锌指蛋白核酸酶的作用原理及其应用
锌指蛋白核酸酶的作用原理及其应用
。 该项技术已经被成功用于动植物基
因改造实验中 , 研究者根据靶 DNA 序列设计特异性 的锌指蛋白 , 然后用锌指蛋白核酸酶 (Zinc finger
收稿日期 : 201007; 修回日期 : 20101107 基金项目 : 国家转基因重大专项与教育部创新团队项目 ( 编号： IRT0831)资助 作者简介 : 钟强 , 博士 , 研究方向：生物信息学。 E-mail: zqiang320@ 通讯作者 : 赵书红 , 教授 , 博士 , 研究方向：动物分子生物学与育种。 E-mail: shzhao@
HEREDITAS (ຫໍສະໝຸດ eijing) 2011 年 2 月 , 33(2): 123― 130 ISSN 0253-9772
综述
DOI: 10.3724/SP.J.1005.2011.00123
锌指蛋白核酸酶的作用原理及其应用
钟强 , 赵书红
华中农业大学农业动物遗传育种与繁殖教育部重点实验室 , 农业部猪遗传育种重点开放实验室 , 武汉 430070
Keywords: zinc finger domain; zinc finger protein; zinc finger nucleases; homologous recombination; gene targeting
锌指蛋白核酸酶是人工改造的蛋白 , 它利用了 锌指结构域对 DNA 序列的特异性识别来达到准确 定位靶点的目的 , 同时利用核酸酶的 DNA 水解活性 , 使靶 DNA 双链断裂 , 然后利用细胞的修复机制 , 引 入基因突变
摘要: 锌指蛋白核酸酶 (Zinc finger nucleases, ZFN) 因其能特异性识别并切割 DNA 序列以及可设计性 , 被
ZFN基因编辑技术的原理与应用
ZFN基因编辑技术的原理与应用随着科技的快速发展，基因编辑技术在生物学和医学研究中发挥着越来越重要的作用。
在众多基因编辑技术中，ZFN（锌指核酸酶）基因编辑技术因其高效性和精准性在科学界备受关注。
本文将介绍ZFN基因编辑技术的原理以及在生物技术和医学领域中的应用。
ZFN技术以锌指蛋白为基础，借助DNA的序列特异性结合能力来指导特定基因的编辑。
锌指蛋白是一种含有锌指结构域的转录因子。
每个锌指结构域由30个氨基酸组成，能够识别特定的DNA序列。
通过设计锌指蛋白，可以选择性地靶向到目标DNA序列，并与DNA序列发生稳定的非共价相互作用。
ZFN基因编辑技术的实质是将特定的锌指蛋白与核酸内切酶融合形成一种酶-蛋白质复合体。
这种复合体能够通过识别目标基因的DNA序列，并在目标序列上形成DNA双链断裂。
在细胞修复过程中，通过非同源末端连接或同源重组的机制，可以实现对目标基因的精确编辑。
这种酶-蛋白质复合体可以通过基因转染技术导入到细胞中，使其具有特定目的的基因编辑能力。
ZFN基因编辑技术在生物技术领域有着广泛的应用。
首先，它可以用于研究基因功能和疾病发生机制。
通过编辑特定的基因，可以研究其功能和相互作用，并探索基因突变对疾病的影响。
其次，ZFN技术可以用于基因组的精确修饰。
通过定点突变或插入特定序列，可以改变目标基因的功能，用于改良农作物、生产工业酶、制造药物等。
此外，ZFN技术还可以用于模拟疾病模型。
通过编辑目标基因，可以模拟特定疾病的基因变异，从而更好地理解疾病的机制并开发有效的治疗方法。
除了在生物技术领域的应用外，ZFN基因编辑技术还具有巨大的潜力用于临床治疗。
目前，该技术已被用于修复基因突变导致的遗传病。
例如，使用ZFN技术可以修复造血干细胞中的基因缺陷，用于治疗遗传性疾病如血友病和免疫缺陷病。
此外，ZFN技术还可以用于癌症治疗。
通过编辑癌细胞中的靶基因，可以恢复抑癌基因的功能，抑制肿瘤的生长和扩散。
基因工程 比较TALEN技术与ZFN技术
基因工程比较TALEN技术与ZFN技术基因工程：比较TALEN技术与ZFN技术引言：基因工程是一门利用生物学技术对生物体的基因进行修改和调控的学科。
在基因工程领域，TALEN（转录活性效应核酸酶）技术和ZFN（锌指核酸酶）技术是两种常见的基因编辑工具。
本文将详细比较这两种技术的原理、应用、优势和局限性，以帮助读者更好地理解和选择适合自己研究需求的基因编辑技术。
一、TALEN技术1. 原理：TALEN技术是一种利用人工合成的转录活性效应核酸酶（TALEN）靶向特定DNA序列进行基因编辑的方法。
TALEN由两个功能域组成：DNA结合域和转录活性效应域。
DNA结合域通过识别特定DNA序列，而转录活性效应域则通过结合与DNA结合域靶向的DNA序列相邻的DNA酶切酶，实现DNA的切割和修复。
2. 应用：TALEN技术在基因工程领域具有广泛的应用。
它可以用于基因敲除、基因敲入、基因修饰等多种基因编辑操作。
例如，科研人员可以利用TALEN技术研究特定基因的功能，或者通过敲入外源基因来实现特定基因的表达。
3. 优势：TALEN技术相比其他基因编辑技术具有以下优势：- 高度特异性：TALEN可以精确识别和结合特定的DNA序列，从而实现精确的基因编辑。
- 高效性：TALEN技术可以在较短的时间内实现基因编辑，提高实验效率。
- 灵活性：TALEN技术可以用于不同生物体的基因编辑，包括人类细胞、动物和植物细胞等。
4. 局限性：虽然TALEN技术具有许多优势，但也存在一些局限性：- 设计复杂：TALEN的设计需要合成两个相应的DNA结合域，这增加了实验的复杂性。
- 成本较高：合成TALEN所需的材料和技术较为昂贵，限制了其在一些实验室的应用。
- 潜在的细胞毒性：TALEN技术可能对细胞产生毒性作用，限制了其在体内的应用。
二、ZFN技术1. 原理：ZFN技术是一种利用人工合成的锌指蛋白（ZFP）靶向特定DNA序列进行基因编辑的方法。
基因编辑分类
基因编辑分类基因编辑是一种现代生物技术，通过人为修改生物体的基因组来实现对特定基因的精确编辑和修饰。
基因编辑技术的出现，为科学家提供了一种有效的手段来研究基因功能、治疗遗传疾病、改良农作物等。
基因编辑可以分为不同的分类，主要包括以下几种技术：锌指核酸酶（ZFN）、转录活化因子（TALEN）、CRISPR/Cas9等。
这些技术都具有各自的特点和优势，但基本原理相似，都是通过靶向性切割或改变基因组中的DNA序列，从而实现对特定基因的编辑。
锌指核酸酶是一种最早被应用于基因编辑的技术。
它利用锌指蛋白与DNA序列特异性结合的特性，将特定的锌指蛋白与DNA切割酶结合，实现对目标基因的编辑。
然而，锌指核酸酶技术具有设计复杂、成本高昂等缺点，因此在实际应用中受到一定限制。
转录活化因子是一种基于转录因子结合DNA序列的基因编辑技术。
它通过设计合成的转录活化因子来激活或抑制特定基因的表达。
转录活化因子技术相对于锌指核酸酶技术来说，具有更高的特异性和选择性，可以实现对基因表达的精确调控。
CRISPR/Cas9技术是目前最为广泛应用的基因编辑技术之一。
它利用CRISPR序列与Cas9蛋白的结合，形成一种RNA-DNA复合物，通过与目标DNA序列互补配对，实现对特定基因的精确编辑。
相比于其他技术，CRISPR/Cas9技术具有设计简单、操作方便、高效率等优势，已经被广泛应用于基因研究、基因治疗等领域。
除了这些主要的基因编辑技术外，还有一些其他的技术正在不断发展和完善，如CRISPR-Cpf1、Prime Editing等。
这些技术的出现，进一步丰富和完善了基因编辑技术的工具箱，为科学家们在基因研究和应用方面提供了更多的选择和可能性。
基因编辑的应用领域非常广泛。
在基础科学研究中，基因编辑可以帮助科学家们揭示基因功能和调控机制，深入了解生物体的发育、生长和繁殖过程。
在医学领域，基因编辑可以用于治疗遗传疾病，如肌萎缩侧索硬化症、血友病等。
生物学基因编辑技术的原理与应用
生物学基因编辑技术的原理与应用基因编辑技术是近年来生物学领域的一项突破性技术，它被广泛应用于基因研究、治疗疾病和优化生物种质等方面。
