真核表达系统
蛋白质表达系统介绍不同的蛋白质表达系统及其优缺点
蛋白质表达系统介绍不同的蛋白质表达系统及其优缺点蛋白质表达是生物学研究中一项重要的技术，它可以通过合成蛋白质来研究其结构和功能。
蛋白质表达系统是实现这一过程的关键工具，主要包括原核表达系统和真核表达系统两种。
本文将对这两种蛋白质表达系统进行介绍，并分析它们的优缺点。
一、原核表达系统原核表达系统是利用原核生物（如大肠杆菌）来表达外源蛋白质的系统。
该系统具有以下特点：1. 高表达水平：大肠杆菌是常用的原核表达宿主，具有高表达水平的优势。
通过利用原核细胞的强大蛋白质合成机器，可以获得高产量的外源蛋白质。
2. 易操作性：原核表达系统相对简单，操作步骤少，易于操作和控制。
不需要复杂的细胞培养条件，可以在常见培养基中进行表达。
3. 快速表达：从启动表达到获得蛋白质通常只需要数小时至数天，速度较快。
这使得原核表达系统在高通量表达和快速实验中具有优势。
然而，原核表达系统也存在一些缺点：1. 外源蛋白质折叠问题：由于原核细胞的机器无法正确折叠某些复杂蛋白质，这可能导致外源蛋白质的不正确折叠和失活。
2. 原核特异性翻译后修饰：原核细胞缺乏一些真核细胞所具有的翻译后修饰机制，这可能影响蛋白质的功能和稳定性。
3. 复杂蛋白质表达困难：对于复杂蛋白质（如膜蛋白），原核表达系统通常无法达到理想的表达水平和正确的折叠结构。
二、真核表达系统真核表达系统主要利用真核生物（如酵母、昆虫细胞和哺乳动物细胞）来表达外源蛋白质。
真核表达系统具有以下特点：1. 正确的折叠和修饰：真核细胞具有复杂的蛋白质折叠和修饰机制，能够产生正确折叠和修饰的蛋白质。
2. 适用于复杂蛋白质：真核表达系统适用于复杂蛋白质（如膜蛋白）的表达。
真核细胞提供了正确的环境和细胞器，能够较好地表达这类蛋白质。
3. 适用于大规模表达：真核细胞通常可以进行大规模培养和表达，适用于工业化生产。
然而，真核表达系统也存在一些缺点：1. 低表达水平：相对于原核表达系统，真核表达系统的表达水平较低，可能无法满足高产量蛋白质的需求。
重组蛋白真核表达系统构建流程
重组蛋白真核表达系统构建流程蛋白质是生物体内具有重要生物学功能的分子，它们由氨基酸组成，对细胞的结构和功能起着重要的调控作用。
在生物科学研究和生物制药工业中，重组蛋白质的生产和表达是一个重要的研究领域。
真核系统是重组蛋白质表达的一个重要平台，它具有许多优点，如能够实现复杂的蛋白修饰和折叠等。
因此，构建真核表达系统是生物科学研究和生物工程应用中的一个重要课题。
一、选取重组蛋白质的编码序列在构建真核表达系统之前，首先需要选取重组蛋白质的编码序列。
这一步骤通常是通过将目标蛋白质的编码基因进行克隆和序列分析来完成的。
在进行基因克隆过程中，需要选择适当的限制性内切酶和载体，构建一个含有目标基因的重组质粒。
同时，对目标基因的序列进行分析可以帮助确定转录和翻译起始位点、信号肽序列、保守结构域等信息，这些信息对于真核细胞的表达和翻译过程具有重要意义。
二、选择适当的真核表达宿主真核表达系统可以选择多种宿主来进行表达，包括哺乳动物细胞、昆虫细胞、酵母等。
在选择表达宿主时，需要考虑到宿主细胞的生长特性、表达能力、蛋白修饰能力等因素。
不同的宿主对于重组蛋白质的表达和折叠能力有所差异，因此需要根据目标蛋白质的性质和需求来选择合适的宿主。
通常来说，哺乳动物细胞系统是真核表达系统中最常用的宿主之一，它具有较高的蛋白修饰和折叠能力，适合用于表达复杂的蛋白质。
三、构建真核表达载体在选择了合适的宿主后，需要构建一个含有目标基因的真核表达载体。
真核表达载体通常包括启动子、转录终止子、筛选标记基因等功能元件。
通过将目标基因插入到表达载体中，可以实现对目标基因的调控和表达。
同时，表达载体还可以包括一些辅助元件，如信号肽、翻译起始位点、融合标签等，以提高重组蛋白质的表达水平和纯度。
四、转染或转化真核细胞在构建了真核表达载体后，需要将其转染或转化到真核细胞中。
转染是指将外源DNA通过化学方法导入到细胞内，而转化则是通过质粒介导的方式将外源DNA导入到细胞内。
分子生物学真核生物表达系统ppt课件
1
第一节 概述
在进行人的特定基因表达时，真核 细胞表达系统是首要的选择，尤其 是对于功能性膜蛋白、需要翻译后 修饰蛋白、分泌型蛋白和多蛋白复 合体中的蛋白组分等，这些蛋白质
往往只能在真核细胞表达系统中才 能获得有活性的表达产物。其原因
有：
12.02.2020
2
1、真核蛋白在原核宿主中不稳定
2、通过突变研究基因表达产物功能区 及关键位点
3、制备过量表达产物用于结构分析
12.02.2020
5
外源基因导入真核细胞的基本方法
病毒感染 化学法 转染
物理法
DEAE葡聚糖法 磷Байду номын сангаас钙共沉淀法 脂质体介导法 醋酸锂法 电穿孔法
显微注射法
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6
