简化基因组测序RAD技术
基于RAD-seq_的菜心InDel_标记开发及应用
广东农业科学Guangdong Agricultural Sciences 2024，51（3）：91-102 DOI:10.16768/j.issn.1004-874X.2024.03.009许玉富，黄依琳，李荣华，黄红弟，郭少龙，李光光，郭培国，夏岩石. 基于RAD-seq的菜心InDel标记开发及应用［J］. 广东农业科学，2024，51（3）：91-102.XU Yufu, HUANG Yilin, LI Ronghua, HUANG Hongdi, GUO Shaolong, LI Guangguang, GUO Peiguo, XIA Yanshi. Development and application of InDel markers in flowering Chinese cabbage based on RAD-seq［J］. Guangdong Agricultural Sciences, 2024，51（3）：91-102.基于RAD-seq的菜心InDel标记开发及应用许玉富1，黄依琳1，李荣华1，黄红弟2，郭少龙2，李光光3，郭培国1，夏岩石1（1.广州大学生命科学学院/广东省植物适应性与分子设计重点实验室，广东 广州 510006；2.广东省良种引进服务公司，广东 广州 510091；3. 广州市农业科学研究院，广东 广州 510308）摘 要：【目的】开发多态性丰富的的InDel分子标记，为菜心育种提供研究基础。
【方法】以Chiifu-401-42的基因组序列为模板，利用4份菜心材料的RAD-seq重测序数据，在全基因组范围内鉴定InDel位点。
利用生物信息学方法筛选4份菜心材料间具有潜在多态性的InDel 位点，挑选分布于10条染色体的80个InDel 位点设计引物，对55份菜心种质材料进行遗传多样评价。
【结果】通过与参考基因组序列比对，在4份菜心材料的重测序数据中共鉴定出84 510个InDel位点，其中插入/缺失长度大于5 bp的3 609个InDel位点在4份菜心材料间具有潜在多态性。
景观基因组学方法在保护生物学研究中的应用与前景
DOI ：10.11913/PSJ. 2095-0837. 23166王天瑞，邱英雄. 景观基因组学方法在保护生物学研究中的应用与前景[J ]. 植物科学学报，2023，41（6）：741−750Wang TR ，Qiu YX. Application and prospects of landscape genomics in conservation biology [J ]. Plant Science Journal ，2023，41（6）：741−750景观基因组学方法在保护生物学研究中的应用与前景王天瑞1, 2，邱英雄1 *（1. 中国科学院武汉植物园，武汉 430074； 2. 中国科学院大学，北京 100049）摘 要： 生物多样性是人类生存与发展的基础，全球气候的快速波动正对生物多样性造成严重威胁。
保护生物学旨在研究全球生物多样性面临的危机及如何更加有效地进行生物多样性保护。
景观基因组学（Landscape ge-nomics ）研究通过解析基因型与环境因子之间的关联性，揭示物种响应气候变化的适应性遗传变异与适应性进化，推动了保护生物学的快速发展。
本文简要阐述了景观基因组学解析物种适应性遗传变异空间分布格局的主要研究方法，总结了近年来景观基因组学方法在动植物保护研究中的应用案例，并针对景观基因组学方法在保护生物学研究中存在的问题及未来研究方向提出了建议。
关键词： 生物多样性；气候变化；适应性遗传变异；景观基因组学；保护生物学中图分类号：Q346 文献标识码：A 文章编号：2095-0837（2023）06-0741-10Application and prospects of landscape genomics inconservation biologyWang Tian-Rui1, 2，Qiu Ying-Xiong1 *（1. Wuhan Botanical Garden , Chinese Academy of Sciences , Wuhan 430074, China ； 2. University of Chinese Academy of Sciences ,Beijing 100049, China ）Abstract ：Biodiversity serves as the foundation of human survival and development yet faces significant threats from rapid global climate fluctuations. Conservation biology seeks to address this global biodiversity crisis by developing more effective conservation strategies. By analyzing the