本文将介绍生物学基因编辑技术的原理和主要应用。
一、基因编辑技术的原理基因编辑技术主要通过特定的酶系统改变生物体的基因序列，以实现精确的基因组操作。
目前最常用的基因编辑技术包括锌指核酸酶（ZFN）、转录活化因子样效应核酸酶（TALEN）、CRISPR/Cas9等。
1. 锌指核酸酶（ZFN）锌指核酸酶是一种DNA结合蛋白，由锌指结构域和核酸酶结构域组成。
通过引入特定的锌指蛋白，可以使其与DNA靶标特异性结合，并切割DNA分子，从而实现基因组编辑。
2. 转录活化因子样效应核酸酶（TALEN）TALEN是一种由转录活化因子结构域和核酸酶结构域组成的人工构建蛋白。
它可以与目标DNA特异性结合，并在目标位点引发DNA双链断裂，从而与细胞内自我修复机制相互作用，实现基因组编辑。
3. CRISPR/Cas9CRISPR/Cas9是目前最为流行的基因编辑技术，它利用CRISPR RNA（crRNA）和转录单元RNA（tracrRNA）引导Cas9核酸酶特异性结合到目标基因组中，形成DNA双链断裂，再通过DNA修复机制改变基因组序列。
二、基因编辑技术的应用1. 研究基因功能基因编辑技术可以用于研究基因的功能和作用机制。
通过特定的编辑技术，可以删除、插入或修饰目标基因，以观察其对生物体生理、发育和疾病等方面的影响，为研究基因的功能和相关疾病的发生机制提供重要依据。
2. 治疗基因疾病基因编辑技术被广泛应用于治疗基因疾病。
通过修复或替代异常基因，可以纠正遗传性疾病的发生。
例如，利用基因编辑技术可以修复人类干细胞中的异常基因，然后将其转化为正常的组织细胞用于治疗疾病。
3. 农作物改良基因编辑技术在农业领域有着广阔的应用前景。
通过编辑植物基因组，可以提高植物的农产品产量、质量和抗病能力，实现农作物的优化和改良。
常用基因编辑技术的原理与应用
常用基因编辑技术的原理与应用随着科技的不断进步和发展，人们对基因编辑技术的研究越来越深入，基因编辑技术的应用也在不断扩大。
基因编辑技术是一种可以通过DNA序列的修改来改变生物物种的遗传信息的技术。
它可以准确地定位并修改目标基因，从而实现修复和改良生物体的特征。
在本文中，我们将讨论一些常用的基因编辑技术的原理和应用。
一、锌指核酸酶（ZFNs）锌指核酸酶是一种人工合成的DNA切割酶，具有高度的特异性和准确性。
通过将ZFNs与特定的酶切序列相结合，可以选择性地剪切DNA双链。
在切割DNA后，可以通过多种方式进行修复，例如非同源末端连接、同源重组等方法，从而达到修改或修复基因的目的。
ZFNs技术的应用范围非常广泛，包括植物、动物和微生物等不同的生物领域。
在医学上，ZFNs可以用于治疗遗传性疾病，通过修复异常基因来达到治疗的目的。
在植物领域，ZFNs可以用于提高作物的产量和质量。
同时，在动物领域中，ZFNs可以用于改良家禽和畜牧业生产中的优质肉和乳制品。
二、CRISPR-Cas9技术CRISPR-Cas9技术是一种通过特定酶的协同作用来实现DNA序列的修改。
这种技术利用CRISPR酶和Cas9酶协作来识别特定的DNA序列，然后使用Cas9酶切割引起DNA双链断裂。
切割后，可以使用同源重组或非同源末端连接等方式对DNA进行修复，实现对目标基因的修改。
CRISPR-Cas9技术在生物领域的应用非常广泛。
在医学领域，它可以用于治疗遗传性疾病，例如囊性纤维化、糖尿病等。
在农业领域，CRISPR-Cas9可以用于提高作物的产量和耐受性。
此外，CRISPR-Cas9还可以应用于立体生物打印和基因库筛选等领域。
三、TALENs技术TALENs技术是一种利用人工蛋白质识别DNA序列的技术。
它将一个转录激活因子与一个核酸酶结合，形成一种TALENs蛋白质。
这种蛋白质与目标基因的DNA序列特异性结合，从而实现基因的修复和改良。
锌指核酸酶技术原理
锌指核酸酶技术原理锌指核酸酶技术原理什么是锌指核酸酶技术？锌指核酸酶技术（Zinc Finger Nuclease, ZFNs）是一种基因工程技术，用于定点编辑和修饰基因组。
它利用特殊的蛋白质，即锌指蛋白（Zinc Finger Protein, ZFP），并与核酸酶结合形成复合物，以实现特定DNA序列的切割或修饰。
锌指蛋白的结构和功能锌指蛋白是一类具有DNA结合能力的蛋白质，其结构中含有锌离子结合的结构域，称为锌指。
每个锌指通常能识别并与3个到4个相邻的核苷酸碱基序列结合。
通过组合不同的锌指，可以根据需要精确地设计出能够特异性结合目标DNA序列的锌指蛋白。
锌指核酸酶的构建与作用机制构建锌指核酸酶主要有两个步骤：首先，设计和合成锌指蛋白，使其能够特异性结合目标DNA序列；然后，将核酸酶域与锌指蛋白结合，形成具有目标DNA切割能力的复合物。
锌指蛋白与目标DNA序列结合后，核酸酶域会切割目标DNA，导致DNA链断裂。
细胞为了修复这些断裂的DNA链，会使用自身的修复机制来进行修复。
通过干扰修复机制，可以实现基因组的编辑以及修饰。
锌指核酸酶的应用和前景锌指核酸酶技术已经被广泛应用于基因组编辑、基因修饰和基因治疗等领域。
它可以用于修复携带病变基因的人体细胞，以治疗一些遗传性疾病。
此外，锌指核酸酶还可以用于基因表达调控和基因功能研究等方面。
虽然锌指核酸酶技术在基因工程领域有着广阔的应用前景，但其设计和合成过程相对复杂，且需要一定的技术和实验条件。
因此，研究人员正在不断改进和优化锌指核酸酶技术，并开发出更高效、更精准的基因编辑工具，以满足科学研究和应用的需求。
结论锌指核酸酶技术利用锌指蛋白与核酸酶结合，实现对特定DNA序列的切割和修饰。
它是一种重要的基因工程技术，具有广泛的应用前景。
通过不断改进和优化，锌指核酸酶技术将为基因组编辑和基因治疗等领域的研究和应用提供有力的支持。
锌指核酸酶技术的优势和挑战锌指核酸酶技术相比其他基因编辑技术具有一些明显的优势，但也存在挑战。
基因工程 比较TALEN技术与ZFN技术
基因工程比较TALEN技术与ZFN技术基因工程中的基因编辑技术是一项重要的研究领域，它可以用于改变生物体的基因组，以实现特定的目标。
在基因编辑技术中，TALEN（转录活性核酸酶）和ZFN（锌指核酸酶）是两种常用的工具。
本文将比较这两种技术的原理、应用和优缺点。
1. TALEN技术TALEN技术是一种基于转录活性核酸酶的基因编辑技术。
它利用一种特殊的DNA结合蛋白质，即转录活性核酸酶，来识别和结合特定的DNA序列。
TALEN 由两个主要组成部份组成：DNA结合结构域和转录活性结构域。
DNA结合结构域可以根据目标DNA序列的要求进行设计，而转录活性结构域则可以促进DNA的切割和修复。
TALEN技术的应用非常广泛。
它可以用于研究基因功能、治疗遗传疾病、改良农作物和生产药物等方面。
例如，科学家可以利用TALEN技术在实验室中摹拟人类遗传疾病，并研究其发病机制。
此外，TALEN还可以用于改良农作物的抗病性和耐逆性，从而提高农作物的产量和品质。
然而，TALEN技术也存在一些局限性。
首先，设计和构建TALEN需要较高的技术水平和时间成本。
其次，TALEN技术在某些情况下可能会导致非特异性的DNA切割，从而引起不必要的基因突变。
此外，TALEN技术在应用于体内基因编辑时，可能会面临一些安全性和伦理性问题。
2. ZFN技术ZFN技术是一种基于锌指核酸酶的基因编辑技术。
锌指核酸酶是一种可以识别和结合特定DNA序列的蛋白质。
通过将多个锌指结构域组合在一起，可以构建具有高度特异性的DNA结合蛋白质。
与TALEN类似，ZFN也由两个主要组成部份组成：DNA结合结构域和核酸酶结构域。
DNA结合结构域可以根据目标DNA序列的要求进行设计，而核酸酶结构域可以切割和修复DNA。
ZFN技术的应用也非常广泛。
它可以用于研究基因功能、治疗遗传疾病、改良农作物和生产药物等方面。
与TALEN相比，ZFN技术在某些情况下可能更容易设计和构建，因为锌指结构域的设计和选择比较成熟。
ZFN技术：一种基因组编辑的利器
