免疫组织化学常用技术方法大全

5. 0.05% Tween-20/PBS，5min（室温）；
(微波修复抗原、蛋白酶消化)
6. 0.1%-1% BSA湿盒内孵育15～25 min
（室温），然后轻轻弃去孵育液（不冲洗） ；(或二抗动物的正常血清);
7. 轻轻弃去孵育液，滴加PBS稀释的第
一抗体，湿盒内孵育1～2 h （20-25℃）； 8. PBS充分冲洗， 5min × 3次，以去
示
踪物结合的能力，可用于双重或多重染色
注意事项
● 内源性生物素活性及其消除：肝、肾、 白细胞、乳腺预先以0.01%抗生物素和 0.01%生物素溶液分别作用20 min，以消除 内源性生物素。
● 试剂的差异，应进行预实验。
● ABC试剂盒保存以4℃为佳。
第三节
葡萄球菌蛋白A（SPA）
葡萄球菌蛋白A（ staphylococal
操作步骤：
1. 石蜡切片脱蜡，系列酒精至水； 2. 冰冻切片丙酮固定10min，PBS
洗涤5min ×3；
2. 第一抗体，室温孵育60 min ；
3. PBS洗涤 5 min × 3次
4. 生物素标记的第二抗体，孵育45 min
5. PBS洗涤 5 min × 3次
6. ABC复合物， 45 min 7. PBS洗涤 5 min × 3次
发色团：Fast Blue
Fast Red BCIP/NBT
血细胞、淋巴细胞 内源性过氧化酶含量较高 可选用ALP/AP
二、染色步骤及原理
间接法：
1. 石蜡切片经二甲苯脱蜡，下行酒精至水; 2. 未固定的冰冻切片，丙酮固定 20～30 min，风干15～30min;
3. 用0.03%H2O2处理切片15～30 min(室温)， 封闭内源性过氧化酶的活性； 4. PBS洗涤2min;
protein, SPA）是一种从金黄色葡萄球
菌细胞壁分离的蛋白质。
早在1940年，Vevwey发现某些金
黄色葡萄球菌中，含有一种物质，在双 向扩散试验中能与正常人血清形成沉淀， 1959年将其命名为A抗原。
一、免疫学特性
SPA具有与人及多种动物（豚鼠、猪、 小鼠、猴等）IgG结合的能力。SPA结合部位 是Fc段而不是Fab段，这种结合不会影响抗 体的活性。SPA具有的结合力是双价的，每 个SPA分子可以同时结合两个IgG分子，也可 一方面同IgG结合，一方面与标记物如荧光素、 过氧化物酶、胶体金、铁蛋白等相结合。
免疫组织化学常用方法大全
基本原理与操作步骤
第一节
免疫酶细胞化学
免疫酶细胞化学是免疫组织化学中
最常用的方法，它是在抗原抗体特异反
应存在的前提条件下，借助于酶细胞化
学手段，检测某种物质（抗原／抗体） 在组织细胞内的存在部位。即预先将抗 体与酶连结（酶标抗体），再使其与组 织内特异性抗原反应，经细胞化学染色 后，在光镜或电镜下观察分析。
能影响二者的活性。
● 被检测组织中，不应存在百度文库标记 酶相同的内源性酶或类似物质。
免疫组织化学常用酶 ——————————————————— 名称 分子量 内源性 商品 ——————————————————— HRP (POD) 40-50 kD + 有
ALP (AP)
80-120 kD
++
有
———————————————————
8. 显色（H2O2/DAB）、复染、封片
9. 观察、记录
second antibody-biotin + Avidin + biotinHRP
ABC复合物的配制：
biotin：avidin
avidin 10μg/ml biotin 2.5μg/ml
1：4
临用前30分钟配制
ABC法特点： ■ 敏感性强，具有放大作用 ■ 特异性强，背景染色淡 ■ 方法简便，节约时间 ■ 由于生物素与抗生物素具有与多种
● HRP/POD（辣根过氧化物酶）
显色原理：
HRP + H2O2 体） HRP ·H2O2 + 供氢体
（电子供 HRP + H2O + 供氢体
（氧化
型）
DAB（二氢基联苯胺）
AEC（3-氢-9-乙基咔唑） TMB（四甲基联苯氨）
棕褐色
红色 深蓝色
● ALP/AP（碱性磷酸酶） 底物：萘酚（As-Mx）
除切片上非特异性吸附的抗体；
9. 滴加PBS稀释的HRP标记的第二抗体，
湿盒内孵育45～60 min （室温）；
10. PBS漂洗 5min × 3 次；
11. 显色，0.01% - 0.1% H2O2 ／ 0.01% -0.05% DAB, 10～15 min； 12. 细胞核复染（甲基绿或苏木素）； 13. 封片、观察、记录。
SPA对IgG免疫球蛋白亚型的结 合有选择性，如 SPA 与人 IgG 亚型
IgG1 、IgG2 、IgG4 有结合力，与
IgG3没有结合力。
二、SPA在免疫组化中的作用
可作为二抗或标记抗体。SPA的
最大优点是不受种属特异性的限制， 还具有染色时间短、灵敏性高和背景
染色淡等优点。
SPA-胶体金技术（PGA技术） 可在电镜水平检查抗原抗体反应的
分子量
244
biotin
biotin
avidin
biotin
biotin
二、抗生物素-生物素-过氧化酶复合物技术
(
Avidin-Biotin-peroxidase Complex technique, ABC法)
其特点是利用抗生物素分别连接生物素 标记的第二抗体和生物素标记的酶。 second antibody-biotin + Avidin + biotinHRP ABC complex
一、常用酶的种类
用于标记的酶应具备以下几点： ● 酶催化的的底物必须是特异性的，且 容易被显示，所形成的产物易于在光镜或电 镜下观察。 ● 所形成的终产物沉淀必须稳定，不向 周围组织弥散。 ● 较易获得酶分子，最好有商品出售。
● 中性pH时，酶应稳定，酶标记抗 体后，保存1～2年活性不应改变。 ● 酶标过程中，酶与抗体连结，不
亲和组织化学（affinity histochemistry） 植物凝集素与糖类 生物素与抗生物素
葡萄球菌A蛋白与IgG
阳离子与阴离子
激素、维生素、糖类与受体
第二节
抗生物素-生物素免疫细胞化学染色法
一、基本原理
抗生物素（卵白素）
avidin
分子量68 000 糖蛋白 生 物 素 （维生素H） biotin