relationship between genotypes and environmental factors, landscape genomics can reveal the adaptive genetic variations and evolutionary responses of species to climate change, leading to the rapid development of conservation biology. In this re-view, we discuss the major methodologies used to analyze the distribution patterns of adaptive genetic varia-tion in species. We also summarize recent findings in landscape genomics as applied to the conservation of plants and animals. Finally, we address current challenges and suggest future research directions in the use of landscape genomics for conservation biology, offering targeted recommendations.Key words ：Biodiversity ；Climate change ；Adaptive genetic variation ；Landscape genomics ；Conserva-tion biology生物多样性作为地球上生命体的重要特征之一，是人类社会赖以生存和发展的物质基础[1, 2]。
动植物全基因组重测序简介
全基因组重测序是对已知基因组序列的物种进行不同个体的基因组测序，并在此基础上对个体或群体进行差异性分析。
基于全基因组重测序技术，人们可以快速进行资源普查筛选，寻找到大量遗传变异，实现遗传进化分析及重要性状候选基因的预测。
随着测序成本降低和拥有参考基因组序列物种增多，全基因组重测序成为动植物育种和群体进化研究迅速有效的方法。
简化基因组测序技术是对与限制性核酸内切酶识别位点相关的DNA进行高通量测序。
RAD-seq（Restriction-site Associated DNA Sequence）和GBS （Genotyping-by-Sequencing）技术是目前应用最为广泛的简化基因组技术，可大幅降低基因组的复杂度，操作简便，同时不受参考基因组的限制，可快速鉴定出高密度的SNP位点，从而实现遗传进化分析及重要性状候选基因的预测。
简化基因组技术尤其适合于大样本量的研究，可以为利用全基因组重测序技术做深度信息挖掘奠定坚实的基础。
全基因组重测序和简化基因组测序技术可广泛应用于变异检测、遗传图谱构建、功能基因挖掘、群体进化等研究，具有重大的科研和产业价值。
产品脉络图。
简化基因组测序RAD技术
基于酶切的简化基因组测序(RAD)
1. 对于群体进化研究，个体的混样策略是怎样的？
答：如果更关注群体间的遗传多样性差异，希望消除群体内个体遗传差异带来的干扰，可以采用群体内个体混样的策略，我们会进一步在生物信息分析流程中采用优化的群体内SNP纠错与过滤程序达到分析目的。
2. 我们的RAD-Seq建库测序策略是怎样的？
答：建库策略选择基于综合考虑序列碱基质量、测序成本和物种基因组情况，主要有Single‐end 50 bp和Pair‐end 90 bp。
对于有参考基因组的物种，我们建议采用PE90文库测序。
对于无参考基因组的物种，则建议采用SE50文库测序。
3. RAD-Seq测序结果受哪些因素影响？测序成功的标准是什么？
答：设备、耗材、操作问题等方面都会对测序的结果造成影响。
测序成功标准包括：reads 数达标，错误率低，Q20高等。
群体进化-基于简化基因组测序
X. malinche X. birchmanni
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
B
X. nezahualcoyotl
X. montezumae
X. nigrensis
X. multilineatus
X. pygmaeus
X. continens
C
X. alvarezi
X. signum
X. mayae
X. hellerii
X. kallmani X. mixei
minor allele frequency
Sword Intermediate No sword
X. meyeri
X. gordoni
X. couchianus
X. variatus
X. evelynae
A
X. milleri
X. xiphidium
X. andersi
X. maculatus
X. cortezi
参考基因组未知
tag聚类、局部组装 SNP检测及统计 构建系统进化树 群体主成分分析 群体遗传结构分析