三、外源基因在真核细胞中表达的主 要方式
18
哺乳动物细胞表达载体中常用的多腺苷酸化区
Poly A区
BGH SV40 late
TK SV40 early Hep B
来
源
牛生长激素 猿猴病毒40晚期基因 单纯疱疹病毒腺激酶 猿猴病毒40早期基因
乙肝表面抗原
效率
3 2 1.5 1 1
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（3）选择标记
1)药物选择标记基因
a、APH或neor基因：新霉素、庆大霉
素及卡那霉素的结构类似物氨基糖苷G418可以干扰真核细胞核糖体的功能而 阻止蛋白质的合成。APH或neor基因编 码氨基糖苷磷酸转移酶，使G-418灭活。
转染细胞由于表达氨基糖苷磷酸转移酶， 因此可以在含G-418的培养基中生长。
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20
b、ADA基因：ADA基因编码腺苷酸 脱氨酶，Xyl-A经磷酸化转化为XylATP并结合到核酸分子中而导致细胞 死亡。ADA可以使之转变为肌苷衍生 物而解毒。
真核细胞表达系统(干货分享)
真核细胞表达系统自上世纪70年代基因工程技术诞生以来，基因表达技术已渗透到生命科学研究的各个领域。
并随着人类基因组计划实施的进行，在技术方法上得到了很大发展，时至今日已取得令人瞩目的成就。
随着人类基因组计划的完成，越来越多的基因被发现,其中多数基因功能不明。
利用表达系统在哺乳动物细胞内表达目的基因是研究基因功能及其相互作用的重要手段.在各种表达系统中，最早被采用进行研究的是原核表达系统,这也是目前掌握最为成熟的表达系统。
该项技术的主要方法是将已克隆入目的基因DNA片段的载体（一般为质粒)转化细菌（通常选用的是大肠杆菌）,通过IPTG诱导并最终纯化获得所需的目的蛋白.其优点在于能够在较短时间内获得基因表达产物,而且所需的成本相对比较低廉.但与此同时原核表达系统还存在许多难以克服的缺点:如通常使用的表达系统无法对表达时间及表达水平进行调控，有些基因的持续表达可能会对宿主细胞产生毒害作用，过量表达可能导致非生理反应，目的蛋白常以包涵体形式表达，导致产物纯化困难；而且原核表达系统翻译后加工修饰体系不完善，表达产物的生物活性较低。
为克服上述不足，许多学者将原核基因调控系统引入真核基因调控领域,其优点是:①根据原核生物蛋白与靶DＮＡ间作用的高度特异性设计，而靶DNA与真核基因调控序列基本无同源性,故不存在基因的非特异性激活或抑制；...文档交流仅供参考...②能诱导基因高效表达,可达105倍，为其他系统所不及；③能严格调控基因表达，即不仅可控制基因表达的“开关"，还可人为地调控基因表达量。
因此，利用真核表达系统来表达目的蛋白越来越受到重视。
目前,基因工程研究中常用的真核表达系统有酵母表达系统、昆虫细胞表达系统和哺乳动物细胞表达系统....文档交流仅供参考...1、酵母表达系统最早应用于基因工程的酵母是酿酒酵母,后来人们又相继开发了裂殖酵母、克鲁维酸酵母、甲醇酵母等，其中，甲醇酵母表达系统是目前应用最广泛的酵母表达系统。
真核细胞表达系统 (自动保存的)
4000字。
技术方法类（包括分析方法类）释文提纲：（1）定义及概述（不设标题）（2）技术或方法原理（及发展历史）（3）应用及注意事项意见：基本符合百科全书的要求。
真核细胞表达系统（Eukaryotic expression system）运用基因工程技术手段，在体外将外源基因分子插入病毒、质粒等载体分子，形成新的遗传物质组合，并导入真核细胞中实现外源基因蛋白表达的技术系统。
按照宿主细胞类型，真核细胞表达系统包括酵母表达系统、丝状真菌表达系统、昆虫细胞表达系统和哺乳动物细胞表达系统。
真核细胞表达系统是重组蛋白表达的有利工具，在基础科学及医药领域发挥了重要作用。
技术或方法原理（及发展历史）酵母表达系统酵母是低等的单细胞真核模式生物，已完成基因组测序，遗传背景清晰，具有生长繁殖快，成本低，易于实现高密度培养和大规模发酵的优点。
目前发展成熟的酵母表达系统主要包括酿酒酵母表达系统和毕赤酵母表达系统。
酿酒酵母在食品工业领域的使用已有数千年历史，被美国FDA确认为安全性生物。
1981年，Hitzeman等将成功将人干扰素基因导入酿酒酵母细胞，揭开了酿酒酵母表达系统的研究和应用历史，迄今已有多种外源蛋白在酿酒酵母中获得表达。
然而酿酒酵母表达系统存在缺乏强启动子，质粒易丢失，分泌效率低，且富含高甘露糖型超糖基化等不足，导致表达产物存在过度糖基化的局限性，而逐渐被巴斯德毕赤酵母等甲醇营养型酵母表达系统所取代。
巴斯德毕赤酵母来源于野生型石油酵母NRRL-Y11430，为子囊菌类单倍体酵母，富含甲醇代谢必须的醇氧化酶、过氧化氢酶、二羟丙酮合成酶的过氧化物酶系，能在以甲醇为唯一碳源的简单培养基上快速生长，属于甲醇营养型酵母的一种。