ZFN技术：一种基因组编辑的利器摘要ZFN（锌指核酸酶）是一种人工合成的限制性内切酶，通过其锌指DNA结合域和DNA切割域，可以在特定的DNA序列上产生双链断裂，从而实现对基因的精确编辑。
ZFN技术具有高效、精准和可控的特点，已经在基因功能研究、基因治疗、转基因动植物等领域得到广泛的应用。
本文介绍了ZFN技术的原理、设计、优缺点和运用，并展望了其未来的发展方向。
ZFN技术的原理ZFN是由两部分组成的蛋白质，一部分是锌指结构域，能够识别并结合特定的DNA序列，另一部分是Fok I核酸酶，能够切割DNA。
为了实现DNA的定点切割，需要设计两个ZFN，分别结合到DNA的两条链上，相距5-7个碱基对的位置。
这样，两个ZFN就可以形成Fok I核酸酶的二聚体，并切割DNA的中间位置。
切割后的DNA可以通过细胞的修复机制进行修复，如果提供一个同源的DNA片段作为模板，就可以实现基因的插入或替换。
如果没有提供模板，就可能产生基因的缺失或突变。
ZFN技术的设计ZFN技术的核心是设计锌指结构域，使其能够特异性地识别目标DNA序列。
锌指结构域是由一个或多个锌指蛋白组成的，每个锌指蛋白可以通过一个α螺旋和两个β折叠与DNA的一个三联体碱基对相互作用。
不同的锌指蛋白可以识别不同的三联体碱基对，因此，通过串联多个锌指蛋白，可以形成一个能够识别9-18个碱基对的锌指结构域。
目前，有一些计算机辅助的设计方法和商业化的服务可以提供ZFN的制备，但是仍然需要进行验证和优化。
ZFN技术的优缺点ZFN技术的优点是具有高度的特异性和效率，可以在任何物种和细胞中进行基因组编辑。
ZFN技术还可以与细胞内DNA修复机制共同发挥作用，使研究者自如地编辑基因组。
ZFN技术的缺点是设计和合成比较复杂和昂贵，需要根据不同的靶序列选择合适的锌指蛋白，并考虑锌指蛋白之间的相互作用和稳定性。
ZFN技术的切割可能会产生脱靶现象，也就是说，除了预期的靶序列，ZFN还可能切割其他与之相似的DNA序列，从而导致非特异性的DNA损伤和细胞毒性。
基因编辑技术在果树生长发育调控中的应用指南
基因编辑技术在果树生长发育调控中的应用指南基因编辑技术作为近年来发展最为迅猛的生物技术之一，对于果树生长发育调控的应用具有巨大潜力。
通过对果树基因进行精确编辑，可以实现对果树生长发育过程中关键基因的调控，从而提高果树品质、增加产量，抵御病虫害等。
本文将介绍基因编辑技术的基本原理和方法，并讨论其在果树生长发育调控中的应用指南。
基因编辑技术的基本原理是通过引入特定的DNA修复机制来修复特定基因的突变，实现对基因组的精确编辑。
在果树生长发育调控中，常用的基因编辑技术包括锌指核酸酶（ZFN）、转座子（Transcription activator-like effector nuclease，TALEN）和CRISPR/Cas9（clustered regularly interspaced short palindromicrepeats/CRISPR associated protein 9）等。
首先，锌指核酸酶是一种利用人工合成的锌指蛋白质与核酸酶结合的方式实现基因修饰的技术。
通过设计与目标基因序列相互匹配的锌指蛋白，使其与核酸酶结合并切割目标基因，从而实现对基因的突变。
锌指核酸酶技术在应用中相对较复杂，但其具有较高的精确性和特异性。
其次，转座子是一种DNA序列，可以在基因组中跳跃移动，与目标基因发生结合并切割，进而实现基因突变。
与锌指核酸酶相比，转座子技术的操作相对简单，但存在转座子活性低、特异性不高的问题。
最后，CRISPR/Cas9技术是目前最为广泛使用的基因编辑技术。
CRISPR/Cas9系统利用CRISPR RNA（crRNA）指导Cas9蛋白与对应DNA序列结合，实现对目标基因的切割和修复。
CRISPR/Cas9技术具有操作简便、高效快速的特点，因此在果树生长发育调控中具有广阔的应用前景。
基因编辑技术在果树生长发育调控中的应用主要包括提高果树品质、增加产量和抵御病虫害等方面。
首先，基因编辑技术可以通过改变果树品质相关基因的表达，实现对果实颜色、口感、香气等特性的调控。
基因工程 比较TALEN技术与ZFN技术
基因工程比较TALEN技术与ZFN技术基因工程是一门利用生物技术手段对生物体进行基因组改造的学科，其中TALEN技术和ZFN技术是常用的基因编辑技术之一。
本文将从技术原理、应用范围、优缺点、发展前景和伦理道德等方面对TALEN技术和ZFN技术进行比较。
一、技术原理1.1 TALEN技术：TALEN是转录激活样蛋白效应子核酸酶的缩写，其原理是将转录激活样蛋白与核酸酶结合，形成一种可识别和切割特定DNA序列的蛋白质复合物。
1.2 ZFN技术：ZFN是锌指核酸酶的缩写，其原理是利用锌指结构域与DNA 结合，通过设计特定的锌指蛋白结合序列来实现对目标基因的精准编辑。
二、应用范围2.1 TALEN技术：TALEN技术在动植物基因组编辑、疾病治疗、农业生产等领域有着广泛的应用。
2.2 ZFN技术：ZFN技术也被广泛应用于基因组编辑、疾病治疗、生物学研究等领域。
三、优缺点3.1 TALEN技术：TALEN技术具有高度的靶向性和编辑效率，但是设计和构建成本较高。
3.2 ZFN技术：ZFN技术具有较高的编辑效率和可控性，但是对于不同基因的设计需要更多的经验和技术支持。
四、发展前景4.1 TALEN技术：随着技术的不断改进和成熟，TALEN技术在基因编辑领域的应用前景广阔。
4.2 ZFN技术：ZFN技术在基因工程领域也有着巨大的发展潜力，特别在疾病治疗和生物学研究方面。
五、伦理道德5.1 TALEN技术：TALEN技术在基因编辑过程中需要严格遵守伦理规范，避免对生物多样性和人类健康造成不可逆的影响。
5.2 ZFN技术：ZFN技术同样需要在应用过程中考虑伦理道德问题，确保基因编辑的安全和合法性。
综上所述，TALEN技术和ZFN技术在基因工程领域都有着独特的优势和应用价值，未来随着技术的不断进步和完善，它们将在基因编辑和生物工程领域发挥越来越重要的作用。
同时，我们也需要认真思量和探讨基因编辑技术在伦理和道德层面的问题，确保其应用符合科学伦理和社会道德的要求。
锌指核酸酶技术在动物转基因中的应用
锌指核酸酶技术在动物转基因中的应用摘要:锌指核酸酶(Zinc finger nuclease,ZFN)具有特异性识别并敲除DNA片段中特定基因的特点,通过对DNA片段上的特定基因进行靶向修饰产生新型细胞,是能够应用于动物转基因上的一种新技术｡该技术已在一些动物的研究上取得了一定的成果,相对于传统的转基因技术,该技术在简化操作程序､缩短操作时间及提升成功率上都有很大的提高｡就常用的动物转基因方法､锌指核酸酶技术的作用原理以及在动物转基因上的应用及其前景进行了论述｡关键词:锌指核酸酶(Zinc finger nuclease,ZFN);动物转基因;靶向修饰动物的转基因技术是建立在分子生物学基础上,利用基因工程等试验方法将外源基因导入动物的受体细胞,并通过受体细胞的分裂与繁殖,将整合在受体细胞基因组中的目的基因有效遗传给后代个体,并得到预期结果的一种方法｡该技术始于20世纪80年代,1980年Gordon等[1]通过核显微注射技术在小鼠体内的试验,成功获得了第一个转基因动物｡后来一些研究人员又利用该方法陆续在兔､绵羊､猪的转基因上获得成功,在此基础上人们通过不断试验探索出其他的转基因技术,并且也在一些动物的转基因上获得成功｡如逆转录病毒载体法､精子载体法､胚胎干细胞介导法等分别在牛､鸡､小鼠等动物的转基因上获得成功｡但是,随着分子生物学的不断发展,研究人员对转基因结果的要求也越来越高,而这些传统的技术在一定程度上已不能满足人们的要求｡为了得到更好､更符合人们意愿的试验结果,研究人员不断地探索着更为先进的转基因技术,锌指核酸酶(Zinc finger nuclease,ZFN)技术就是一种新的转基因技术,由于其具有独特的剪切功能而引起了研究人员的极大兴趣｡