标准分析为90天，个性化分析需根据项目实际情况进行评估
案例解析
［案例一］ RAD-seq 研究剑尾鱼属的系统发生关系[1] 剑尾鱼属（花鳉科）包括26种来自中美洲的热带小型淡水鱼，外 型上最吸引人的莫过于雄鱼的剑尾。关于剑尾鱼属的系统发生关 系一直存在争议，本文用RAD-seq来解决这一问题。26种鱼每种 测5个个体，作为外群的3种鱼每种测2-7个个体，共测序143个个 体，平均每个个体每个位点覆盖深度为15X，找到约66,000个 SNP，以从未有的精度构建了剑尾鱼属的系统发育树。
简化基因组-GBS
GBS 300ng 96 或 96 的倍数 PCR 扩增选择片段大小 200Mb
略少 更低
2、 什么情况下适合体的物种，有无参考基因组均可；尤其适合重复序
列较多的物种，如玉米、高粱等。 3、GBS 为什么比较适合重复序列高的物种？
因为 GBS 选择的酶 ApekI 是一种甲基化敏感酶，位于高重复区域的酶切识别位点容易发 生甲基化，不能被 ApekI 切开，因此可以避开高重复区域，得到的标记有效性更高。
简化基因组-GBS
1、GBS 和 RAD 都是简化基因组技术，区别在哪里？
GBS 和 RAD 都是基于酶切处理的简化基因组技术，主要区别如下：
区别 DNA 起始量 Pooling 数目 片段大小选择方法
测序量 SNP 成本
RAD 1ug 4/8/16/24 随机打断选择片段大小 根据基因组大小而定 较多 低
新一代测序领域中的RAD
会议综述新一代测序领域中的RADH. C. ROWE, S. RENAUT and A. GUGGISBERGRAD技术最初用于低成本的芯片分型原料(Miller et al. 2007)。
但是第二代测序技术的到来以及大幅度成本的降低，使得短片段测序和RAD的分型技术结合起来(Baird et al. 2008)。
RAD测序先将接头连接在经过酶切的DNA片段，然后再进行剪切，将测序重点放在标记过的限制性位点，而不是在整个基因组上随机的测序。
这种方法极大的提高了给定序列位点的覆盖范围，提高了碱基识别的可信性和在多样本中同一位点被测序的可能性。
ＲＡＤ测序提供了一个开发ＳＮＰ极为有效的的方法。
It was initially developed by Dr. Eric Johnson at the University of Oregon and later expanded into commercial services for plant (Floragenex)and ‘other’(Biota Sciences) genome studies. This ‘centre of origin’has led to the strong representation of fish and plants in studies employing RAD sequencing, as reflected in the organization of the symposium into ‘Plant Genom-ics’and ‘Marine and Conservation Genomics’sections,capped by a ‘Technology and Bioinformatics’section 然而随着ＲＡＤ及其类似技术在科学界的推广，论坛形式更多是关于它的数据应用而不是生命研究。
Illumina平台测序原理及常见测序文库构建
应用： 转录本的种类和基因 定量 基因的转录结构 可变剪切 发现新的转录本
真核生物
总RNA
原核生物
利用Oligo (dT)富 集mRNA
去除 rRNA
将mRNA 随机打断成 ~200 nt
桥式PCR：
冲走单链DNA模板，以合成的第一链 为模板进行35循环的桥式PCR
线性化：
将与P5接头连接的DNA链从Flow Cell 上去除
阻断3’–OH： 防止在后续测序过程中继续延伸DNA链
杂交测序引物
DNA模板杂交和一链合成
单链DNA分子与FlowCell 表面的对应接头杂交
以杂交的单链DNA为模板， FlowCell上的接头ng Primer
此单链部分与 FlowCell表面上P7接
头相同
此单链部分与 FlowCamples
cBot HiSeq2500
MiSe液相杂交
• 液相杂交是通过在溶液中， 利用链碱基配对的原理， 将DNA片段与探针杂交， 然后洗脱，富集目的片段。
Exon测序
特点
• 优点：
• 不足：
• 1、 与全基因组测序相比，外 显 • 1、与全基因组测序相比，不能
子测序具有测序覆盖度更深、 数 检测到基因组内较大的结构性
4种 Fl-NTP’s +
聚合酶
拍照，收集信号
去阻断，切除荧光基团
X 36 - 151
可逆终止化学反应
• 一次加入4种修饰的dNTP(可逆终止子) • 准确度高 • 可以得到同聚物序列
• 合成 • 照相，收集信号 • 去阻断，切除荧
光基团
下一个碱基合成
基因组重测序技术及其应用
报告人：朱淼
背景
DNA重测序产品应用对象
人类基因组
植物/ 动物基因组