基因工程常用的毕赤酵母菌株主要包括GS115（Mut+His—）、X-33（Mut+His+）、KM71（Muts His—）、SMD1168（his4 pep4）等。
目前毕赤酵母表达系统的启动子有醇氧化酶AOX1启动子(Ellis et al., 1985)及三磷酸甘油醛脱氢酶GAP启动子，外源基因通过同源重组整合到酵母染色体基因组上,外源蛋白表达水平受甲醇或葡萄糖的严格调控。
生物制药技术中的表达系统研究
生物制药技术中的表达系统研究生物制药技术一直是医药行业的热门领域，在制药过程中，表达系统的研究是非常重要的一部分。
表达系统是生物制药技术中利用细胞合成目标蛋白的关键工具。
目前，表达系统主要被用于制造重要的药物和生物制剂。
1. 表达系统的概念和分类表达系统是通过改变细胞或微生物的基因，使其能够合成一个目标蛋白质的过程。
表达系统主要有两大类：原核表达系统和真核表达系统。
前者是指以细菌、酵母菌、噬菌体等微生物作为表达的载体的表达系统，后者是指以哺乳动物、昆虫、真菌等真核细胞作为表达载体的表达系统。
其中，细菌表达系统应用最为广泛。
2. 细菌表达系统的研究现状目前，大肠杆菌是最常用的细菌表达系统。
因为其简单易操作、高效、低成本、质量稳定等显著优势。
大肠杆菌表达系统的原理主要是：将细胞质中的基因组 DNA 转化为 RNA，然后将 mRNA翻译成蛋白质。
研究表明，大肠杆菌表达系统可以实现许多不同的表达目的，如疫苗生产、技术嵌入、工业酶生产等。
此外，大肠杆菌表达系统在改进和增强中也有很大的发展空间。
目前，研究人员正在进行大肠杆菌表达系统的优化，以提高表达效率并改善产品质量。
例如尝试提高细胞中目标蛋白质的产量，新的表达载体的设计和改进等。
3. 真核表达系统的研究进展在真核表达系统中，以哺乳动物作为载体的表达系统应用最为广泛。
目前，最常用的哺乳动物表达系统是CHO细胞。
CHO细胞是一类美国老鼠卵巢细胞，其表达性能优越，具有较高的表达效率和高质量的表达产物。
除此之外，人类胚胎肾细胞（HEK）是另一种被广泛应用的真核表达载体。
这种类型的表达系统能够产生大量的蛋白质，并且可快速扩展，更加适合于大规模的制剂生产。
总的来说，生物制药技术中的表达系统的研究对于医疗行业的发展起着非常重要的作用。
通过对表达系统的研究，我们能够使得生产更加高效、快速、有效。
另外，还可以提高医药制品的质量和稳定性，为医疗卫生行业提供更高质量的药品和治疗方案。
真核生物表达系统汇总
2020年8月10日星期一
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哺乳动物细胞表达载体中常用的多腺苷酸化区
Poly A区
BGH SV40 late
TK SV40 early Hep B
来
源
牛生长激素 猿猴病毒40晚期基因 单纯疱疹病毒腺激酶 猿猴病毒40早期基因
乙肝表面抗原
效率
3 2 1.5 1 1
2020年8月10日星期一
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（3）选择标记
18
b、ADA基因：ADA基因编码腺苷酸 脱氨酶，Xyl-A经磷酸化转化为XylATP并结合到核酸分子中而导致细胞 死亡。ADA可以使之转变为肌苷衍生 物而解毒。
c、博来霉素抗性基因：
d、HPH基因：该基因编码潮霉素B磷 酸转移酶
1、瞬时表达：转染的DNA未与宿主 染色体整合，不能随宿主基因组的复 制而扩增，只能在细胞内维持2~3天 2、稳定表达：转染的DNA与宿主染 色体整合，能随宿主基因组的复制转 录和翻译，并被稳定遗传。
2020年8月10日星期一
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五、外源基因在真核细胞中表达产物 的鉴定和纯化
mRNA的鉴定
蛋白产物鉴定
1)药物选择标记基因
a、APH或neor基因：新霉素、庆大霉
素及卡那霉素的结构类似物氨基糖苷G418可以干扰真核细胞核糖体的功能而 阻止蛋白质的合成。APH或neor基因编 码氨基糖苷磷酸转移酶，使G-418灭活。
转染细胞由于表达氨基糖苷磷酸转移酶， 因此可以在含G-418的培养基中生长。
2020年8月10日星期一
2020年8月10日星期一
1
第一节 概述
在进行人的特定基因表达时，真核 细胞表达系统是首要的选择，尤其 是对于功能性膜蛋白、需要翻译后 修饰蛋白、分泌型蛋白和多蛋白复 合体中的蛋白组分等，这些蛋白质
真核表达系统
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真核表达载体
➢质粒：真核表达元件、真核抗性 ➢病毒载体：改建后
➢ SV40病毒 ➢ 腺病毒 ➢ 反转录病毒 ➢ 痘苗病毒
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病毒基因组的结构特点
➢ 病毒基因组大小相差较大,与细菌或真核细胞相比，病毒 的基因组很小
