管碟法抗生素微生物检定法讲座

Ⅱ
M1
9.21DT
1
Ⅰ+Ⅱ得： 2Logθ＝───〔(T22- S22)+( T12 - S12)〕
Ⅲ
9.21DT
(①+②)-(③+④)得：
(LogM 2+ LogM 2/)-( LogM 1 + LogM 1/)＝──── (S22+ T22- S12- T12)
9.21DT
即
M2
M
/ 2
1
Log——+ Log—— ＝───── (S22+ T22- S12- T12)
M1
M
/ 1
9.21DT
M2
M2＇
设 I 为高低剂量比的对数。则 I ＝Log─── ＝Log───
M1
M1＇
1
2I ＝──── (S22+ T22- S12- T12)
Ⅳ
9.21DT
Logθ T22- S22+ T12- S12
Ⅲ/Ⅳ得 ─── ＝────────
Ⅴ
I
S22+ T22- S12- T12
要使抑菌圈直径变大可滴碟后预先扩散一定时间再进行培养。
⑵可以通过改变培养基和缓冲液中的盐浓度来控制抑菌圈直径。例如，新霉素和多粘菌
素缓冲液中加入 3％NaCl 或培养基中加一定盐和吐温可改变扩散系数 D 使抑菌圈增大。 ⑶可以通过改变培养基的 pH 值来控制抑菌圈直径。碱性抗生素在偏碱性培养基中抗菌
①
9.21DT
1
供试品高剂量与抑菌圈关系式：LogM
/ 2
＝────T
2
2
+
Logc＇4πDTH
②
9.21DT
1
标准品低剂量与抑菌圈关系式：LogM
1
＝────S
2 1
+
Logc＇4πDTH
③
9.21DT
1
供试品低剂量与抑菌圈关系式：LogM
/ 1
＝────T
1
2
+
Logc＇4πDTH
④
9.21DT
得较清晰的抑菌圈。再如，泰乐菌素对藤黄微球菌杀灭作用较弱，形成的抑菌圈边缘清晰度 较差，对枯草芽孢杆菌杀灭作用较强，形成的抑菌圈边缘很清晰。
⑵解决办法有： ａ保持菌种新鲜，定期传代，及时更换，定时进行单菌落的分离、纯化。 ｂ增强抗生素的抗菌活性：可以从培养基的成分、pH 值和缓冲液的 PH 值和浓度来控制。 ｃ严格控制操作条件：如严格控制培养基、缓冲液的 pH 和培养温度的均匀性。
操作技术
一、设备、仪器、用具及其要求： ㈠设备、仪器、用具及其要求： ⒈ 抑菌圈测量仪 ⑴ ZY-300A 型： ① 直径重复测量精度差≤0.2%：同一抑菌圈重复扫描 10 次，10 次测量结果相对标准
偏差≤0.2%。 ② 台间测量差异≤1%：不同台仪器之间测量差异≤1%。 ③ 效价重复测量精密度≤0.5%：同台仪器重复测量 5 次，结果相对标准偏差≤0.5%。 ④ 旋转精度≤0.08mm：使用抑菌圈边缘特别清晰的双碟,从最上位置开始，每旋转 45
造成抑菌圈边缘不清晰的主要原因是抑菌圈形成过程中扩散系统的纷乱、不均一，不符 合动力公式中各项之间的关系或为各种扩散系统交叉进行的结果。
⑴主要因素有： ａ检定菌放置时间过长，菌液中菌龄不一致，使抗生素溶液对不同菌龄的试验菌存在不 同的最低抑菌浓度，使形成的抑菌圈边缘不清晰。应定期分离及时更换试验菌，使菌液中各 试验菌菌龄一致。 ｂ细菌生长时间不同，受温度、湿度变化的影响或杂有易生长和不易生长的菌以至 T 有 T 1、T2。 ｃ培养基内杂质影响扩散系统，使扩散系数形成两个 D1、D2。因此，配制培养基时选用 杂质少、质量优的材料可提高抑菌圈清晰度。例如，测定大观霉素效价，利用国产的酵母膏、 牛肉膏配制Ⅱ时形成的抑菌圈特别不清晰，测定结果精密度和准确度很差，可信限率高，复 试率高。选用进口蛋白胨、酵母粉、牛肉粉配制的Ⅱ，测定大观霉素效价时形成的抑菌圈比 较清晰，测定结果稳定，可信限率和复试率低。 ｄ抗生素中有杂质和其它组份使 C0 或 M 发生变化。例如麦白霉素是一多组份抗生素， 形成的抑菌圈清晰度较差而且有双圈。 ｅ抗生素杀菌、抑菌的强弱(本身的性质)。抗生素对试验菌杀菌作用或抑菌作用的强弱， 能影响抑菌圈边缘清晰度。杀菌型抗生素如链霉素、硫酸庆大霉素形成的抑菌圈边缘光滑清 晰。抑菌型抗生素如竹桃霉素、春雷霉素对不少试验菌呈抑菌作用，抑菌圈边缘模糊或出现 双圈，枯草杆菌经紫外光处理后得到的变异菌珠(1-338)，对春雷霉素敏感度增高，能够获
