锌指蛋白核酸酶的作用原理及其应用

关键词: 锌指结构域 ; 锌指蛋白 ; 锌指蛋白核酸酶 ; 同源重组 ; 基因打靶
The mechanism and application of zinc finger nucleases
ZHONG Qiang , ZHAO Shu-Hong
Key Laboratory of Agricultural Animal Genetics, Breeding and Reproduction of Ministry of Education of China, College of Animal Science and Technology, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070, China
HEREDITAS (Beijing) 2011 年 2 月 , 33(2): 123― 130 ISSN 0253-9772
综述
DOI: 10.3724/SP.J.1005.2011.00123
锌指蛋白核酸酶的作用原理及其应用
钟强 , 赵书红
华中农业大学农业动物遗传育种与繁殖教育部重点实验室 , 农业部猪遗传育种重点开放实验室 , 武汉 430070
Abstract: Due to specific recognization of DNA sequences and designability, zinc finger nucleases (ZFN) has been used in knock in and knock out genes. Because of high ratio of homologous recombination of DSB-GT induces by ZFN, ZFN technology has been considered as the most powerful tool for gene modification. It has been successfully used at cell or embryo levels in plants and animals. Under the rapid development of high affinity zinc finger protein (ZFP), this technique will be applied to genetic engineering and breeding extensively in the future. This review discussed the DNA recognization mechanism and double strand break gene targeting (DSB-GT) of zinc finger nucleases (ZFN). Some application examples of ZFN were summarized.
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HEREDITAS (Beijing)
2011
第 FP[11]。由于高亲和 力并不等于高特异性
[12]
域中 14~25 位的氨基酸 , 但没有确切的实验证据 , 直到 Pavletich 等 [19]测定了 ZIF268 与 DNA 绑定的晶 体结构 , 锌指结构对 DNA 的识别机制才有了比较清 晰的认识。 如图 1A 所示 , 锌指结构域的 α-螺旋嵌入 到 DNA 分子的大沟中 , 螺旋上的 ARG46、 HIS49 和 THR52 侧链与大沟中的 3′ 到 5′ 方向的 DNA 链相互 识别 , 这 3 个氨基酸位于 α-螺旋的 -1、 3、 6 位氨基 酸 , 因此 Pavletich 等 [19]提出的识别模式被称为 -1、 3、 6 模式 , 可以识别位于 DNA 上同一条链上 3′ 到 5′ 方向连续的 3 个碱基。这个识别模式被实验证实部 分正确 [20]。随后 Fairall 等 [21]测得了 ZIF268 与 DNA 绑定的晶体结构 , 锌指结构域的 α-螺旋上的 1、 2、 3、 6 位氨基酸可以与 DNA 形成氢键 , 其中 2 位的氨 基酸识别 5′ 到 3′ 方向 DNA 链上的一个碱基 , 如图 1B 所示 , α-螺旋上的 ARG152、 ASP154、 ASN155 和 ALA158 氨基酸侧链与 DNA 形成氢键 , 可以识别 4 个碱基 , 因此锌指结构域识别 DNA 碱基的模式调 整为 -1、 2、 3、 6 模式 [22], 这个模式通过 DNA 碱基 替换实验得到证实 [20, 22]。 根据以上的分析 , 发现每个锌指结构域可以识 别 3′ 到 5′ 方向 DNA 链的 3 个碱基以及 5′ 到 3′ 方向 的一个碱基。 是否可以根据这一规律设计与 DNA 序 列特异结合的锌指结构呢？答案是肯定的 , Isaland 等 [23] 使用噬菌体展示技术 (Phage display) 鉴定了与 靶 DNA 序列具有较高亲和力的锌指结构 , 该实验表 明根据已知的 DNA 序列可以找到与之结合的锌指结 构。由于一个锌指结构域只能识别 3 bp (Base pair),
。 该项技术已经被成功用于动植物基
因改造实验中 , 研究者根据靶 DNA 序列设计特异性 的锌指蛋白 , 然后用锌指蛋白核酸酶 (Zinc finger
收稿日期 : 201007; 修回日期 : 20101107 基金项目 : 国家转基因重大专项与教育部创新团队项目 ( 编号： IRT0831)资助 作者简介 : 钟强 , 博士 , 研究方向：生物信息学。 E-mail: zqiang320@ 通讯作者 : 赵书红 , 教授 , 博士 , 研究方向：动物分子生物学与育种。 E-mail: shzhao@
第2期
钟强等 : 锌指蛋白核酸酶的作用原理及其应用