医学 / 疾病研究 农业 / 分子育种 基因组学 / 比较基因组学 遗传学/ 群体遗传学
DNA 测序产品
全基因组重测序产品
外显子测序产品 简化基因组产品（RAD－seq） 基因组从头测序产品
参考基因组
Ensembl数据库收录的已经测序的动植物
参考基因组 /info/about/species.html
全基因组重测序产品
基因组重测序
群体遗传进 杂交群体基 结构变异相 疾病相关研 化研究 因分型 关研究 究
全基因组重测序产品
一、样本要求
样品类型：DNA 样品； 样品需求量（单次）≥ 30μg 样品浓度：≥ 100 ng/μL 样品纯度：OD260/280 =1.8～2.0
外显子重测序产品
分析内容
测序数据统计及质量评估 SNP检测及在基因组中的分布 InDel检测及在基因组的分布 孟德尔遗传疾病高级信息分析 癌症的高级信息分析 复杂疾病的高级信息分析
外显子重测序产品
在孟德尔遗传疾病研究应用
第5指综合征（Coffin-Siris syndrome，简称CSS）是一种罕见的先 天性疾病，由于患者父母多为健康个体 ，CSS通常被认为是一种隐性遗传病。 CSS遗传机制的阐明有待于对其致病基 因及突变的鉴定。本研究使用外显子组 测序方法成功的找到了CSS致病基因。
研究目的：对NCPC10086进行de novo测序，然后与Wisconsin54-1255进行比
较基因组分析 ，来揭示青霉菌高产机制
我们的案例
杭州市疾病预防控制中心
简化基因组数据分析实战（一）
简化基因组数据分析实战（一）每当过年过节的时候，我都会想起来李笑来说的一些话，当别人放假的时候，他会默默找个宾馆看书办公，于是他就默默比别人多活了好多时间。
所以放假回家之后，我先处理了一篇回家当天公司才给我的回交混池数据，然后开始学习如何分析简化基因组。
大概会在这7天时间内全部更新出来。
这里感谢我那台在实验室不眠不休的电脑，不然，我的8G内存的电脑根本带不动。
尽管目前已经有大量物种基因组释放出来，但还是存在许多物种是没有参考基因组。
使用基于酶切的二代测序技术，如RAD-seq，GBS，构建遗传图谱是研究无参考物种比较常用的方法。
Stacks就是目前比较通用的分析流程，能用来构建遗传图谱，处理群体遗传学，构建进化发育树。
这篇教程主要介绍如何使用Stacks分析基于酶切的二代测序结果，比如说等RAD-seq，分析步骤为环境准备，原始数据质量评估，多标记数据分离，序列比对（无参则需要进行contig de novo组装），RAD位点组装和基因分型，以及后续的标记过滤和格式转换。
适用范围：•酶切文库类型：ddRAD, GBS, ezRAD, quad-dRAD和Rapture。
但是stacks更适用于RAD-seq，GBS推荐TASSEL。
如下是“Genome-wide genetic marker discovery and genotyping using next-generation sequencing”对几种常见的建库方法的总结•测序类型：双酶切文库双端测序数据或单端数据•测序平台： illumina， IonTorren局限性：•不能用于普通的随机文库测序•不能适用单酶切文库的双端测序数据（stacks 2.0可以）•无法用于混池测序，也不适合与多倍体，因为stacks在组装时假定物种为二倍体•对于深度不够，且错误率比较高的数据，它也没辙，所以建议深度在20x以上分析者要求：掌握基本的Unix命令行，会基本集群操作，熟悉R 语言编程。
烟草抗青枯病定位的研究进展
130ECOLOGY 区域治理作者简介：陶俊杰，生于1996年，研究生，研究方向为烟草青枯病。
烟草抗青枯病定位的研究进展广州大学 陶俊杰摘要：烟草青枯病在烟草种植中的一种毁灭性疾病，定位出抗烟草青枯病相关基因能有效应对日渐严重的青枯病。
烟草抗青枯病遗传由多基因控制，目前一般用连锁分析、关联分析和连锁与连锁不平衡分析进行定位。
本文较为全面地介绍了在烟草抗青枯病定位相关的研究，这些研究极大促进了分子标记辅助选择育种的进程。
关键词：烟草青枯病；连锁分析；关联分析；连锁与连锁不平衡分析中图分类号：B025.4文献标识码：A文章编号：2096-4595（2020）35-0130-0003烟草青枯病是由青枯青枯雷尔氏菌（Ralstonia solanacearum）引起的具有毁灭性的土传性疾病（孔凡玉等，1995），且有从南向北蔓延的趋势。
目前对烟草青枯病主要以防治为主，但无论化学防治或生物防治，都面临农药残留、破坏土壤微生态环境、效果不好等问题（李凯和袁鹤，2012；张永春等，2007）。
选育出对抗青枯病的烟草品种是应对青枯病最经济有效的方法。
研究表明，烟草的主要农艺性状及抗病性的遗传呈现出复杂性，是由多基因控制的数量性状（Yang 等,2012）。
而烟草抗青枯病性状较为复杂，不同研究的遗传效应差异较大（高加明，2010；张振臣，2017）。
当前对多基因控制性状的研究一般利用家系群体开展的连锁分析、自然材料开展的关联分析和两种群体结合的连锁与连锁不平衡分析的方法。
一、烟草的遗传图谱与烟草青枯病的连锁分析Nish 等（2003）首次用连锁分析的方法对烟草青枯病抗病基因进行定位。
