CpG-ODN的免疫刺激作用

CpG-ODN的免疫刺激作用 CpG-ODN的免疫刺激作用
陈军浩 南京大学医学院附属鼓楼医院
CPG概念 概念
为非甲基化的胞嘧啶鸟嘌呤二核苷酸重 复序列， 基序。 复序列，即CpG 基序。 一种免疫佐剂 作用靶点TLR9 作用靶点TLR9 细胞免疫，体液免疫 细胞免疫，
Th1免疫应答 免疫应答
慢性乙型肝炎患者细胞免疫低下 HBV免疫耐受， HBV免疫耐受，持续感染 免疫耐受 肿瘤微小残留病的清除
对照组
加CPG-ODN组 组
CpG提高 细胞表面MHC-Ⅰ、 提高B细胞表面 Ⅰ 提高 细胞表面 MHC-Ⅱ的表达 Ⅱ
2500 2000
MHC 表 达 量 （ MFI ）
*
*
*
*
1500 1000 500 0 CpG2006 221 200 221
Ⅰ *
Ⅱ
P<0.05
活化B细胞诱导 活化 细胞诱导CTL 细胞诱导
APC与T细胞作用机制 与 细胞作用机制
CPG对B细胞抗原递呈相关分子的 对 细胞抗原递呈相关分子的 作用研究
1.
CpG2006、2216由上海生物工程技 、 由上海生物工程技 术服务有限公司合成， 术服务有限公司合成，全硫代化修饰 对照组为含10%FCS的RPMI1640＋ 对照组为含 的 ＋ 外周血PBMC，细胞量107/孔，37℃、 外周血 ，细胞量 孔 ℃ 5%CO2、48小时 小时 实验组加入CpG2006或CpG2216， 或 实验组加入 ， 终浓度均为1umol/mL，余同上 终浓度均为 ，
80 70 60 50 40 30 20 10 0 IFN-γ IL-2 对照组 IL-4 CPG- ODN组 CPG- ODN 组 IL-10
*
*：与对照组比较，P<0.05
CPG诱导 诱导PBMC杀伤靶细胞 诱导 杀伤靶细胞
1. 2.
收集CPG活化的 活化的PBMC 收集 活化的 细胞毒性实验：效应细胞为 细胞毒性实验：效应细胞为CPG活化的 活化的 PBMC；靶细胞为 预染的K562细胞。 细胞。 ；靶细胞为CFSE预染的 预染的 细胞 对照组效应细胞为未经CPG活化的 活化的PBMC。 对照组效应细胞为未经 活化的 。 效：靶＝20：1，混合培养 。流式细胞术 ： ，混合培养2h。 检测靶细胞死亡率。 检测靶细胞死亡率。
CFSE染色靶细胞 染色靶细胞
实验结果
CpG活化PBMC对K562细胞的杀伤作用(N=5) 活化PBMC对 细胞的杀伤作用(N=5) 活化PBMC 细胞的杀伤作用
CPG活化PBMC 对照组
16.85±5.14 % 8.62±2.83 %
*
*：与对照组比较，P<0.05 ：与对照组比较，
CIK细胞杀伤靶细胞 细胞杀伤靶细胞
3.
CPG诱导 诱导PBMC杀伤靶细胞 诱导 杀伤靶细胞
CFSE染色靶细胞 染色靶细胞
1.
2. 3. 4. 5. 6.
浓度为5µmol/ L 的CFSE （2羧基荧 浓度为 羧基荧 光素二醋酸盐琥珀酰亚胺酯） 光素二醋酸盐琥珀酰亚胺酯）工作液 取对数生长期的靶细胞浓度108/ L 取对数生长期的靶细胞浓度 细胞悬液与等体积CFSE 工作液混合 细胞悬液与等体积 37 ℃孵育 孵育10 min。 。 离心洗涤两次后 悬浮细胞备用
CPG提高 提高PBMC中Th1细胞 提高 中 细胞
Th1占淋巴细胞百分比 Th1占淋巴细胞百分比
CPG提高 提高PBMC中Th1 、Tc1 提高 中 细胞百分率
16 14 12 10 8 6 4 2 0 Th1 Tc1 对照 Th2 CPG-ODN
* *
*：与对照组比较，P<0.05
CPG刺激 刺激BPMC分泌细胞因子 刺激 分泌细胞因子
结论
1. 2. 3. 4. 5. 6.