➢ 病毒基因组可以由DNA组成，也可以由RNA组成
TATA box TATAAAA
TBP 30,000 ~ 10bp
GC box GGGCGG
SP-1 105,000 ~ 20bp
CAAT box GGCCAATCT CTF/NF1 60,000 ~ 22bp
Octamer ATTTGCAT
Oct-1 76,000 ~ 20bp
Oct-2 53,000 ~ 23bp
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启动子
➢ 真核启动子：RNA聚合酶（Ⅱ）结合并起动转录的 DNA序列
➢ 一般包括转录起始点及其上游约100-200bp序列，包 含有若干具有独立功能的DNA序列元件，每个元件 约长7-30bp
➢ 核心启动子元件：RNA聚合酶起始转录所必需的最 小DNA序列，包括转录起始点及其上游-25/-30bp处 的TATA盒。单独起作用时只能确定转录起始位点和 产生基础水平的转录
➢ 与其序列的正反方向无关
➢ 要有启动子才能发挥作用。但增强子对启动子没 有严格的专一性，同一增强子可以影响不同类型 启动子的转录
➢ 增强子的作用机理虽然还不明确，但与其他顺式 调控元件一样，必须与特定的蛋白质因子结合后 才能发挥增强转录的作用
➢ 增强子一般具有组织或细胞特异性，许多增强子 只在某些细胞或组织中表现活性，是由这些细胞 或组织中具有特异性蛋白质因子所决定的
真核细胞表达系统
真核细胞表达系统常用的真核表达系统有酵母、杆状病毒／昆虫细胞和哺乳动物细胞表达系统。
简而言之，酵母和昆虫细胞表达系统蛋白表达水平高，生产成本低，但加工修饰体系与哺乳动物细胞不完全相同；哺乳动物细胞产生的蛋白质更接近于天然蛋白质，但其表达量低、操作烦琐。
1.酵母表达系统最早应用于蛋白表达的酵母是酿酒酵母，后来相继出现其他种类酵母，其中甲醇酵母表达系统应用最广泛。
甲醇酵母的表达载体含有大肠杆菌复制起点和筛选标志，可在大肠杆菌大量扩增。
甲醇酵母表达载体中含有与酵母染色体中同源的序列，容易整合入酵母染色体中。
大部分甲醇酵母的表达载体中都含有醇氧化酶基因-1(AOX1)，在强启动子作用下，以甲醇为唯一碳源的条件下诱导外源基因表达。
甲醇酵母表达蛋白一般需很长时问才能达到峰值水平，实验操作过程中有甲醇毒性和一定安全风险。
2.昆虫细胞表达系统杆状病毒载体广泛应用于培养的昆虫细胞中指导外源基因的表达，其中大多含有苜蓿银纹夜蛾核多角体病毒(AcNPV)中的多角体启动子。
杆状病毒系统蛋白表达量很高，而且大部分蛋白质能保持可溶性。
杆状病毒基因组较大(130kb)，可容纳大的外源DNA片段；杆状病毒启动子在哺乳动物细胞中没有活性，安全性较高。
目前常用的是以位点特异性转位至大肠杆菌中增殖的杆状病毒穿梭载体，能快速有效地产生重组杆状病毒。
与通过外源基因重组在昆虫细胞中产生杆状病毒重组体相比，大大简化了操作步骤，缩短了鉴定重组病毒的时间，适于表达蛋白突变体以进行结构或功能的研究。
3.哺乳动物细胞表达系统哺乳动物细胞能够指导蛋白质的正确折叠，它所表达的真核蛋白通常能被正确修饰，在分子结构、理化特性和生物学功能方面最接近于天然的高等生物蛋白质，几乎都能在细胞内准确定位，在医学研究中得到广泛应用。
虽然哺乳动物细胞表达比大肠杆菌表达难度大，更耗时，成本更高，但是对于熟悉细胞培养的研究人员表达小到中等量的蛋白非常实用。
哺乳动物细胞表达载体包含原核序列、启动子、增强子、选择标记基因、终止子和多聚核苷酸信号等。
真核表达系统与原核表达系统比较
系统又分为毕赤酵母表达和酿酒酵母表达。针对真核表达系统来说，哺乳动物细胞和酵母表达较为常用。
针对其各自的优缺点，如下：
真核系统和原核系统各自优缺点：
表达系统
系统优缺点
系统蛋白表达方式 优点
缺点
表达的蛋白活性高， 瞬时转染
能够快速灵活的制 蛋白表达量低，大
能够表达多复杂修饰
备活性蛋白
量生产成本极高
哺乳动
的蛋白；
稳定细胞系构建 筛选出的细胞株能 细胞株筛选困难且
真 核 表 达 物细胞
需要细胞房，无菌，
够实验蛋白的大量 时间长，投入大
系统
成本投入高
生产
重组抗体表达
比普通单抗生产量 需筛选细胞株，需
有保证
耗时耗力
酵母表
与哺乳动物相比只能 毕赤酵母表达
甲醇诱导操作方面 需要时间
达系统
表达简单修饰的蛋白 酿酒酵母表达
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Tel: (025) 5889- 4959
Order@
不常用Biblioteka 不常用昆虫表不常用
达系统
原 核 蛋 白 大 肠 杆 菌 操作简单。表达量高；
表达系统 表达
易形成包涵体，蛋白活性物保证
Tel: (025) 5889- 4959
Order@
枯 草 芽 孢 不常用
杆菌表达
链霉菌
不常用
活性蛋白整体方案
Active Protein Solutions
活性蛋白整体方案