1986年Diakun等[2]首先在真核生物转录因子家族的DNA结合区域发现了Cys2-His2锌指模块,到1996年Kim等[3]人工合成了第一个ZFN,再到Urnov等[4]发现的由4个锌指连接而成的ZFN可识别24 bp的特异性序列,ZFN在转基因中的作用逐渐受到了研究人员的关注｡1 动物转基因技术的常用方法1.1 逆转录病毒载体法逆转录病毒载体法是利用病毒作为载体,将外源基因片段插入病毒载体的长末端重复序列的下游并通过其侵染作用将目的片段整合到宿主细胞的基因组中｡该方法主要应用于转基因鸡和牛的生产｡1974年Janenisch等[5]发现注入小鼠囊胚腔中的SV40DNA能够在其体内发生整合｡但真正用于转基因动物的则是Salter 等[6]研究人员,他们在1987年利用该方法生产出了转基因鸡;而Biery等[7]则在1995年以劳式肉瘤病毒(RSV)为载体,通过将目的基因片段导入牛的胚胎,获得了转基因牛｡此方法操作简便,整合效率高且整合的外源基因多为单拷贝,所以非常有利于对基因结构､功能及表达调控的研究[8]｡1.2 精子载体法精子载体法是通过将外源DNA与精子混合培养后,利用带有外源DNA的精子与卵细胞结合形成受精卵,然后将该受精卵通过胚胎移植转移到动物的子宫内,经过发育后形成转基因动物[9]｡1989年Lavitrano等[10]利用该方法生产出了转基因小鼠,并发现转基因小鼠体内的外源DNA能够遗传给后代｡他们的这一结果引起了其他研究人员的关注｡该方法虽然操作简便,但其整合率低,需要通过改进来提高成功率｡Squires等[11]在该方法的基础上利用脂质体包埋外源DNA的方法成功地获得了转基因鸡;Anthony等[12]首先将精子的细胞膜破坏掉后再与外源DNA混合培养,然后将带有外源DNA的精子注入小鼠处于减数分裂中期的卵母细胞内,提高了转基因小鼠的数量｡1.3 胚胎干细胞法胚胎干细胞(Embryonic stem cells,ES细胞)来源于早期的胚胎细胞,由于其具有高度未分化的特性,随着生命体的发育它可以分化为多种细胞类型[13]｡该方法主要是在体外通过同源重组的方法将外源DNA片段整合到ES细胞的基因组中,然后再将ES细胞转移到动物的囊胚中,通过在动物体内的发育和分化,最终可以得到转基因的个体｡ES细胞由于其具有未分化的特点,所以其在转基因动物研究中是研究人员非常青睐的一种受体细胞｡但是ES细胞不能够从许多动物体内分离出来,当前只有在小鼠的研究中比较成功,所以对于其他动物来说还需要进行进一步的研究｡1.4 体细胞核移植法体细胞核移植法是将体细胞移入去核卵母细胞中,使其重组并能发育成新的胚胎,这个胚胎最终发育成动物个体｡其过程为:①细胞核的采集和卵母细胞的准备;②细胞促融;③植入代孕母体｡1997年英国PPL公司罗斯林研究所首次利用这种方法获得克隆羊Dolly｡2年后,PPL公司又利用这一技术获得2只定点整合的转基因羊｡Alexander等[14]利用普通母羊的卵细胞与转基因获得的公羊的精子在体外人工受精后,将其细胞核转移到去核的胎儿成纤维细胞中,最终获得3只转基因奶山羊｡目前,该方法已经在转基因羊､转基因鼠､转基因牛､转基因猪上获得成功｡体细胞核移植法是将改造后的体细胞进行核移植,从而能够提高转基因的成功率｡此外,该技术也可用于促进优良种群繁育,生产珍贵的医用蛋白,克隆动物的组织､器官移植的供体等,并且还可以对珍稀濒危动物进行克隆繁殖｡1.5 转座子介导法转座子是一段能够在生物体的基因组中自主复制并移动的DNA片段,在经过切割､重组等过程后可以插入其他位点,并且能够对插入位点之后的基因产生一定的影响｡其突出代表是Sleeping beauty(SB)和PiggyBac(PB)｡SB是通过对来自不同鱼类基因组的有缺陷的拷贝序列比对,获得最原始的转座子序列,通过点突变获得有活性转座子元件[15]｡1997年Ivics等[16]首次在哺乳动物的细胞中发现存在着有转座活性的DNA转座子｡PB则来源于鳞翅目昆虫｡1998年Handler等[17]首次利用PB转座子构建载体-辅助质粒双转化系统并成功转化地中海实蝇,转化频率达到3%~5%｡对PB插入位点的分析发现,PB在地中海实蝇基因组中特异性插入TTAA位点,并形成该靶位点重复,进一步证明了地中海实蝇种系转化是由PB 介导的染色体转座子引起的｡转座子介导法具有高整合率､大承载量及更加容易找到整合位点等优势｡2 锌指核酸酶的结构及作用原理ZFN是一种能够定点识别DNA双链位置并进行酶切的重组蛋白｡它主要是由两部分组成,一部分是DNA识别域,另一部分则是非特异性核酸内切酶｡其中DNA识别域通常是由3~4个C2H2结构的锌指蛋白构成[18],锌指蛋白是在真核生物体内普遍存在的具有特异性识别功能的蛋白,它主要是由转录调控因子家族(Transcription factor family)形成,每个锌指蛋白都能够识别一个特定的三联体碱基,当多个锌指蛋白结合在一起后能够形成一条含有特异性碱基的DNA片段,该片段具有特异识别功能,并且适当改变DNA结合特异性的氨基酸可以获得新的DNA结合特异性[19];而与DNA识别域相连的是一种来自海床黄杆菌(Flavobacterium okeanokoites)的限制性内切酶——FokⅠ,它并不具有特异性识别位点并且也只有在二聚体状态时才具有酶切活性[20]｡FokⅠ单体只具有非特异性的剪切功能,只能随机地切割DNA双链,当它与锌指蛋白结合形成一个ZFN后才能够识别特定的基因位点,而且只有当两个识别位点距离较近时(6~8 bp),ZFN 才能够相互作用并具有定点的酶切功能｡ZFN是高效动物基因组位点特异性修饰酶,能够使动物细胞内的DNA在特定的位置发生双链断裂(Double-strand breaks,DSB),DSB能够启动细胞内的2种DNA损伤修复机制:同源重组(Homology recommended,HR)和非同源末端连接(Nonhomologous end joining,NHEJ)｡一方面因为DSB可使得同源重组效率大大提高,如果细胞内同时存在与靶位点同源的DNA片段,则细胞主要通过DNA同源重组的机制修复DSB,从而实现靶基因敲除或敲入;另一方面通过错配率很高的NHEJ的修复机制,在ZFN靶位点造成随机性的小片段丢失或是插入,引起基因的靶向敲除[21]｡3 锌指核酸酶在动物转基因上的应用动物的转基因技术是通过对动物细胞内DNA序列上的基因修饰来实现的,对基因的修饰既可以是随机的,也可以是靶向的｡ZFN技术就是一种基于基因靶向修饰的新技术,它已经被应用于不同物种的基因操作,且取得了很大的成功｡目前,ZFN已分别在动物的细胞水平和整体水平实现了基因的定向修饰｡首先研究人员在动物的细胞水平利用ZFN技术实现了基因定向修饰｡Santiago 等[22]在中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)中暂时性表达针对DHFR基因序列的ZFN,造成15%的CHO细胞的DHFR位点特异性突变;Bibikova等[23]设计了1对三锌指结构域的ZFN,用于识别位于果蝇X性染色体的yellow基因第二外显子｡转染ZFN到果蝇胚胎中,ZFN引发了靶位点的断裂,细胞发生了NHEJ,导致一半的雄性果蝇发生突变,在这些果蝇中有 5.7%的个体恢复了正常颜色,其他的突变导致了颜色的改变｡接着研究人员实现了ZFN在整体水平的定向基因修饰,通过胚胎注射含有ZFN 的质粒或是mRNA可以有效地定靶,迅速在个体胚胎的内源基因上引起可遗传的突变｡Beumer等[24]利用ZFN技术将外源DNA片段导入果蝇体内,使其与果蝇基因组的靶基因发生同源重组,发现在果蝇的子代中有超过1%的出现了基因重组;Doyon等[25]和Meng等[26]在研究斑马鱼时发现,通过ZFN技术介导的基因突变,有30%~50%的个体将这种突变遗传给子代,而子代中个体为突变型的则是7%~18%,然而如果利用该技术作用于正常的胚胎,则其介导的基因打靶事件的成功率为99%｡