活性的研究
组员：李冰，刘晨，史蕊， 薛冰，朱传胜
1 多糖的结构的概述
• 1·1 结构层次
• 多糖的结构分类沿用了蛋白质和核酸的分析
方法。单糖是糖类的组成单元,单糖之间脱水形成 糖苷键,并以糖苷键线性或分支连接成寡糖和多糖。 一般将少于20个糖基的糖链称为寡糖,多于20个糖 基的糖链称为多糖。寡糖和多糖的结构也可分为 一级、二级、三级、四级结构。
比例。多糖的过碘酸盐氧化一般在pH 3~5的水溶液中进行
（暗处）。过低pH导致酸水解，过高pH引起无选择性氧化。
确定糖苷键的位置时，需要与Smith降解相结合。
3·2·4 Smith降解
Smith降解是将高碘酸氧化的产物还原后进 行酸水解。由于糖基之间不同的位置缩合，因此 用高碘酸氧化后生成不同的产物。将氧化产物用 硼氢化钠还原成稳定的多羟基化合物，水解后用 纸层析或者GLC（气液分配色谱法）鉴定水解产 物，由降解的产物推断糖苷键的位置。由于实验 中加入乙二醇终止反应，所以检测终产物中乙二 醇没有意义，一般以甘油、赤藓醇和其它糖等作 为糖苷键的特征终产物。
水、难溶于DMSO（二甲基亚砜）的多糖，可以
先用少量水使多糖溶解，再与DMSO混合，然后
加入分子筛脱水，采用Needs法进行多糖甲基化，
可得到甲基化程度比较完全的产物。
• 在甲基化分析过程中，需要注意以下几点： （1）多糖甲基化后用红外检测其是否含有羟基， 如果仍有羟基峰存在，则表示甲基化不完全，需 重复进行甲基化或者采用氯仿等溶剂将已甲基化 的多糖萃取出来并作后续处理分析； （2）含有糖醛酸或氨基己糖残基的多糖比较难甲 基化，可能会产生二级产物。对于含有糖醛酸、 氨基己糖以及某些取代基团的多糖，在甲基化分 析时需要考虑甲基化和酸水解是否会引发副反应。
•
近20年来,许多糖类物质不断进入临床研究,
主要集中在抗感染、抗肿瘤、抗风湿、抗消化道
溃疡和增进免疫功能等方面实验与应用。但由于
多糖本身的结构复杂,很多特殊的生物活性都与其
复杂的空间结构关系密切,因此对多糖结构的研究
是开发新一代糖类药物的关键。
• 目前,国内外对多糖结构的研究主要有两个趋势:
•
一是在多糖常规结构分析方法基础上,引入免
4 天然产物活性多糖的生物活性功能
对多糖的功能研究主要集中在2个方面： 一是作为非特异治疗剂，作用于相类似的对
应分子，调节各种生理功能或纠正病理过 程。 二是作为信息分子进入机体，发挥补充调节 或抑制的作用。
4·1 多糖的免疫调节作用
多糖的免疫调节功能是其最重要的功能活性， 多糖能在多条途径、多个层面对免疫系统发挥作用。 具体表现在：
3·2·2部分酸水解
•
通过部分酸水解的方法将多糖水解成易于分
析的小片段。一般来说，吡喃型糖基比呋喃型糖
基稳定，己糖比戊糖稳定，1-6糖苷键对酸水解相
对稳定，主链的糖基比支链的糖基稳定。因此，
通过部分酸水解可以判断糖苷键的断裂次序，推
断可能的糖苷键类型。多糖可在温和条件下水解
或者在剧烈条件（高温、较高浓度酸）下水解。
（1）相对分子质量； （2）糖链的糖基组成，各种单糖组成的摩尔比； （3）有无糖醛酸及具体的糖醛酸类型和比例； （4）各单糖残基的D-或L-构型，吡喃环或呋喃环形式； （5）各个单糖残基之间的连接顺序； （6）每个糖苷键所取的α-或β-异头异构形式； （7）每个糖残基上羟基被取代情况； （8）糖链和非糖部分连接情况； （9）主链和支链连接位点； （10）糖残基可能连接硫酸酯基、乙酰基、磷酸基、甲基的类型等。
3·3仪器分析法
3·3·1紫外光谱法
紫外光谱法是多糖结构研究中常用的仪器分析 方法之一，如采用苯酚-硫酸法、蒽酮-硫酸法等 测定多糖含量，咔唑-硫酸法测定糖醛酸含量，柱 层析过程中利用苯酚-硫酸法绘制多糖洗脱曲线， 考马斯亮蓝法或Folin-酚试剂法测定多糖复合物 中的蛋白含量等。在波长280、260 nm处考察多 糖中是否含有蛋白、核酸等。利用红外光谱中多 糖的特征吸收峰，可鉴定多糖中糖的种类、糖环 构型，提供异头碳的信息。
量（Mw）、数均相对分子质量（Mn）、重均相
对分子质量（Mw）和粘均相对分子质量（Mv）
表示。
目前测定多糖相对分子质量的方法主要有渗
透压法、蒸汽压法、端基法、光散射法、黏度法、
超过滤法、聚丙烯酰胺凝胶电泳法、凝胶过滤法
和HPGPC（高效凝胶渗透色谱法）等。HPGPC