Active Protein Solutions
真核表达系统 多顺反子
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真核表达系统多顺反子咱都知道，真核表达系统就像一个超级复杂又超级神奇的大工厂。
而多顺反子呢，就像是这个大工厂里一种很特别的生产模式。
真核细胞的表达系统有很多独特之处。
它不像原核细胞那么简单直接。
真核细胞里，基因的表达调控那可是相当复杂的。
多顺反子这个概念啊，就涉及到多个基因在同一个转录本上的情况。
这就好比在一条生产线上，同时生产好几种不同但又有关联的产品。
多顺反子在真核表达系统里的存在形式也是多种多样的。
有时候，这些基因之间相互协作，共同完成一个大的生物功能。
比如说，在某些细胞分化的过程中，多个基因需要同时被调控来促使细胞朝着特定的方向分化，多顺反子就可能在这个时候发挥作用。
从分子层面来看，多顺反子相关的转录后调控也很有趣。
像mRNA的剪接、修饰等过程，都会影响多顺反子最终表达出的蛋白质的种类和功能。
就好像在产品生产出来之后，还需要经过一系列的加工和包装，才能成为合格的商品。
而且啊，真核表达系统里的多顺反子还和疾病有着千丝万缕的联系。
有些疾病的发生就是因为多顺反子的表达出现了问题。
比如说，某些癌症可能是因为控制细胞增殖相关的多顺反子基因表达失调了，细胞就开始不受控制地疯狂生长。
在研究真核表达系统多顺反子的时候，科学家们也用到了很多超级厉害的技术。
像基因编辑技术，就可以用来改变多顺反子中的基因，然后观察对细胞功能的影响。
还有各种先进的测序技术，可以帮助我们更清楚地了解多顺反子的结构和组成。
真核表达系统中的多顺反子就像一个充满神秘色彩的宝藏，还有很多秘密等着我们去探索呢。
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真核基因表达系统
h
3
一、真核基因组的复杂性
1. 真核基因组巨大
Ø 大肠杆菌基因组约4×106bp，哺乳类基因组在109bp数量 级
Ø 大肠杆菌约有4000个基因，人则约有10万个基因
2. 真核生物遗传信息复杂
Ø 原核生物的基因组基本上是单倍体，而真核基因组是二倍 体
Ø 真核生物主要的遗传物质与组蛋白等构成染色质，被包裹 在核膜内，核外还有遗传成分(如线粒体DNA等)，这就增加 了基因表达调控的层次和复杂性。
结合的蛋白因子 名称 分子量 结合DNA长度 TBP 30,000 ~ 10bp SP-1 105,000 ~ 20bp CTF/NF1 60,000 ~ 22bp Oct-1 76,000 ~ 20bp Oct-2 53,000 ~ 23bp NFkB 44,000 ~ 10bp AFT ? 20bp
酵母表达系统(yeast expression system) 哺乳动物细胞表达系统(mammalian cell expression) 昆虫细胞表达系统(insect cell expression )
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2
第一节 概述
一、真核基因组的复杂性 二、原核表达系统的局限性 三、真核表达系统的必要性及优势
第八章 真核表达系统 Chapter 8 Eukaryotic expression system
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1
内容
概述( introduction )
真核基因结构及表达调控特点( Features of eukaryotic gene structure and regulation)
真核表达系统(eukaryotic gene expression system)
酵母着丝粒区段(CEN)：增加转化子稳定性
生物制药技术中的真核细胞表达系统介绍
生物制药技术中的真核细胞表达系统介绍真核细胞是一类具有细胞核的生物细胞，可以分为植物细胞和动物细胞。
在生物制药技术中，真核细胞表达系统被广泛应用于生产重组蛋白和制造药物。
真核细胞表达系统是指利用真核细胞作为宿主细胞的技术平台，通过转染或转化等方式将外源基因导入真核细胞，使其在真核细胞内表达特定的目标蛋白。
这种技术具有许多优势，包括蛋白质修饰、折叠和活性组装等方面的能力，能够确保生产的蛋白质具有更高的完整性和生物活性。
在真核细胞表达系统中，植物细胞和动物细胞被广泛用于生产不同类型的蛋白质药物。
植物细胞表达系统具有成本低、易于大规模培养和改造灵活等优势。
植物细胞能够进行正确的蛋白质修饰，如糖基化、磷酸化和亚硫酸酯化等，同时它们不含病原微生物，减少了潜在的传染风险。
相比之下，动物细胞表达系统则更适用于生产复杂蛋白质，如单克隆抗体和重组血液因子。
动物细胞能够进行更为复杂的蛋白质修饰，如甘露糖、胆固醇和酰基化等，从而更好地模拟人体内的蛋白质合成过程。
在真核细胞表达系统中，转染或转化是将外源基因导入宿主细胞的关键步骤。