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对于全基因组来说至少有 18 bp 才能确保靶位点的 特异性。 因此需要有 8~10 个锌指结构连在一起才能 实现长片段的识别。因为 Doyon 等 用 8 个锌指结 构域实现了 DNA 的特异识别 , 而且没有脱靶现象 , 因此可以认为 8~10 个锌指结构域就可以实现靶位 点的特异识别。随着 DNA 加长 , 9 bp 并不对应 3 个 锌指结构域 , 因此 Moore 等 [24]的实验设计了两种策 略来确定锌指结构域 : (1) 3×2F, 这种方法在靶序列 中 , 每隔 6 个碱基跳过一个碱基 , 两对锌指结构域 之间插入一个甘氨酸 (GLY)。 (2) 2×3F, 这种方法在 靶序列中 , 每隔 9 个碱基跳过两个碱基 , 两个三联 体锌指结构域之间插入甘氨酸-丝氨酸-甘氨酸 (GLY-SER-GLY)。 实验表明 2×3F 方法设计的锌指蛋 白对靶位点的突变非常敏感 , 因此 2×3F 方法设计的 锌指蛋白对靶序列的识别特异性更高。
[1~3]
nucleases, ZFN) 定点突变 DNA, 并引入外源基因 , 在整个实验 该技术具有非常高的基因整合效率 [4~8]。 流程中 , 设计特异性的锌指蛋白 (Zinc finger protein, ZFP) 是最关键的环节 , 应用大肠杆菌双杂交报告系 统 (Bacterial cell based two-hybrid (B2H) reporter system)筛选高亲和力的 ZFP 是目前最为流行的方法[9, 10]。 这些高亲和力的 ZFP 被提交到公共的数据库中 , 以
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锌指结构域对 DNA 序列的特异性识别
锌指结构域是转录因子用于识别靶 DNA 的蛋
白结构域 , 因为这种蛋白结构域络合了一个锌离子 , 所以称之为锌指结构域 (Zinc finger)。 Miller 等 [17]最 早发现并阐述了锌指结构域的功能 , 他们发现全长 为 344 个氨基酸的转录因子 (Transcription Factor IIIA, TFIIIA)序列中 , 13~276 位氨基酸含有 9 个锌指 结构域 , 锌指结构域由 30 个氨基酸组成 , 每个锌指 结构域中 8 和 13 位的半胱氨酸以及 26 和 30 位的组 氨酸非常保守 , 他们可以络合锌离子。因此这种类 型的锌指结构域被称为 C2H2, 另外还有 4 个位点都 是半胱氨酸的锌指结构域 , 被称为 Cys4。 C2H2 型的 锌指结构广泛存在于转录因子中 , 人的基因中有 3% 的基因编码含有 C2H2 型的锌指结构域的蛋白 Miller 等
, 因此为了减小 ZFP 的脱靶
[13]
率 , 降低 ZFN 造成的细胞毒性和基因毒性 , 迫切需 要设计出高特异性的 ZFP 。目前已经有研究者采
[14~16]
用计算生物学方法设计高特异性的 ZFP
, 随着
越来越多的研究和生产需要 , 类似的方法还会不断 出现。作为遗传研究工作者有必要深入的了解 ZFN 技术的原理和发展趋势 , 以便于及时掌握和改进该 项技术, 从而为研究和生产服务。本文综述了锌指蛋 白对 DNA 序列的特异性识别和 ZFN 的工作原理 , 同时还对部分 ZFN 应用实例进行了概述。
摘要: 锌指蛋白核酸酶 (Zinc finger nucleases, ZFN) 因其能特异性识别并切割 DNA 序列以及可设计性 , 被
用于基因定点突变和外源基因定点整合。目前 , ZFN 技术以其准确的靶位点设计能力和诱发高效率基因打靶的 优势 , 越来越受到基因改造研究者的重视 , 已经成功应用于动植物细胞、胚胎的基因改造。随着鉴定靶 DNA 高亲和力的锌指蛋白 (Zinc finger protein, ZFP)实验技术日渐成熟 , 可以预见到不久的将来这项技术会在基因工 程和育种中得到广泛应用。文章介绍了锌指蛋白识别 DNA 靶位点和 ZFN 介导的基因打靶 (Double strand break gene targeting, DSB-GT)的原理 , 同时还综述了目前 ZFN 技术用于基因改造的研究进展。
[4]
作为模板, 这个氨基酸序列框架被证明是高效的[25]。 如图 2 所示 , 锌指结构域中有 7 个氨基酸用于识别 三联体碱基 , 因此可以通过改变这些氨基酸来提高 锌指结构域识别靶 DNA 的特异性。 TGEK 序列用于 连接相邻的两个锌指结构域。
Linker -1123456 TGEKPYKCPECGKSFSXXXXXXXHQRTH
[17] [18]
。
推测识别 DNA 序列的氨基酸是锌指结构
图1
锌指结构域识别靶 DNA 序列的三维结构
绿色表示锌指结构域 , 橘红色表示 DNA 。 C2H2 结构与锌离子络合在一起 ( 灰色小球 ) 。红色小球表示水分子。 A 图三维结构来源于 (PDB ID:1ZAA), 锌指结构域识别 DNA 碱基的氨基酸为 ARG46 、HIS49 和 THR52。ARG46、HIS49 和 THR52 识别链的方向为 3′ 到 5′ 端。B 图三维 结构来源于 (PDB ID: 2DRP), 锌指结构域识别 DNA 碱基的氨基酸为 ARG152、 ASP154、 ASN155 和 ALA158。 ARG152 、 ASN155 和 ALA158 识别 DNA 链的方向为 3′ 到 5′ 端。 ASP154 识别 DNA 链的方向为 5′ 到 3′ 端。
Keywords: zinc finger domain; zinc finger protein; zinc finger nucleases; homologous recombination; gene targeting
锌指蛋白核酸酶是人工改造的蛋白 , 它利用了 锌指结构域对 DNA 序列的特异性识别来达到准确 定位靶点的目的 , 同时利用核酸酶的 DNA 水解活性 , 使靶 DNA 双链断裂 , 然后利用细胞的修复机制 , 引 入基因突变