2009年Geurts等[27]在研究大鼠的遗传变异时,利用ZFN技术通过基因的靶向修饰敲除了大鼠体内自身的2个基因片段以及之前插入的1个基因片段,并且在去除这些基因的同时对其他基因也并未产生较大的影响,结果发现在亲代大鼠丧失某些功能的同时,其子代也出现了同样的症状,这表明由该技术产生的基因突变能够完全遗传给后代,因此研究人员认为如果利用ZFN技术作用于动物的胚胎,则能够很容易地在整个生物体内产生可遗传的变异｡目前,研究人员在小鼠､鸡､牛等的转基因研究中都发现了一些相对简便的方法,而在大鼠及其他一些动物的转基因研究中还没有发现相对简便有效的方法来对其体内的基因进行靶向修饰,因此应进一步了解其自身一些特定基因的功能｡该研究发现ZFN不仅在技术上相对于传统的转基因操作简便,而且还能够在更短的时间内培育出转基因动物｡在试验中,利用ZFN技术对大鼠模型的靶基因敲除只需4个月时间,而使用传统的胚胎干细胞方法则是其3倍的时间｡另外,该技术在大鼠中的成功应用,不仅为研究人员在更短的时间内开发其他转基因动物奠定了一定的基础,也为开展人类疾病的研究进行了较好的铺垫｡因此,ZFN在缩短研究时间､提高研究效率上是一种非常理想的转基因技术｡4 展望转基因技术本身就是一种新兴的生物技术｡随着分子生物学的发展,转基因技术方法会不断地得到更新｡ZFN在大鼠试验上的成功标志着转基因技术又前进了一步｡ZFN技术相对于常用转基因方法有许多优点,如ZFN技术已被成功应用于许多物种上､对DNA序列的识别具有很高的特异性､在细胞水平上实现了基因的定向修饰､对靶基因的定点敲除､缩短试验时间､提高试验效率等,而这些特点则是传统的转基因技术所不能达到的｡但是,由于ZFN技术是新产生的转基因技术,其发展还不够成熟,还有许多问题需要去研究和解决,例如如何设计､筛选具有高亲和性和高特异性的锌指蛋白,ZFN可能会对基因组非靶向性位点随机切割,产生细胞毒性,如何更有效地调控ZFN的表达等｡ZFN作为转基因技术中新产生的有力工具,存在着巨大的潜力和价值｡通过不断地探索和实践,相信ZFN技术会越来越成熟,并最终成为转基因技术中的主要应用方法｡参考文献:[1] GORDON J W,SCANGOS G A, PLOSKIN D J, et al. 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Knockout rats produced via embryo pronuclear microinjection of designed zinc finger nucleases[J]. Science,2009,325(5939):433-447.Abstract: Zinc finger nuclease(ZFN) has the characteristics of identifying and knocking out specific genes in DNA fragments. New cells could be produced through a specific gene targeted modification in a specific DNA fragment. It can be used as a new technology in transgenic animals. Some achievements of this technology have been made in research on some animals. Compared with traditional transgenic technology, this technology could greatly simplify operation procedures, shorten operation time and improve successful rate. Commonly used methods in transgenic animals, principles of zinc finger nuclease technology and application prospects of the technology were discussed in the paper.Key words: zinc finger nuclease(ZFN); transgenic animal; targeted modification。
基因编辑技术zinc finger nuclease的原理及应用
基因编辑技术zinc finger nuclease的原理及应用基因编辑技术是指通过人工手段改变生物体基因组的方法，是目前生物技术领域最为前沿的研究方向之一。
其中，zinc finger nuclease（ZFN）是一种利用人工设计的锌指蛋白酶（zinc finger proteins，ZFPs）结合核酸递质实现靶向剪切基因组DNA的技术。
它是一种高效、精准、灵活的基因编辑工具，被广泛应用于动植物、细菌等生物体基因组编辑中。
一、ZFN的原理Zinc finger proteins 是一类与DNA结合的蛋白质，具有不同结构的指环域，可与特定DNA序列结合。
依次组合多个ZFPs，可以形成可以识别特定序列的人工锌指蛋白酶。
ZFN是由两个模块组成的蛋白质，一个是识别靶DNA序列的ZFP模块，另一个则是核酸递质Cys2His2 zinc finger domain融合的Fokl限制性酶。
ZFN融合锌指蛋白酶的结构可以与目标DNA片段特异性反应，靶向切断目标DNA，并在一定的条件下，通过体细胞修复机制，实现基因组编辑。
二、ZFN的应用1. 基因敲除：ZFN 切割靶标基因的两端，产生dsDNA断裂。
这样，体细胞自身修复机制会介导错误的断裂修复，形成缺陷性变异，从而导致基因敲除。
2. 基因纠错：将一个与缺失外显子序列同义的DNA序列置换到受损基因组中，利用ZFN切割DNA，合成外源DNA片段，并激活属于家族的修复途径重组酵母体系，在修复过程中实现基因纠正。
3. 基因添加：ZFN通过靶向切割细胞某处DNA，使其开启细胞自身修复程序，再加入外源DNA或RNA信使，利用细胞自身修复的过程将外源DNA或RNA信使组入到纠错的DNA处，实现基因添加。
基因添加可以激活受损的基因、引入新的基因、调节表达水平等。
4. 转基因制备：ZFN技术可以用于制备转基因动物、植物等，将目标基因加入到这些生物体中。
三、ZFN技术的优势与发展ZFN技术是一种新兴、前沿的基因编辑工具，与其它基因编辑技术相比，它有以下优势:1. 靶向性强：ZFN实现基因组编辑的靶向性高，可以针对特定序列，避免影响目标基因以外的基因。
基因治疗中常用的基因编辑工具
基因治疗中常用的基因编辑工具基因编辑是一种先进的生物技术，可以用于修改和改变生物体的基因组。
在基因治疗中，这种技术被广泛应用于治疗各种遗传性疾病和其他疾病的研究。
为了实现准确的基因编辑，科学家和研究人员使用不同的基因编辑工具。
以下是一些在基因治疗中常用的基因编辑工具。
1. Zinc Finger Nucleases (ZFNs)锌指核酸酶 (ZFNs) 是一种基因编辑工具，能够精确地识别和切割目标 DNA 序列。
ZFNs 由锌指蛋白质结构域和核酸酶构成。
锌指蛋白结构域能够特异性地结合到目标DNA 序列上，然后核酸酶会切割DNA。
这一工具广泛应用于基因治疗中，用于修复或插入特定基因，或者靶向遗传突变。
2. Transcription Activator-Like Effector Nucleases (TALENs)类转录激活因子（TALEs）是一种从细菌中发现的蛋白质，可以与特定的DNA 序列结合。
TALENs 是通过将 TALE 结构域与核酸酶结合而形成的基因编辑工具。
TALENs 能够精确地识别和切割基因组中的目标 DNA 序列，使科学家能够插入、编辑或删除基因。
3. Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR)-Cas9CRISPR-Cas9 是一种基因编辑工具，来源于细菌抵抗病毒侵袭的天然防御系统。
CRISPR 是一段特定序列的重复 DNA，并与 CRISPR 相关蛋白 Cas9 结合使用。
Cas9 蛋白能够识别和切割基因组中特定的 DNA 序列。
科学家通过改变 CRISPR 序列和 Cas9 蛋白的配对，可以定向编辑基因组中的特定位点，包括基因插入、修复和删除等操作。
4. Adeno-Associated Virus (AAV)腺相关病毒 (AAV) 是一种常用的基因分送工具，被广泛用于基因治疗中。
锌指核酸酶技术
市场现状
作为一种可能在临床中得到广泛应用的朝阳技术，锌指核酸酶技术从一开始就被Sangamo生物公司所垄断， 该公司只与部分科研机构合作[16,17]。近期，J. Keith Joung带领的由8个实验室组成的协会提出了制造锌指 核酸酶的开源方式，并建立了66个锌指库，以特异性地针对不同DNA，这对Sangamo生物公司的垄断形成了一定的 威胁[17,18]。对于高科技产业——尤其是研发成本投入较大的生物技术产业——来说，技术创新的成果往往是 一柄双刃剑，它既可能给该技术的最初研发者以利润回报，也可能给最初研发者的竞争者（即后来者）以利润回 报。就锌指核酸酶技术来说，它与大规模的临床应用甚至是实验室研究尚有很大距离，这时对于技术的封锁尽管 保证了先行者的市场份额，但这个市场份额实在微不足道，就连经典意义上的基因治疗也存在市场化的瓶颈 [19,20]。相反地，基础研究由于技术封锁受到了很大限制，独处蓝海的创新者却没有能力开拓这片蓝海。与此 相比，PCR的发明者Mullis无疑是一个成功，而iPS发明者山中伸弥在iPS技术成熟之前也面临着类似的挑战。
锌指核酸酶技术
特异性DNA识别结构域—
01 基本原理
03 总结
目录
02 市场现状 04 参考文献
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
无论是从生命科学的基础研究角度考虑、还是从临床医学的基因治疗领域考虑，研究者确实迫切地需要一种 能够定向性重组染色体DNA的技术。一言以蔽之，锌指核酸酶技术的核心设计思想是把两个有特定功能的结构 域——一个特异性识别模块和一个功能模块——进行了巧妙的嵌合[1,2,10]。
总结
综上所述，锌指核酸酶技术让我们看到了靶向性重组人类基因组的希望，也正是这一点才能使得浩如烟海的 基础研究成果，真正具有它的基因治疗意义。从读懂基因组到重组人类基因治疗疾病谈何容易？而锌指核酸酶的 贡献则相当于在这座桥梁的最后部分填了一块砖。
基因工程 比较TALEN技术与ZFN技术
基因工程比较TALEN技术与ZFN技术基因工程：比较TALEN技术与ZFN技术引言概述：基因工程是一门利用生物技术改变生物体遗传信息的学科，它在医学、农业和环境领域具有广泛的应用。
在基因工程中，TALEN（转基因活性核酸酶）技术和ZFN（锌指核酸酶）技术是两种常用的基因编辑工具。
本文将比较这两种技术的原理、应用和优缺点。
一、TALEN技术1.1 原理：TALEN技术利用转基因活性核酸酶（TALEN）与DNA特定序列结合，并通过核酸酶活性切割DNA。
TALEN由两个结构域组成，一个是核酸酶结构域，另一个是DNA结合结构域。
DNA结合结构域能够识别并与目标DNA序列结合，而核酸酶结构域则负责切割DNA。
1.2 应用：TALEN技术在基因编辑中被广泛应用。
它可以用于研究基因功能、治疗遗传疾病以及改良农作物品种等。
通过设计特定的TALEN，科学家可以精确地编辑目标基因，实现基因的添加、删除或者修饰。
1.3 优缺点：TALEN技术具有高度的特异性和灵便性，可以实现精确的基因编辑。
然而，TALEN的设计和构建相对复杂，需要合成大量的DNA序列，成本较高。
此外，TALEN技术对于不同目标基因的设计和优化也存在一定的挑战。
二、ZFN技术2.1 原理：ZFN技术利用锌指蛋白（ZFP）与DNA特定序列结合，并通过核酸酶活性切割DNA。
ZFN由两个部份组成，一个是锌指蛋白结构域，另一个是核酸酶结构域。
锌指蛋白结构域能够识别并与目标DNA序列结合，而核酸酶结构域则负责切割DNA。
2.2 应用：ZFN技术在基因工程中也有广泛的应用。
与TALEN技术类似，ZFN 技术可以用于基因功能研究、遗传疾病治疗和农作物改良等领域。
通过设计特定的ZFN，科学家可以实现对目标基因的精确编辑。
2.3 优缺点：ZFN技术具有高度的特异性和效率，可以实现精确的基因编辑。
与TALEN技术相比，ZFN技术的设计和构建相对简单，合成成本也较低。
然而，ZFN技术对于不同目标基因的设计和优化也存在一定的挑战。
分子遗传学中的基因编辑技术及其应用
分子遗传学中的基因编辑技术及其应用随着科技的飞速发展，基因编辑技术已成为分子遗传学领域中的热门研究方向。
基因编辑技术能够准确、高效地修改生物个体的基因结构和功能，为生命科学、农业、医药等领域的研究和应用提供了新的工具和思路。
本文将介绍基因编辑技术的原理、方法和应用。
一、基因编辑技术的原理基因编辑技术的主要原理是利用人工合成的核酸酶靶向特定的基因序列，切断或插入DNA分子，以达到修改基因结构和功能的目的。
常用的基因编辑技术包括锌指核酸酶技术（ZFN）、转录激活样效应核酸酶技术（TALEN）和CRISPR-Cas9技术。
锌指核酸酶技术是利用锌指蛋白与DNA结合的特异性来识别目标基因序列的方法。
将几个不同的锌指蛋白连成一串，即可识别更长的目标序列。
然后将核酸酶连接到锌指蛋白上，通过切断或插入DNA分子来实现基因编辑。
TALEN技术是基于转录激活样效应蛋白的DNA识别和切割机制的。
TALEN蛋白由一个转录激活蛋白结构域和一个核酸酶结构域组成。
识别DNA序列的是转录激活蛋白结构域，核酸酶结构域负责切断或插入DNA分子。
CRISPR-Cas9技术是一种最新、最流行的基因编辑技术。
CRISPR是一种细菌和古菌天然免疫系统，通过攻击外源基因（如病毒）来保护细胞自身。
Cas9是CRISPR系统中的核酸酶，可精准识别和切割目标基因序列。
二、基因编辑技术的方法基因编辑技术的方法主要分为三个步骤：设计和合成靶向结构域、育种和验证。
设计和合成靶向结构域分为三个步骤：选择合适的靶向位点（如编码蛋白质的外显子区域）、设计和合成核酸酶RNA（用于识别和切割DNA分子）以及将核酸酶RNA导入到目标细胞中。
育种步骤包括将靶向核酸酶RNA和Cas9蛋白导入到目标细胞中，然后观察各种基因编辑现象，如缺失、插入、替换和合并等。
此时需要使用断电重组、辅助受体、电穿孔和基因枪等工具来帮助导入靶向核酸酶RNA和Cas9蛋白。
验证步骤是对育种步骤的结果进行验证，包括PCR、序列分析、蛋白质表达等方法。
ZFN
基因组编辑工具锌指核酸酶(ZFN)研究进展——2011生物谷研究盘点作者：towersimper来源：生物谷2011-12-19 10:17:39锌指核酸酶(zinc finger nuclease, ZFN)，又名锌指蛋白核酸酶，不是自然存在的，而是一种人工改造的核酸内切酶(图1)，由一个 DNA 识别域和一个非特异性核酸内切酶构成，其中DNA识别域赋予特异性，在DNA特定位点结合，而非特异性核酸内切酶赋剪切功能，两者结合就可在DNA特定位点进行定点断裂。
图1. 结合到DNA(橙色)上的锌指核酸酶(蓝色)，图片来自维基共享资源，Thomas SplettstoesserDNA识别域是由一系列 Cys2-His2锌指蛋白串联组成，研究还表明每个锌指蛋白识别并结合3′到5′方向DNA链上一个特异的三联体碱基以及5′到3′方向的一个碱基。
锌指蛋白源自转录调控因子家族(图2)，在真核生物中从酵母到人类广泛存在，其共有序列为(F/Y)-X-C-X2−5-C-X3-(F/Y)-X5-ψ-X2-H-X3−5-H，其中X为任意氨基酸，ψ是疏水性残基。