管碟法操作条件的控制
一、抑菌圈圆正的控制： 在某些情况下，ห้องสมุดไป่ตู้菌圈出现破裂、不圆呈卵圆或椭圆形甚至无圈现象，原因主要有： ①滴样时药液飞溅。此操作会导致抑菌圈破裂。防止方法是：毛细滴管内不得有气泡，
毛细滴管口避免太细或太粗，毛细滴管离小钢管口距离不要太高，应适当调节，使液滴下滴 时不致溅出。另外，若发现有液滴溅出可用以下方法来补救：预先备好消毒小滤纸片，将溅 在琼脂培养基表面的液滴用小滤纸片轻轻吸去。
其中: b ＝ 1/9.21DT ， c ＝ Logc＇4πDTH 。 b 为斜率 ， c 为截距
此公式为管碟法测定抗生素效价的基础，它表明对数剂量 LogM 与抑菌圈半径的平方成
直线关系，这就是抗生素微生物效价检定法(管碟法)的理论依据。 由公式⑴得：
1
标准品高剂量与抑菌圈关系式：LogM 2 ＝────S 2 2 + Logc＇4πDTH
⑨所用的缓冲液 pH 值和盐浓度的影响。所用的缓冲液 pH 值和盐浓度不适宜会形成卵圆
形抑菌圈。例如，四环素类抗生素，当抗生素溶液的 pH 过低时形成的抑菌圈可呈卵圆形。
再如硫酸链霉素，如盐浓度太高或 pH 值过低，就会不显抑菌圈或呈向心型的卵圆形抑菌圈，
比如稀释用缓冲液浓度如较药典规定浓度增大 10 倍或缓冲液 pH 为 6.0，则完全无抑菌圈产
生。其原因可能是当培养基内加入某些盐离子时使细菌减少抗生素接受器的效果，影响了抗
生素对试验菌的最低抑菌浓度。例如很多盐能对链霉素起拮抗作用。因此，工作时应严格按
照规定控制缓冲液和培养基的 pH 和盐浓度，减少其对测定的影响。
二、抑菌圈大小的控制：
按照药典要求，抑菌圈大圈直径应控制在 18～22mm 之间，否则会增加测定误差。
抗生素最低抑菌浓度。
2、二剂量法公式推导：
管碟法球面扩散公式：
r 2 ＝4DT〔LnM/H - Lnc＇ - Ln(4πDT)〕
整理得：LogM＝r 2 /9.21DT + Logc＇4πDTH
⑴
其中： D:扩散系数
r:抑菌圈半径
M:抗生素总数
T:扩散时间
c＇:最低抑菌浓度 H:培养基厚度
此公式即为直线方程 LogM ＝ bY + c
因标准品与供试品同质，最低抑菌浓度 c＇相同，又在同一双碟上培养 Logc＇4πDTH
相等，所以②-①得：
M2＇
1
Logθ＝ Log─── ＝ ──── ( T22 - S22)
Ⅰ
M2
9.21DT
其中θ为供试品与标准品效价比率。
同理可推算出低剂量反应式：
M1＇
1
Logθ＝ Log─── ＝ ─── ( T12 - S12)
圈不圆而且大小不均匀。防止办法是：严格挑选使用底平的双碟，工作台用水平仪校正垫平。
⑧培养基内有小凝块。此操作会使形成的抑菌圈呈凹形而不圆。其原因是抗生素溶液扩
散到小凝块处扩散速度减慢，使形成的抑菌圈局部变小而呈凹形。防止办法是：使用水浴锅
融化培养基，保证培养基完全融化；防止培养基骤冷骤热，避免培养基中形成小凝块。
由公式
M ＝C0AL ＝ C0V r2/4DT ＝ Ln C0V - LnC＇4πDTH
(其中 M 为抗生素溶液 C0 为抗生素溶液浓度 A 为面积 L 为钢管高度 V 为容积)
可知，抑菌圈大小可由公式中 A,L, C0,C＇,D,T,H 来控制。控制抑菌圈直径的方法主要
有：
⑴抑菌圈大小受 T 值增减影响，若要使抑菌圈直径变小可预先培养一段时间再滴碟；若
此为二剂量法效价计算公式，其中 S1、S2、T1、T2 分别为低浓度标准、高浓度标准、低
浓度样品、高浓度样品产生的抑菌圈半径。
实验证明：对数剂量与抑菌圈直径或面积在一定条件下呈直线关系，所以为工作方便在
实际工作中把半径的平方改为抑菌圈直径或面积，公式变为：
Logθ T2- S2+ T1- S1
─── ＝───────
⑸试验菌也是影响抑菌圈直径的一重要因素。及时更换试验菌，使用新鲜菌液，可提高 试验的灵敏度，增大抑菌圈直径。例如，使用新开启的枯草芽孢杆菌测定乙酰螺旋霉素效价 时形成的抑菌圈大圈直径比使用旧的试验菌(2 年以上)提高 1～2mm。