转染是指将外源DNA通过化学物质或物理方法直接导入细胞，如利用电穿孔技术、离子复合物、脂质体或聚乙烯亚胺等。
而转化则是指通过细菌质粒或病毒载体将外源基因导入宿主细胞。
转化技术包括病毒载体介导转化、细菌质粒介导转化和转座子系统介导转化等。
一旦外源基因成功导入宿主细胞，其表达需要依赖于启动子、增强子、转录因子和调控序列等元件。
一般而言，真核细胞表达系统中最常用的启动子是多聚腺苷酸酸（polyadenylation signal）和转录因子结合位点（transcription factor binding sites）。
增强子（enhancer）可以增强启动子的活性，从而提高外源基因的表达水平。
除了基因导入和表达的技术要求，真核细胞表达系统还需要注重生物反应器的选择和细胞培养条件的优化。
对于植物细胞表达系统，传统的反应器选择包括大型容器培养（如发酵罐）和搅拌型生物反应器。
克隆表达-真核表达系统-2002
真核基因表达系统
一、概述 （一）原核表达系统的缺点 1、没有转录后加工系统，不能识别、 剪除内含子 2、缺乏翻译后加工系统，不能对翻译 的蛋白质进一步修饰加工
（二）真核表达系统的必要性及优势
1. 具转录后加工系统
2. 具翻译后修饰系统 3. 可实现真正的分泌表达
4.基因治疗
二、真核基因结构及表达调控特点
YAC:利用酵母的TEL、ARS及CEN构建的人工 染色体
结构：左臂：TEL、选择标记、ARS 、CEN、 右臂：TEL、选择标记
特点：容量大（50-1000kb），减少克隆数
稳定性差，不易分析
（二）受体细胞
1、啤酒酵母：较早使用，了解清楚
表达量较低
过量糖基化
转化子不稳定
2、毕赤酵母：新发展的酵母受体细胞
转录水平调控
• 顺式调控因子(cis-acting factor)：结构基因 周围能与特异转录因子结合而影响转录的 DNA序列，主要包括启动子、增强子、沉寂 子
• 反式作用因子(trans-acting factor):由位于不 同或相同染色体上相距较远的基因所编码的 蛋白质因子，通过与顺式调控元件和RNA 聚合酶的相互作用而调节基因转录活性。
• 酵母着丝粒区段 (cEN) ：增加转化子稳定 性
3、类型
• 酵母克隆载体：YIP、YRP、YEP
• 酵母表达载体：含酵母启动子 • YAC
酵母克隆载体的构建
酵母表达载体
含酵母启动子 穿梭载体(shuttle
vector)： 既可以携 带外源基因在原核细胞中复制，又 可以使其在真核细胞中表达的载体。 种类：啤酒酵母表达载体 毕赤酵母表达载体
（四）重组载体导入细胞的方法---转染
真核基因表达系统培训讲解
转录终止
转录终止是转录过程的结 束，需要RNA聚合酶识别 终止ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ并停止转录。
转录后水平调控
剪接
剪接是真核生物mRNA前体的加 工过程，通过去除内含子并连接
外显子，形成成熟的mRNA。
编辑
编辑是指对已转录的mRNA进行碱 基的插入、删除或替换，以改变其 序列的过程。
修饰
mRNA的修饰包括甲基化、磷酸化 等，这些修饰可以影响mRNA的稳 定性、翻译效率和蛋白质的活性。
新型载体和表达元件
探索新型的基因表达载体和元件，以提高基因表达的效率和特异性。
细胞和组织特异性表达
研究如何在特定细胞和组织中实现基因的特异性表达，以减少副作 用和提高治疗效果。
应用领域的拓展
生物制药
利用真核基因表达系统生产高产 量、高质量的药物蛋白，满足临
床需求。
生物能源
通过真核基因表达系统优化生物 燃料的生产过程，提高产量和降
内含子的剪接过程需要依赖于剪接体和RNA聚合酶等蛋白质因子来完成。
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真核基因表达系统的调控机 制
转录水平调控
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转录起始
真核生物基因表达起始的 关键步骤，需要RNA聚合 酶识别启动子并开始转录。
转录因子
转录因子是能够结合DNA 并调控基因转录的蛋白质， 它们可以激活或抑制基因 的表达。
转染是将克隆构建好的表达载体导入真核细胞的过程，常用的方法包括磷酸钙沉淀法、电穿 孔法、病毒转染法等。
筛选是通过一定的方法从众多的细胞中找出成功转染的细胞，常用的方法包括抗生素筛选、 荧光筛选等。
转染与筛选的注意事项包括选择适当的细胞系、优化转染条件、保证细胞活力和安全性等。
常规真核表达与鉴定
4、再以1mL PBS洗涤离心细胞沉淀，在管口沿壁加入，吹起 沉淀；离心：4℃、12000r/m、2min；弃上清。
5、每个离心管加入100uL细胞裂解液(RIPA)，吹打混匀，冰 上作用30min裂解细胞。
6、离心4℃ 12000r/m、5min；吸取上清约30uL；煮样，加 上样loading buffer，蛋白电泳。