作者利用青枯病抗病品种W6和在外观上相似的易感品种Michinoku 1为父母本，构建出拥有125个后代的双单倍体群体（double hapolid ，DH）。
利用3072对引物对各材料进行扩增，绘制出含有117个AFLP 标记、10个连锁群的构建连锁图，全长383cm ，各标记间平均3.3cm 。
生物知识汇总英文名词缩写
1 HTS高通量测序技术（High-throughput sequencing，HTS）2 WGS全基因组测序3 Chip染色质免疫共沉淀（ChromatinImmunoprecipitation，ChIP）4 CHIRP ( Chromatin Isolation by RNA Purification )是一种检测与RNA绑定的DNA和蛋白的高通量测序方法。
方法是通过设计生物素或链霉亲和素探针，把目标RNA拉下来以后，与其共同作用的DNA染色体片段就会附在到磁珠上，最后把染色体片段做高通量测序，这样会得到该RNA能够结合到在基因组的哪些区域，但由于蛋白测序技术不够成熟，无法知道与该RNA结合的蛋白。
5 RIPRNA Immunoprecipitation是研究细胞内RNA与蛋白结合情况的技术，是了解转录后调控网络动态过程的有力工具，能帮助我们发现miRNA的调节靶点。
这种技术运用针对目标蛋白的抗体把相应的RNA-蛋白复合物沉淀下来，然后经过分离纯化就可以对结合在复合物上的RNA进行测序分析。
6 CLIP-seqCLIP-seq,又称为HITS-CLIP，即紫外交联免疫沉淀结合高通量测序(crosslinking-immunprecipitation and high-throughput sequencing)7 SNP单核苷酸多态性singlenucleotide polymorphism，SNP8 SNV单核苷酸位点变异。
单核苷酸变异是一种体细胞突变（somatic mutation），称做SNV9 INDEL (基因组小片段插入）基因组上小片段（>50bp）的插入或缺失，形同SNP/SNV。
10 CNV(copy number variation)基因组拷贝数变异11SV (structure variation)基因组结构变异12 RPKMRPKM,Reads Per Kilobase of exon model per Million mapped reads, is defined in thisway [Mortazavi etal., 2008]:每1百万个map上的reads中map到外显子的每1K个碱基上的reads个数。
烟草青枯病抗性的全基因组关联分析
中国烟草科学Chinese Tobacco Science 2020,41(5):1-7 DOI: 10.13496/j.issn.1007-5119.2020.05.001 烟草青枯病抗性的全基因组关联分析何斌彬1,2，耿锐梅1，杨爱国1，任民1*（1.中国农业科学院烟草研究所，青岛 266101；2.中国农业科学院研究生院，北京 100081）摘要：为发掘并定位烟草青枯病抗性遗传位点，利用RAD简化基因组重测序技术（RAD-seq），以219份遗传多样性较高的国内外烟草品种作为供试自然群体，利用田间病圃鉴定供试材料的青枯病抗性，通过全基因组关联分析（GWAS），发掘抗病基因组区段，并进行抗病候选基因预测。
结果表明，筛选鉴定到8个高抗青枯病的烟草品种，获得了384 904个高质量的SNP位点，对烤烟群体的基因组连锁不平衡衰减（LD）距离进行了估算，平均为256 kb。
在烟草基因组内发掘到1个与烟草青枯病抗性变异显著关联的区段，峰值SNP在17号染色体的23 977 382 bp处，p=6.196×10-7，能解释14.29%的表型变异，在该区段内预测到4个抗病候选基因。
本研究为烟草青枯病抗病基因克隆及分子育种提供了较为明确的基因组定位信息。
关键词：烟草；种质资源；青枯病；SNP；全基因组关联分析Genome-wide Association Study of Resistance to Tobacco Bacterial WiltHE Binbin1,2, GENG Ruimei1, YANG Aiguo1, REN Min1*(1. Tobacco Research Institute of Chinese Academy of Agricultural Sciences, Qingdao 266101, China; 2. Graduate School of ChineseAcademy of Agricultural Sciences, Beijing 100081, China)Abstract: In order to discover and locate the genetic locus of resistance to tobacco bacterial wilt, using restriction site-associated DNA sequencing (RAD-seq) technology, and 