⑹通过控制培养基中菌的浓度来控制抑菌圈直径。例如，乙酰螺旋霉素、泰乐菌素、螺 旋霉素形成的抑菌圈较小，为了提高抑菌圈直径，培养基中菌的浓度为 0.1～0.2％，需要 时还可以把原菌液稀释 3～5 倍。盐霉素、麦白霉素形成的抑菌圈较大，为了降低抑菌圈直 径，可以把菌液浓度提高至 2～3％。 三、抑菌圈清晰度的控制：
效力强抑菌圈增大，酸性抗生素在偏酸性培养基中抗菌效力强抑菌圈增大。例如，硫酸链霉 素、乙酰螺旋霉素为碱性抗生素，形成的抑菌圈偏小。因此，可通过提高培养基 pH 值至 8.0～ 8.2 来提高抑菌圈直径。
⑷除温度、扩散系数和抗生素溶液浓度外，培养基厚度也是影响抑菌圈直径的重要因素。 如将培养基厚度减小时，抑菌圈直径就增大。薄层法就是根据此原理设计的，该法大大提高 了试验的灵敏度。
°测量抑菌圈直径一次，旋转一周共测 8 次，8 次中最大直径与最小直径之差应≤0.08mm。 ⑵ ZY-300Ⅳ型 ① 同一位置抑菌圈直径测量重复精度：使用标准模板，在同一位置反复测量 8 次，得
②小钢管底部二端面不平，此操作会导致形成卵圆或椭圆形抑菌圈。其原因是抗生素溶 液在琼脂培养基上扩散速度不一致。操作时使用加工相同的小钢管可防止此现象的发生。
③双碟、小钢管或其它器具被抗生素或其它杀菌剂污染。此操作会使抑菌圈破裂，有时 甚至使试验菌大部或全部被抑制，无法形成抑菌圈。因此，操作时一定要防止材料、器具、 环境被抗生素污染。
二、效价测定计算公式──二剂量法及其推导：
1、抑菌圈形成原理：
当小管内加入抗生素溶液后，即产生两种互动因素：一是抗生素溶液向培养基内呈球面
形扩散；另一种是试验菌开始生长。抗生素在琼脂培养基内的浓度，随离开小管距离的增大
而降低，离开小管愈远，琼脂培养基中抗生素浓度愈低，当抗生素扩散到一定时间，抗生素
浓度高于最低抑菌浓度之处，试验菌的生长受到抑制，形成透明抑菌圈，圈之边缘处恰好为
原因是相邻的小钢管之间的距离过小或形成的抑菌圈过大，相邻两小钢管扩散的抗生素溶液
互相叠加，超过该抗生素溶液对试验菌的最低抑菌浓度而形成卵圆或椭圆形抑菌圈。防止方
法有：使用钢管放置器安置钢管，使各钢管之间的距离均匀一致而避免过小；控制抑菌圈大
圈直径在 18～22mm 之间。
⑥培养温度不均匀，此操作会导致形成卵圆或椭圆形抑菌圈。其原因是温度影响细菌的
生长速度和抗生素在琼脂培养基内的扩散系数，双碟靠近热源较近处，细菌生长较快，形成
的抑菌圈变成卵形而变小 。因此，为减少温度的影响，可采取以下措施：同批双碟放在同
一层盘内；恒温箱中放入双碟后在培养过程中不宜再开启；恒温室最好设计为正方形而且不
宜过大，使用的加热设备尽量使室内温度均匀一致。
⑦双碟底部或工作台不够水平。此操作会使培养基和菌层厚度不均匀，导致形成的抑菌
-抗生素微生物检定法讲座————管碟法
基本原理：
一、管碟法测定抗生素效价原理：
管碟法测定效价，是利用抗生素在琼脂培养基内的扩散作用，将已知效价的标准溶液 与未知效价的供试品溶液，在同一条件下，在摊布高度敏感的特定试验菌的培养基上进行对 照培养，经过一定时间后，抗生素在培养基内扩散到达适当范围产生了抑制试验菌生长的透 明抑菌圈。经比较标准液与供试品液两者产生抑菌圈直径或面积的大小，根据不同设计方法 的计算原理，即可推算出供试品的效价。
⑵
I
S2+ T2- S1- T1
式中：θ＝供试品与标准品的效价比率；
T1＝低剂量供试品所致的抑菌圈直径的总和；
T2＝高剂量供试品所致的抑菌圈直径的总和；
S1＝低剂量标准品所致的抑菌圈直径的总和；
S2＝高剂量标准品所致的抑菌圈直径的总和；
I ＝高低剂量比的对数。
此为工作中所用的二剂量法效价计算公式。
三、一剂量法及其公式推倒：
④加菌层时培养基温度过高或受热时间过长，试验菌部分或全部被杀死。此操作会使抑
菌圈破裂，或形成的抑菌圈过大，有时甚至无圈。一般情况下霉菌、球菌不耐热，操作时应
控制温度在 45～50℃，同时培养基温度应均匀，防止局部过热使试验菌被烫死。
⑤小钢管之间的距离过小或形成的抑菌圈过大，可形成卵圆或椭圆形抑菌圈。此现象的