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二、常用真核表达系统
1、毕赤酵母表达体系：酵母细胞表达系统蛋白表达水平高， 生产成本低，但纯化难度大。
2、慢病毒表达系统：商品化的慢病毒表达系统（如Lenti-X） 在病毒包装时获得VSV-G泛嗜性重组慢病毒，通过膜质偶联 和膜质融合的方式感染靶细胞，可感染几乎所有类型的哺 乳动物细胞。
3、哺乳动物细胞表达体系：对蛋白的加工与修饰与酵母及昆 虫表达系统完全不同，可通过脂质体等直接将外源表达质 粒导入哺乳动物细胞，进行表达。哺乳动物细胞产生的蛋 白质更接近于天然蛋白，但其表达量低。
3、某些特殊的表达载体：如反向遗传表达载体，昆虫表达 系统载体等。
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四、哺乳动物细胞转染
1、引物设计：构建重组真核表达质粒，一般在引物设计时 首先会在引物中引物一些能够促进蛋白表达（如Kozak序 列）或者便于后期检测的序列或标签（如flag、HA、His 等），注意这些序列在引物中的位置。
2、实验材料：真核表达细胞系、DMEM、FBS、OPTI-MEM、 PBS、trypsin、携带有外源基因的重组质粒（去细胞内毒 素法抽提）、转染试剂（或仪器）、细胞计数器、盖玻片、 六孔板等。
3、转染细胞密度约2～5×106/mL,一般在细胞铺板后12～18h 内进行转染，转染的质粒要测定浓度，按2ug/孔进行。
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细胞转染步骤
基因工程课件14 真核表达系统
单交换整合
双交换整合：置换，稳定性强
a.基因取代或基因删除 b.稳定型表达元件的整合
二、酵母表达系统
附加体型载体
大肠杆菌质粒，2μm质粒，酵母染色体选择标记基 因构成。
2μm 提供复制起始点和STB，使载体更稳定
拷贝数高
用于外源基因的表达
二、酵母表达系统
可以通过哪些方法增加质粒载体在酵母宿主细 胞中的稳定性，各有什么特征？
GGU (Gly/G)甘氨酸 GGC (Gly/G）甘氨酸 GGA (Gly/G）甘氨酸 GGG (Gly/G）甘氨酸
二、酵母表达系统
自主复制型质粒载体
定义：在E.coli质粒载体的基础上构建而来 复制方式：酵母基因组复制起始区,大肠杆菌质粒复制起始序列 筛选标记： E.coli +酵母 克隆位点来自E.coli质粒 转化率高、拷贝数高、不稳定
二、酵母表达系统
酵母人工染色体
ARS：酵母染色体自主 复制序列
TEL：端粒序列 CEN：着丝粒 选择标记基因
适合真核基因组的克隆与表达 研究
酵母表达系统
酿酒酵母， 1981 年 Hitzeman 等用酿酒酵母成功地
表达了人干扰素，但该系统具有一定的局限性， 缺乏强有力的启动子，分泌效率差，质粒不稳定 等。因此，人们在此基础上又寻找了新的酵母表 达系统——毕赤酵母，即甲醇营养型表达系统。
真核选择标记基因
cycloheximide 放线菌酮：由产生放线菌酮的放线 菌发酵液中提得的一种抗生素 ,cycloheximide 机理 是真核细胞蛋白合成抑制剂,毒性很强，现在已很 少用。
重组蛋白真核表达系统构建流程
重组蛋白真核表达系统构建流程蛋白是构成生物体的重要组成部分，它不仅可以促进生物体的生长发育，还可以在细胞内发挥许多重要的生物学功能。
在真核生物表达系统中，重组蛋白的构建是一个非常重要的过程，本文将详细介绍重组蛋白真核表达系统构建流程。
一、确定重组蛋白的基因序列首先，确定所需重组蛋白的基因序列是构建真核表达系统的第一步。
通过基因测序技术，可以获取到目标重组蛋白的完整基因序列，以便后续的克隆和表达。
二、构建重组蛋白的表达载体获得目标基因序列后，需要将其插入到表达载体中。
表达载体是一个能够将外源基因转录、翻译并表达出其编码蛋白的DNA分子。
常用的真核表达载体包括质粒、病毒载体等。
将目标基因插入到表达载体中需要利用特定的限制酶切割和连接技术，构建出完整的重组蛋白表达载体。
三、转染真核细胞构建好重组蛋白表达载体后，接下来需要将其导入真核细胞内。
转染是一种将外源DNA导入真核细胞内的技术，可以通过多种方法实现，包括化学法、电穿孔法、基因枪法等。
四、筛选稳定细胞株转染后，需要通过种种条件筛选出稳定地表达重组蛋白的真核细胞株。
常用的筛选方法包括使用抗生素筛选、免疫筛选等，确保细胞株中的全部细胞都含有目标基因并且能够稳定表达。
五、纯化重组蛋白得到稳定的真核细胞株后，就可以通过细胞培养并进行蛋白纯化工作了。
蛋白纯化是获得高纯度重组蛋白的关键步骤，可以通过一系列的分离技术，如离心、层析、电泳等方法，得到高纯度的重组蛋白。
六、功能性鉴定获得纯化的重组蛋白后，需要进行功能性鉴定以验证其生物学功能。
功能性鉴定通常包括活性测定、结构分析等，确保重组蛋白具有预期的生物学活性。
