测定核酸含量的几种方法
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• 在波长260nm紫外线下，1OD值的光密度相 当于双链DNA浓度为50μg/ml；单链DNA或 RNA为20μg/ml。可以次来计算核酸样品的
a 浓度。
荧光光度法
• 即琼脂糖凝胶电泳法。
• 溴化乙锭在紫外光照射下能发射荧光，它 插入到DNA分子中形成荧光结合物，使发射 的荧光增强几十倍，而荧光的强度正比于 DNA的含量，将已知浓度的标准样品作为电 泳对照，就可以估计出待测样品的浓度。 用量只需要5-10ng DNA即可，肉眼观察可检 测0.05g-0.1g的DNA。
• 该方法只是估计水平，另外还应考虑DNA或 a RNA样品中分子大小与标准对照中核酸分子
小节
• 根据不同情况以及实验条件选择合适的检 测方法。
• 无论何种方法，均需保证待测样品的核酸 （DNA或RNA)纯度。
• 根据需要设定一定的平行以及对照。
a
再见
a
测定核酸含量的几种方法
命基111 10111104 朱家民
a
核酸
• 由许多核苷酸聚合成的生物大分子化合物， 为生命的最基本物质之一。
• 核酸广泛存在于所有动植物细胞、微生物 内、生物体内的核酸常与蛋白质结合形成 核蛋白。
• 不同的核酸，其化学组成、核苷酸排列顺 序等不同。根据化学组成不同，核酸可分 为核糖核酸（简称RNA）和脱氧核糖核酸 （简称DNA）。
aFra Baidu bibliotek
定糖法
• 核酸中的戊糖可在浓盐酸或浓硫酸作用下 脱水生成醛类化合物，醛类化合物可与某 些成色剂缩合成有色化合物，可用比色法 或分光光度法测定其溶液中的吸收值，在 一定浓度范围内，溶液的吸收值与核酸的 含量成正比。
• 1、核糖的测定
生成的绿色化合物在λ=670nm处有最大 的吸收值。
• 2、脱氧核糖的测定
DNA中的脱氧核糖可在浓硫酸作用下脱 a 水生成ω-羟基-γ-酮戊酸，该化合物可与二
注意事项
其他糖及糖的衍生物、芳香醛、蛋白质等都 对实验有干扰，测定前应尽量可能除去。
a
紫外吸收法
• 组成核酸分子的碱基，均具有一定的吸收 紫外线特性，最大吸收值在波长为 250~270nm之间。核酸的最大吸收波长是 260nm，这个物理特性为测定核酸溶液浓度 提供了基础。
a
为什么要测核酸含量
• 有助于接下来核酸相关实验中所用酶和其 他试剂含量的确定
• 为了排除核酸在实验中的干扰
a
核酸含量测定的几种方法
• 定磷法 • 定糖法 • 紫外吸收法 • 荧光光度法
a
定磷法
• 在酸性环境中，定磷试剂中的钼酸铵以钼 酸形式与样品中的磷酸反应生成磷钼酸， 当有还原剂存在时磷钼酸立即转变蓝色的 还原产物——钼蓝
• 钼蓝最大的光吸收在650—660nm波长处。 当使用抗坏血酸为还原剂时，测定的最适 范围为1—10微克无机磷。测定样品核酸总 磷量，需先将它用硫酸或过氯酸消化成无 机磷再行测定。总磷量减去未消化样品中 测得的无机磷量，即得核酸含磷量，由此
a
注意事项
• 1）清洗实验用容器不要用含磷清洗剂 • 2）消化过程注意防止爆沸和溅出内容物
a 浓度。
荧光光度法
• 即琼脂糖凝胶电泳法。
• 溴化乙锭在紫外光照射下能发射荧光，它 插入到DNA分子中形成荧光结合物，使发射 的荧光增强几十倍，而荧光的强度正比于 DNA的含量，将已知浓度的标准样品作为电 泳对照，就可以估计出待测样品的浓度。 用量只需要5-10ng DNA即可，肉眼观察可检 测0.05g-0.1g的DNA。
• 该方法只是估计水平，另外还应考虑DNA或 a RNA样品中分子大小与标准对照中核酸分子
小节
• 根据不同情况以及实验条件选择合适的检 测方法。
• 无论何种方法，均需保证待测样品的核酸 （DNA或RNA)纯度。
• 根据需要设定一定的平行以及对照。
a
再见
a
测定核酸含量的几种方法
命基111 10111104 朱家民
a
核酸
• 由许多核苷酸聚合成的生物大分子化合物， 为生命的最基本物质之一。
• 核酸广泛存在于所有动植物细胞、微生物 内、生物体内的核酸常与蛋白质结合形成 核蛋白。
• 不同的核酸，其化学组成、核苷酸排列顺 序等不同。根据化学组成不同，核酸可分 为核糖核酸（简称RNA）和脱氧核糖核酸 （简称DNA）。
aFra Baidu bibliotek
定糖法
• 核酸中的戊糖可在浓盐酸或浓硫酸作用下 脱水生成醛类化合物，醛类化合物可与某 些成色剂缩合成有色化合物，可用比色法 或分光光度法测定其溶液中的吸收值，在 一定浓度范围内，溶液的吸收值与核酸的 含量成正比。
• 1、核糖的测定
生成的绿色化合物在λ=670nm处有最大 的吸收值。
• 2、脱氧核糖的测定
DNA中的脱氧核糖可在浓硫酸作用下脱 a 水生成ω-羟基-γ-酮戊酸，该化合物可与二
注意事项
其他糖及糖的衍生物、芳香醛、蛋白质等都 对实验有干扰，测定前应尽量可能除去。
a
紫外吸收法
• 组成核酸分子的碱基，均具有一定的吸收 紫外线特性，最大吸收值在波长为 250~270nm之间。核酸的最大吸收波长是 260nm，这个物理特性为测定核酸溶液浓度 提供了基础。
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为什么要测核酸含量
• 有助于接下来核酸相关实验中所用酶和其 他试剂含量的确定
• 为了排除核酸在实验中的干扰
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核酸含量测定的几种方法
• 定磷法 • 定糖法 • 紫外吸收法 • 荧光光度法
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定磷法
• 在酸性环境中，定磷试剂中的钼酸铵以钼 酸形式与样品中的磷酸反应生成磷钼酸， 当有还原剂存在时磷钼酸立即转变蓝色的 还原产物——钼蓝
• 钼蓝最大的光吸收在650—660nm波长处。 当使用抗坏血酸为还原剂时，测定的最适 范围为1—10微克无机磷。测定样品核酸总 磷量，需先将它用硫酸或过氯酸消化成无 机磷再行测定。总磷量减去未消化样品中 测得的无机磷量，即得核酸含磷量，由此
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注意事项
• 1）清洗实验用容器不要用含磷清洗剂 • 2）消化过程注意防止爆沸和溅出内容物