测定多糖相对分子质量具有快速、高分辨率和重
析研究取得了日新月异的发展。
3·3·4 核磁共振（NMR）技术
•
NMR是研究多糖糖链结构的一种有效方法，
常用来解决多糖结构中糖普键的构型和重复结构
中单糖的数目。其中’H-NMR主要解决多糖结构
中糖普键的构型问题;’3c-NMR的化学位移较’H-
NMR宽，分辨率较高，因此不仅能够确定各种碳
的位置，还能够区别分子的构型和构象。这种方
• （2）对T、B淋巴细胞的作用。香菇多糖是一种典型的T
淋巴细胞增强剂，在体内外均能促进特异性细胞毒T淋巴 细胞的产生，提高该细胞的杀伤活性。
• （3）对NK（自然杀伤细胞）、LAK（淋巴因子激活的杀 伤细胞）的作用。大量的研究表明猕猴桃茎多糖、牛膝多 糖等对NK、LAK细胞活性都有增强作用，其增强作用呈 剂量依赖性。
• （4）通过不同途径激活补体系统。有些是通过替代通路 激活补体，有些是通过经典途径，这一类多糖有柴胡多糖 和三七多糖等。
支链淀粉的一级结构
• 1·1·2 二级结构
• 多糖的二级结构指多糖骨架链间以氢键结合所 形成的各种聚合体,只关系到多糖分子中主链的构 象,不涉及侧链的空间排布。在多糖链中,糖环的 几何形状几乎是硬性的,各个单糖残基绕糖苷键旋 转而相对定位,可决定多糖的整体构象。通常糖苷 键有两个可旋转的主链二面角:φ (H1-C1-O1-C糖 配基),ψ (C1-O1-C糖配基-H糖配基),两个单糖若 为1→6连接,则还有第三个可旋转的二面角ω (O6C6-C5-O5),解决寡糖构象的关键在于确定φ 、ψ 、 ω 的取值。但是,它们的取值受相邻糖环之间的空 间阻碍和相邻糖残基间的非共价键相互作用的严 格限制。因此,多糖的二级结构形式主要依赖一级 结构的排步。
型的寡糖序列分析仪，但这还只适用于结构规律
较明确的糖链。
3·4·2 免疫学法
•
该方法的原理是一定结构的多糖会抑制抗原、
抗体的结合。不同的糖有不同的抑制常数，因此
当某种未知结构的糖链对抗原、抗体的结合产生
了抑制作用，通过测定其抑制常数，再与已知结
构的糖链作比较，如有相近抑制常数，其结构也
会相似。
• 像上面提到的，多糖的结构分析方法 很多，但是还没有一种方法可以单独完成 多糖结构的分析，因此需要将各种方法结 合起来才能完成多糖结构的分析。
• 多糖结构的分析手段很多，不仅有仪器 分析法，如红外、核磁共振、质谱等，还有 化学方法，如部分酸水解、完全酸水解、高 碘酸氧化、Smith降解、甲基化反应等，以 及生物学方法，如特异性糖苷酶酶切、免疫 学方法等（见表1）
表1 多糖的结构分析方法
3·1 相对分子质量的测定
•
多糖的相对分子质量可以用量均相对分子质
• 1·1·1 一级结构
•
多糖的一级结构是指糖基的组成、糖基排列
顺序、相邻糖基的连接方式、异头碳构型以及糖
链有无分支、分支的位置与长短等。糖的一级结
构非常复杂,再加上糖残基上可以连接硫酸基团、
乙酯基团、磷酸基团、甲基化基团,这就更加剧了
糖一级结构的复杂性。
同多糖
多
杂多糖
糖
的
一
级
结
构
直链淀粉的一级结构
基化单糖的比例推出这种连接键型在多糖重复结
构中的比例。然而甲基化分析无法确定异头碳糖
苷键构型和单糖残基的顺序信息。
•
多糖甲基化通过一系列的改进，目前有多种
方法，如Purdie法、Haworth法、Menzies法、
Hakomori法、Cicanu法、Needs法等，其中
Needs改良的甲基化方法较为常用。针对易溶于
用，糖环开裂得一分子比例的甲酸而消耗二分子比例的过碘
酸盐。非末端的（1→2）-或（1→4）-键与邻二元醇相似，
其开裂后产生二分子醛而消耗一分子比例之过碘酸盐。对于
非末端的（1→3）-键或C-2和C-4有分枝的，则不受过碘酸
盐影响。因此多糖氧化后定量测定过碘酸盐的消耗、甲酸的
生成和剩余糖的比例，就可确定多糖中各种单糖的键型及其
法的显著优点是不破坏样品。
3·4生物分析方法
•3·4·1 酶学法
•
酶学法主要是利用特异性糖苷酶对多糖分子
进行酶切，可用于确定多糖的糖苷键类型，也可
用于分析糖苷连接方式。到现在为止，已分离得
到的糖苷酶有数十种。目前，最新酶学方法是试
剂陈列分析方法(R拟姗)，根据这一方法原理，把
酶学手段和仪器分析方法相结合，已经生产出新