它能形成α-β-β二级结构，每个锌指蛋白含有单个锌离子，这个锌离子位于双链反平行的β折叠和α螺旋之间，并且与β折叠一端中的两个半胱氨酸残基和α螺旋螺旋羧基端部分的两个组氨酸残基形成四配位化合物，此外α螺旋的16氨基酸残基决定锌指的DNA结合特异性，骨架结构保守。
图2. Cys2-His2锌指单元首先是在TFIIIA中鉴定出的。
TFIIIA含有9个大约30个氨基酸基序的串联重复。
现已公布的从自然界筛选的和人工突变的具有高特异性的锌指蛋白可以识别所有的GNN和ANN以及部分CNN和TNN三联体。
多个锌指蛋白可以串联起来形成一个锌指蛋白组识别一段特异的碱基序列，具有很强的特异性和可塑性，很适合用于设计ZFNs。
与锌指蛋白组相连的非特异性核酸内切酶来自FokI羧基端96个氨基酸残基组成的DNA剪切域。
ZFN在基因工程中的应用研究
ZFN在基因工程中的应用研究Zinc finger nucleases（锌指核酸酶，简称ZFN）是一种新型的基因工程工具，可用于精确编辑DNA序列。
ZFN在疾病基因治疗、转基因植物改良、动物基因改造等方面都有广泛的应用。
本文将就ZFN的科学原理、应用领域、优点及挑战等方面进行探讨。
一、ZFN的科学原理ZFN是由锌指蛋白和核酸内切酶组成的融合蛋白，其中锌指蛋白可结合到特定的DNA序列上，从而引导核酸内切酶在该位置上进行切割。
ZFN的核心原理便是通过控制核酸内切酶的切割位置和方向，来改变DNA序列及其功能。
二、ZFN的应用领域1. 基因疾病治疗ZFN通过编辑人类基因组来治疗遗传性疾病，目前已经有多项ZFN相关的临床试验正在进行。
例如，2017年FDA批准了一种ZFN技术疗法，用于治疗严重的常染色体显性多囊肾病（ADPKD），这也是目前唯一一种获得批准的基因治疗药物。
2. 转基因植物改良ZFN技术可用于植物基因改造，从而提高耐逆性、增加产量和提高产品品质等。
例如，ZFN可用于突变水稻中的AGL8和OsCKX2基因，从而实现水稻花期调控和扩大籽粒大小。
3. 动物基因改造ZFN可用于动物基因改造，以实现更好的药物生产、疾病模型和品种改良等。
例如，科学家们使用ZFN技术产生了MTTP敲出豚鼠模型，可以用于研究胆固醇代谢途径，同时可用于筛选药物。
三、ZFN技术的优点1. 高效性：ZFN可精确地识别和切割目标DNA序列，有效避免了随意突变的可能性。
2. 精准性：ZFN只针对目标DNA序列进行改变，避免了对其他DNA序列的影响。
3. 单次操作可完成多个改变：ZFN可同时实现多个DNA序列的编辑，使得基因工程工作起来更加经济、高效。
4. 临床上获得成功：目前，ZFN技术也被广泛应用于基因疾病治疗，部分病例获得了成功的应用，为基因疾病的治愈带来了新的希望。
四、ZFN技术的挑战1. 研究成本高：ZFN技术相对较新，需要进行大量的研究及优化才能较好地应用于生物学研究中。
锌金属蛋白酶
锌金属蛋白酶锌金属蛋白酶是一类特殊的蛋白酶，它们以锌离子作为连接结构，能够与多种酶相似的活性链接，参与DNA和RNA的修饰或改造，从而发挥其功能。
它们不仅可以用于修饰细胞内的DNA，RNA和蛋白质，还可以用于修饰表观遗传学因子。
研究发现，锌金属蛋白酶的作用主要有三个：一是惰性结合，指的是与链状酶结合时，不能改变酶的活性；二是催化作用，指的是锌金属蛋白酶可以促进或抑制酶的活性；三是调控作用，指的是锌金属蛋白酶可以调节酶的活力。
锌金属蛋白酶在催化酶反应过程中发挥着重要作用。
一方面，它们可以迅速有效地促进酶活性，减少反应时间和进行特定活性的反应；另一方面，它们还可以抑制酶反应，减少多余的反应。
因此，锌金属蛋白酶有助于改变和控制反应，从而达到比传统方法更高效率的反应结果。
此外，它们还可以与其他蛋白质联合，在共同作用下调节细胞生物学功能，从而实现特定的生物学效果。
目前，锌金属蛋白酶已经在许多不同的生命科学领域中发挥了重要的作用，比如基因组学、蛋白质组学和信号转导研究，甚至可以深入研究细胞的命运。
在临床药物开发方面，锌金属蛋白酶也有很多应用，例如用于蛋白质工程的药物生物合成，用于抗癌的抗癌剂开发，以及用于医疗药物的测试和诊断。
随着社会经济的发展，人们越来越关注健康与安全问题，这些问题又涉及到各种研究领域，如生物医学和生物技术领域。
在这种情况下，锌金属蛋白酶在各个领域均具有重要作用，无论是在实验室分析中做简单的基础研究，还是在应用研究中发挥大量作用，它们都能够提供有效的、重要的信息，影响着各种研究领域的发展。
锌金属蛋白酶的研究具有极其重要的意义，正是由于它们在生物过程中发挥重要作用，使得对它们进行深入研究变得十分必要。
研究发现，锌金属蛋白酶具有多种不同的作用机制，其作用受到不同类型的信号刺激，这种作用机制也能够在一定程度上影响细胞的生物功能。
此外，这类蛋白酶也可以用来研究表观遗传学因子的表达，从而探究它们对基因调控和细胞功能的影响。
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关键词: 锌指结构域 ; 锌指蛋白 ; 锌指蛋白核酸酶 ; 同源重组 ; 基因打靶
The mechanism and application of zinc finger nucleases
ZHONG Qiang , ZHAO Shu-Hong
Key Laboratory of Agricultural Animal Genetics, Breeding and Reproduction of Ministry of Education of China, College of Animal Science and Technology, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070, China
HEREDITAS (Beijing) 2011 年 2 月 , 33(2): 123― 130 ISSN 0253-9772
综述
DOI: 10.3724/SP.J.1005.2011.00123
锌指蛋白核酸酶的作用原理及其应用
钟强 , 赵书红
华中农业大学农业动物遗传育种与繁殖教育部重点实验室 , 农业部猪遗传育种重点开放实验室 , 武汉 430070
Abstract: Due to specific recognization of DNA sequences and designability, zinc finger nucleases (ZFN) has been used in knock in and knock out genes. Because of high ratio of homologous recombination of DSB-GT induces by ZFN, ZFN technology has been considered as the most powerful tool for gene modification. It has been successfully used at cell or embryo levels in plants and animals. Under the rapid development of high affinity zinc finger protein (ZFP), this technique will be applied to genetic engineering and breeding extensively in the future. This review discussed the DNA recognization mechanism and double strand break gene targeting (DSB-GT) of zinc finger nucleases (ZFN). Some application examples of ZFN were summarized.