CpG能够活化 细胞，对T细胞无明显的作用 能够活化B细胞 能够活化 细胞， 细胞无明显的作用 CpG能够提高 细胞表面抗原递呈相关分子的表达 能够提高B细胞表面抗原递呈相关分子的表达 能够提高 CPG诱导 诱导PBMC产生高水平的 产生高水平的IFN-γ 诱导 产生高水平的 CPG诱导淋巴细胞向 诱导淋巴细胞向Th1、Tc1分化 诱导淋巴细胞向 、 分化 CPG增强 增强PBMC对K562细胞的杀伤作用 对 细胞的杀伤作用 增强 通过B细胞介导 可诱导特异性CTL 通过 细胞介导, CPG可诱导特异性 细胞介导 可诱导特异性
特异性CTL诱导 诱导 特异性
Pro5TM MHC Pentamers检测对照组和实验组 检测对照组和实验组HBcAg18-27抗原特异 检测对照组和实验组 抗原特异 前者为对照组（ ），后者为实验组 性CTL（Q2-1区）。前者为对照组（未加 （ 区）。前者为对照组 未加APC），后者为实验组（加 ），后者为实验组（ APC）。 ）。
TOLL受体 受体
TOLL受体在血细胞中的表达 受体在血细胞中的表达
活化B细胞负载核心抗原 活化 细胞负载核心抗原
1. 2. 3. 4.
磁珠分选B淋巴细胞 磁珠分选 淋巴细胞 CPG活化 淋巴细胞 活化B淋巴细胞 活化 核心抗原肽:FLPSDFFPSV-FITC 核心抗原肽 流式细胞仪、 流式细胞仪、荧光显微镜检测抗原负载 状况
CpG提高 细胞表面CD80、 提高B细胞表面 、 提高 细胞表面 CD86的表达 的表达
、 表 达 率 （ ）
80 70 60 50 40 0 0 0 0
6
006 C
Cp2006
C
CD80 CD80 *
CD86 CD86
P<0.05
C
6
CD80 CD86
* * *
*
B细胞 细胞MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ表达 Ⅰ Ⅱ 细胞
磁珠分选B细胞 磁珠分选 细胞
分选前B 分选前B细胞 7.89%
分选后B细胞 89.6% 分选后B
活化B细胞负载抗原肽 活化 细胞负载抗原肽
M1
Marker All M1
% Gated 100.00 41.34
活化B细胞负载核心抗原 活化 细胞负载核心抗原
荧光显微镜观察B细胞负载 荧光显微镜观察 细胞负载HBcAg18-27肽 细胞负载 肽
2.
3.
CpG提高淋巴细胞 提高淋巴细胞CD69表达 提高淋巴细胞 表达
35 30 25 20
率 （ ） % CD69 表 达
*
15 10 5 0 CpG2006 221
*
200
淋巴细胞 *
淋巴细胞
P<0.05
221
B细胞 细胞CD80、CD86表达 细胞 、 表达
对照组
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加CPG-ODN组 组
加CPG-ODN组 组
CIK细胞杀伤靶细胞 细胞杀伤靶细胞
研究背景
通过主动免疫、过继特异性免疫、 通过主动免疫、过继特异性免疫、 过继非特异性免疫等方式， 过继非特异性免疫等方式，清除慢性乙 肝患者体内残存的HBV，达到治疗效 ， 肝患者体内残存的 果。
研究背景
B淋巴细胞具有抗原递呈细胞的性质， 淋巴细胞具有抗原递呈细胞的性质， 同时具有CpG-ODN受体：TLR-9。本研究 同时具有CpG-ODN受体：TLRCpG 受体 探讨CpG-ODN诱导B淋巴细胞成为高效 探讨CpG-ODN诱导 淋巴细胞成为高效 CpG 诱导 APC，使之具有类似于树突状细胞功能 ， 的可行性。 的可行性。
1.
负载了抗原的活化B细胞与淋巴细胞混合培 负载了抗原的活化 细胞与淋巴细胞混合培 培养液). 养(含IL-2的RPMI1640培养液 含 的 培养液
2. 3.
收集细胞,以五聚体技术检测 特异性CTL. 收集细胞 以五聚体技术检测HBV特异性 以五聚体技术检测 特异性 实验组特异性CTL为0.50±0.19%，对照组 为 实验组特异性 ± ， 为0.20±0.10%。 ± 。