219 domestic and foreign tobacco varieties with high genetic diversity as the natural population, the resistance to bacterial wilt of the tested materials was identified by field disease nursery, through genome-wide association study (GWAS) to discover disease-resistant genome segments and predict candidate genes for disease resistance. The results showed that 8 tobacco varieties with high resistance to bacterial wilt were identified, and 384 904 high-quality SNP loci were obtained. The distance of genome linkage disequilibrium (LD) attenuation of flue-cured tobacco population was estimated to be 256 kb in average. A segment significantly associated with tobacco bacterial wilt resistance variation was discovered in the tobacco genome, with the peak SNP at 23 977 382 bp on chromosome 17, and the p=6.196×10-7, which can explain 14.29% of the phenotype variation. Four disease resistance candidate genes were predicted in this segment. This study provides genomic location information for the next step of tobacco bacterial wilt resistance gene cloning and molecular breeding.Keywords: tobacco; germplasm resources; bacterial wilt; SNP; genome-wide association study烟草青枯病是由青枯雷尔氏菌（Ralstonia solanacearum）侵染引起的一种土传细菌病害，可侵染50多科的数百种植物[1]，在世界范围内均有发生，近年在我国危害程度逐渐上升，且发病区域有向北蔓延的趋势[2]，已成为我国烟草生产中的主要病害之一。
07-RAD试卷答案.pdf
一、名词解释1.系统发育树（phylogenetic tree，又称evolutionary tree进化树）：是描述群体间进化顺序的分支图或树，表示群体间的进化关系。
2.主成分分析（PCA）：是指将多指标化为少数几个综合指标的一种统计分析方法，能够反映原始变量的绝大部分信息。
3.群体结构：是指一个群体内部的基因频率在不同子群体之间存在着系统性的差异。
二、填空题1.我们公司现有的两种简化基因组测序技术分别是RAD和dd-GBS。
2.简化基因组的主要应用有SNP标记的开发、遗传图谱的构建、群体遗传学分析和QTL 分析。
3.目前用于做RAD测序数据的SNP calling的软件是Stacks。
4.遗传图谱中的遗传距离用厘摩（cM）来表示，1 cM的大小大致符合1%的重组率。
三、选择题1.在构建遗传图谱的时候，通常推荐样本数量至少在B个以上。
A. 50B. 100C. 150D. 2002.遗传图谱是指基因或者DNA标记在染色体上以A表示相对位置的图。
A. 遗传距离B. 物理距离3.常见的暂时性分离群体有A和B；常见的永久性分离群体有C和D。
A. F2B. BC1C. RILD. DH4.为了达到彼此相当的作图精度，所需的群体大小顺序为A>C>B≈D。
A. F2B. BC1C. RILD. DH5.我们公司目前的测序平台有（多选）：A. Hiseq2000B. Hiseq2500C. Hiseq4000四、问答题1.RAD 技术的主要流程包括哪几个方面？抽提DNA，质检，建库，测序2.RAD 技术有什么特点和优势？特点：（1）通过酶切作用对基因组特定区域进行测序；（2）反映部分基因组序列结构（变异）信息。
优势：（1）测序量低，价格便宜；（2）数据利用率高，性价比高；（3）实验操作简单；（4）能够构建高密度的分子图谱；（5）不依赖参考基因组，物种适用范围广。
3.RAD 技术和 dd-GBS 技术的主要区别是什么？dd-GBS 技术不对 DNA 片段打断，不需要挖胶和纯化，实验周期比较短。