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HEREDITAS (Beijing)
2011
第 FP[11]。由于高亲和 力并不等于高特异性
[12]
域中 14~25 位的氨基酸 , 但没有确切的实验证据 , 直到 Pavletich 等 [19]测定了 ZIF268 与 DNA 绑定的晶 体结构 , 锌指结构对 DNA 的识别机制才有了比较清 晰的认识。 如图 1A 所示 , 锌指结构域的 α-螺旋嵌入 到 DNA 分子的大沟中 , 螺旋上的 ARG46、 HIS49 和 THR52 侧链与大沟中的 3′ 到 5′ 方向的 DNA 链相互 识别 , 这 3 个氨基酸位于 α-螺旋的 -1、 3、 6 位氨基 酸 , 因此 Pavletich 等 [19]提出的识别模式被称为 -1、 3、 6 模式 , 可以识别位于 DNA 上同一条链上 3′ 到 5′ 方向连续的 3 个碱基。这个识别模式被实验证实部 分正确 [20]。随后 Fairall 等 [21]测得了 ZIF268 与 DNA 绑定的晶体结构 , 锌指结构域的 α-螺旋上的 1、 2、 3、 6 位氨基酸可以与 DNA 形成氢键 , 其中 2 位的氨 基酸识别 5′ 到 3′ 方向 DNA 链上的一个碱基 , 如图 1B 所示 , α-螺旋上的 ARG152、 ASP154、 ASN155 和 ALA158 氨基酸侧链与 DNA 形成氢键 , 可以识别 4 个碱基 , 因此锌指结构域识别 DNA 碱基的模式调 整为 -1、 2、 3、 6 模式 [22], 这个模式通过 DNA 碱基 替换实验得到证实 [20, 22]。 根据以上的分析 , 发现每个锌指结构域可以识 别 3′ 到 5′ 方向 DNA 链的 3 个碱基以及 5′ 到 3′ 方向 的一个碱基。 是否可以根据这一规律设计与 DNA 序 列特异结合的锌指结构呢？答案是肯定的 , Isaland 等 [23] 使用噬菌体展示技术 (Phage display) 鉴定了与 靶 DNA 序列具有较高亲和力的锌指结构 , 该实验表 明根据已知的 DNA 序列可以找到与之结合的锌指结 构。由于一个锌指结构域只能识别 3 bp (Base pair),
。 该项技术已经被成功用于动植物基
因改造实验中 , 研究者根据靶 DNA 序列设计特异性 的锌指蛋白 , 然后用锌指蛋白核酸酶 (Zinc finger
收稿日期 : 201007; 修回日期 : 20101107 基金项目 : 国家转基因重大专项与教育部创新团队项目 ( 编号： IRT0831)资助 作者简介 : 钟强 , 博士 , 研究方向：生物信息学。 E-mail: zqiang320@ 通讯作者 : 赵书红 , 教授 , 博士 , 研究方向：动物分子生物学与育种。 E-mail: shzhao@
第2期
钟强等 : 锌指蛋白核酸酶的作用原理及其应用
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对于全基因组来说至少有 18 bp 才能确保靶位点的 特异性。 因此需要有 8~10 个锌指结构连在一起才能 实现长片段的识别。因为 Doyon 等 用 8 个锌指结 构域实现了 DNA 的特异识别 , 而且没有脱靶现象 , 因此可以认为 8~10 个锌指结构域就可以实现靶位 点的特异识别。随着 DNA 加长 , 9 bp 并不对应 3 个 锌指结构域 , 因此 Moore 等 [24]的实验设计了两种策 略来确定锌指结构域 : (1) 3×2F, 这种方法在靶序列 中 , 每隔 6 个碱基跳过一个碱基 , 两对锌指结构域 之间插入一个甘氨酸 (GLY)。 (2) 2×3F, 这种方法在 靶序列中 , 每隔 9 个碱基跳过两个碱基 , 两个三联 体锌指结构域之间插入甘氨酸-丝氨酸-甘氨酸 (GLY-SER-GLY)。 实验表明 2×3F 方法设计的锌指蛋 白对靶位点的突变非常敏感 , 因此 2×3F 方法设计的 锌指蛋白对靶序列的识别特异性更高。
[1~3]
nucleases, ZFN) 定点突变 DNA, 并引入外源基因 , 在整个实验 该技术具有非常高的基因整合效率 [4~8]。 流程中 , 设计特异性的锌指蛋白 (Zinc finger protein, ZFP) 是最关键的环节 , 应用大肠杆菌双杂交报告系 统 (Bacterial cell based two-hybrid (B2H) reporter system)筛选高亲和力的 ZFP 是目前最为流行的方法[9, 10]。 这些高亲和力的 ZFP 被提交到公共的数据库中 , 以
1
锌指结构域对 DNA 序列的特异性识别
锌指结构域是转录因子用于识别靶 DNA 的蛋
白结构域 , 因为这种蛋白结构域络合了一个锌离子 , 所以称之为锌指结构域 (Zinc finger)。 Miller 等 [17]最 早发现并阐述了锌指结构域的功能 , 他们发现全长 为 344 个氨基酸的转录因子 (Transcription Factor IIIA, TFIIIA)序列中 , 13~276 位氨基酸含有 9 个锌指 结构域 , 锌指结构域由 30 个氨基酸组成 , 每个锌指 结构域中 8 和 13 位的半胱氨酸以及 26 和 30 位的组 氨酸非常保守 , 他们可以络合锌离子。因此这种类 型的锌指结构域被称为 C2H2, 另外还有 4 个位点都 是半胱氨酸的锌指结构域 , 被称为 Cys4。 C2H2 型的 锌指结构广泛存在于转录因子中 , 人的基因中有 3% 的基因编码含有 C2H2 型的锌指结构域的蛋白 Miller 等
, 因此为了减小 ZFP 的脱靶
[13]
率 , 降低 ZFN 造成的细胞毒性和基因毒性 , 迫切需 要设计出高特异性的 ZFP 。目前已经有研究者采
[14~16]
用计算生物学方法设计高特异性的 ZFP
, 随着
越来越多的研究和生产需要 , 类似的方法还会不断 出现。作为遗传研究工作者有必要深入的了解 ZFN 技术的原理和发展趋势 , 以便于及时掌握和改进该 项技术, 从而为研究和生产服务。本文综述了锌指蛋 白对 DNA 序列的特异性识别和 ZFN 的工作原理 , 同时还对部分 ZFN 应用实例进行了概述。
摘要: 锌指蛋白核酸酶 (Zinc finger nucleases, ZFN) 因其能特异性识别并切割 DNA 序列以及可设计性 , 被
用于基因定点突变和外源基因定点整合。目前 , ZFN 技术以其准确的靶位点设计能力和诱发高效率基因打靶的 优势 , 越来越受到基因改造研究者的重视 , 已经成功应用于动植物细胞、胚胎的基因改造。随着鉴定靶 DNA 高亲和力的锌指蛋白 (Zinc finger protein, ZFP)实验技术日渐成熟 , 可以预见到不久的将来这项技术会在基因工 程和育种中得到广泛应用。文章介绍了锌指蛋白识别 DNA 靶位点和 ZFN 介导的基因打靶 (Double strand break gene targeting, DSB-GT)的原理 , 同时还综述了目前 ZFN 技术用于基因改造的研究进展。
[4]
作为模板, 这个氨基酸序列框架被证明是高效的[25]。 如图 2 所示 , 锌指结构域中有 7 个氨基酸用于识别 三联体碱基 , 因此可以通过改变这些氨基酸来提高 锌指结构域识别靶 DNA 的特异性。 TGEK 序列用于 连接相邻的两个锌指结构域。