七、应用领域重组蛋白真核表达系统构建完成后，得到的重组蛋白可以应用于许多领域，包括生物医药、农业生产、工业生产等。
在生物医药领域，重组蛋白可以用于药物研发和生物治疗；在农业生产领域，重组蛋白可以用于改良作物、生物杀虫剂等；在工业生产领域，重组蛋白可以用于工业酶、生物燃料等生产。
真核表达系统
真核表达系统原核表达系统因其工艺简单、速度快而为人类带来许多便利，eg制药业由原先的脏器提取→发酵制备(IFN)，降低了本钱，扩大了来源，也缩短了生产周期。
可是由于原核细胞中没有转录后加工系统，不能识别、剪除内含子，因此很多真核基因就无法在原核细胞中表达；另外，原核细胞缺乏翻译后加工系统，不能对翻译的蛋白质进一步修饰加工。
因此许多糖蛋白在原核细胞中表达后，尽管一样形成蛋白质具有抗原性，却因为不能糖基化，而不产生功能。
例如，C1INH是一种高度糖基化的单链蛋白(49%分子量为糖基)，因其不可逆结合C1q而阻断补体活化途径，是一种极好的补体抑制剂，若是C1INH缺点可致使遗传性血管神经性水肿(HANE)，表现为全身水肿，尤其是喉头水肿，能够输血，以正常人血中的C1INH来补充医治，但长期输血价钱高，易引发副反映，故可用基因工程产品来医治HANE，但因C1INH为高度糖基化蛋白，在中表达没有活性，现已有人利用CHO表达C1INH，拟用于医治。
一、优势1.具转录后加工系统；2.具翻译后修饰系统；3.可实现真正的分泌表达，分泌至细胞外简化了纯化工艺。
二、真核基因结构及表达调控特点：(一)、基因结构特点：1.DNA极为丰硕，具全能性——mRNA丰度(选材)克隆真核基因的经常使用方式是提取细胞mRNA，反转录合成为cDNA。
尽管真核生物各类细胞中基因含量、种类相同，但却不是选择任一细胞提取其mRNA就可反转录合成出目的基因cDNA,因不同细胞间存在mRNA的丰度问题，基因在不同细胞中转录情形不一样，产生不同的功能蛋白，才表现出各类细胞的丰硕多样性。
故应选择mRNA丰度高的细胞为材料，eg. TNFα基因的克隆是以前髓细胞或早幼粒细胞为材料来源(Alice,1985)。
2.结构复杂，DNA与组蛋白结合，并在其外有核膜——真核生物转录、翻译不可能持续进行。
3.不持续性：内含子、外显子。
内含子可能参与基因调控，不同剪切方式产生不同蛋白质。
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充足的营养和氧源，加抗氧化剂，抗细胞凋亡基因
4. 提高表达蛋白糖基化水平
Thank You
可以保证质粒载体平均肥培到子细胞，稳定性强 拷贝数低
二、酵母表达系统
酵母人工染色体
染色体自主复制序列 着丝粒 端粒
装载片段大 稳定性差
二、酵母表达系统
在酵母中高效表达外源基因的策略
选择合适的受体细胞 提高表达载体在细胞中的拷贝数 选择强启动子 提高翻译产物的稳定性
外源基因的原核表达系统
生物与食品工程学院
外源基因的原核表达系统
一、真核细胞表达体系的特点
二、酵母表达系统
三、昆虫表达系统
四、哺乳动物细胞表达系统
一、真核细胞表达体系的特点
优点： 1. 具有翻译后加工修饰系统
二硫键、糖基化、磷酸化、
2. 可以识别内含子
3. 蛋白质折叠
氨基酸序列
哺乳动物细胞基因表达系统元件
1. 启动子
由核心启动子和上游启动子组成
2. 终止信号和 poly ( A ) 3. 剪切信号 4. 选择标记基因
四、哺乳动物细胞表达系统
提高哺乳动物基因表达效率的措施
1. 改进表达载体
启动子
2. 宿主细胞的特性 3. 抑制细胞凋亡，延长细胞周期
具有三级结构的蛋白质
一、真核细胞表达体系的特点
缺点：
1. 外源基因导入效率偏低
2. 无法有效控制外源基因整合位置和拷贝数
3. 可用的筛选标记基因少
二、酵母表达系统
自主复制型质粒载体
以cccDNA（供价、闭合、环状）的形式存在 含有酵母基因组复制起始区 含有大肠杆菌自主复制基因
三、昆虫表达系统
昆虫表达体系的特点
允许插入较大的外源基因 能有效地进行翻译后加工 昆虫病毒具有严格的细胞专一型，安全
三、昆虫表达系统
三、昆虫表达系统
三、昆虫表达系统
四、哺乳动物细胞表达系统
哺乳动物细胞基因表达类型
1. 包含原核复制子的质粒型载体
不能在哺乳动物细胞中复制，需要整合到染色体
转化率高 拷贝数高 不能均匀分配到子代细胞
二、酵母表达系统
整合型质粒载体
通过同源重组整合到酵母染色体，并随染色体一起 复制
不含有复制起始区 含有整合介导区
转化子稳定 拷贝数低
二、酵母表达系统
着丝粒质粒载体
在自主复制型质粒载体上添加着丝粒 不含有复制起始区 含有整合介导区
2. 带真核病毒调控序列元件的质粒表达载体
能有效地调节外源基因在哺乳动物细胞中的表达
四、哺乳动物细胞表达系统
哺乳动物细胞基因表达系统元件
1. 启动子
由核心启动子和上游启动子组成
2. 终止信号和 poly ( A ) 3. 剪切信号 4. 选择标记基因
四、哺乳动物细胞表达系统