RAD技术 华大基因
RAD 是基于新一代测序的一种快速而且高通量的基因分型技术。它能够 降低基因组的复杂度，同时不受参考基因组的限制，操作简便，能够快 速的鉴定出高密度的SNP位点，可以广泛应用于群体的遗传学研究。
RAD应用领域
RAD-Seq 基因组survey（杂合度、重复序列） RAD-Seq Map（遗传图谱构建） RAD-Seq（群体进化） RAD-Seq 其它应用
RAD技术发表文章
①Miller等（Genome Research,2007）应用RAD markers在果蝇作图群体 中将一个重组位点快速定位在150kb范围区域。 ②Baird等（PLoSone, 2008）通过三刺鱼（96个F2子代加亲本）选用SbfI 酶分别对双亲和子代进行RAD-Seq，总计获得13,000 SNPs，并且定位得 到两个重要性状。 ③Baxter等（PLoSone,2011）通过对小菜蛾的24个个体（22个回交1代 群体，2个亲本）进行RAD-Seq测序将小菜蛾多杀菌耐药性（孟德尔性 状）定位到W/Z性染色体上，并利用2,878个RAD alleles构建连锁图谱， 获得31个连锁群。 ④Chutimanitsakun等（BMC genomics, 2011）利用RAD-Seq技术对93株 大麦DH作图群体进行研究，获得530个SNP markers，应用其中的445个 SNP，结合之前的marker构建连锁图谱，QTL定位。
RAD应用于进化研究
RAD-seq在表达水平的应用
RAD技术
华大基因 白洁 2012-2-24
RAD技术
RAD（restriction association site DNA）是与酶切位点相关的DNA。RAD 可以 做为一种标签用做定位。通过对RAD tag的测序可以获得RAD tag上的SNP， 用于遗传图谱的构建，从而进行数量性状位点QTL定位。
RAD-seq简介及其应用
RAD-seq简介及其应⽤1. RADseq简介：RADseq (Restriction-site associated DNA sequencing)是在第⼆代测序基础上发展⽽来的⼀项基于全基因组酶切位点的简化的基因组测序技术，是简化基因组测序技术的总称。
RADseq不仅实验操作简单，性价⽐⾼，更为重要的是它并不依赖参考基因组的信息，⼀次测序即可获得数以万计的多态性遗传标记，已然⼴泛⽤于⽣态学、遗传学、基因组学等研究领域。
2. RAD-seq 技术RADseq技术是对特定的酶切⽚段进⾏⾼通量测序，根据使⽤的限制性内切酶的种类和数量，可以将RADseq分为Original RADseq，2b-RADseq，ddRAD, ezRAD, GBS等技术⽅法。
由于采⽤pooling建库的⽅式，与Paired-end和Mate-pair⽂库相⽐，RADseq技术⼀次可以构建多⾄96个测序⽂库，实验操作相当便利。
不同的RADseq技术所获得的loci的数量差异较⼤，总体来说：相⽐于GBS技术，Original RADseq和2b-RADseq可以获得更多的loci，因此，普遍认为这两种⽅法更适合⽤于探讨种群的进化关系，种群结构，gene flow等相关问题。
3. RADseq的⽣物信息学分析软件：常⽤RADseq的⽣物信息学软件主要有Stacks，pyRAD，TASSEL。
其中，Stacks因其可以适⽤各种类型的RADseq数据⽂件，获得更多的输出⽂件格式，更为⼴阔的适应性⽽被研究⼈员⼴泛使⽤，成为⽬前最为主流的RADseq分析软件。
⽽pyRAD的优势在于其可以进⾏Small_InDel的检测和注释。
TASSEL的优点在于其分析操作相对简单，有可视化窗⼝，并且可以进⾏PCA分析，LD分析以及关联分析等内容。
但它仅适⽤于GBS测序技术，并且输出的⽂件格式较为单⼀，限制了其适⽤的⼴泛性。
4. RADseq在⽣物进化研究中的应⽤：1) ⽣物的适应性基于RADseq数据，利⽤GWAS和Fst outlier两种分析⽅法发现了与蝴蝶翅膀模式相关的loci，揭⽰了蝴蝶对⽣长环境的适应机制。
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基于酶切的简化基因组测序(RAD)
1. 对于群体进化研究，个体的混样策略是怎样的？
答：如果更关注群体间的遗传多样性差异，希望消除群体内个体遗传差异带来的干扰，可以采用群体内个体混样的策略，我们会进一步在生物信息分析流程中采用优化的群体内SNP纠错与过滤程序达到分析目的。
2. 我们的RAD-Seq建库测序策略是怎样的？
答：建库策略选择基于综合考虑序列碱基质量、测序成本和物种基因组情况，主要有Single‐end 50 bp和Pair‐end 90 bp。
对于有参考基因组的物种，我们建议采用PE90文库测序。
对于无参考基因组的物种，则建议采用SE50文库测序。
3. RAD-Seq测序结果受哪些因素影响？测序成功的标准是什么？
答：设备、耗材、操作问题等方面都会对测序的结果造成影响。
测序成功标准包括：reads 数达标，错误率低，Q20高等。