经典色谱法液相
经典液相色谱法
定性分析——日光，紫外光，显色 定量分析——洗脱法，薄层扫描法
四、纸色谱法
将固定相放在纸上，以纸做载体进行点样、展开、 定性、和定量旳液-液分配色谱法
✓ 固定相：纸纤维吸附旳水
✓ 流动相：与水不互溶旳有机溶剂（饱和正丁醇）
✓ 分离机制：同液-液分配色谱
✓ 定性参数：
Rf
1
1 K VS
原点到组分斑点质量中心的距离 原点到参考物斑点质量中心的距离
L1 L2
✓ 讨论
• 参照物与被测组分在完全相同条件下展开 能够消除系统误差，大大提升重现性和可靠性；
• 参照物能够是后加入纯物质，也可是样品中已知组分 • 相对比移值Rs与组分、参照物性质及色谱条件有关，
范围能够不小于或不不小于1
（三）吸附剂旳选择 根据被测物极性和吸附剂旳吸附能力
图示
图示
L0 L2
L1
（二）定性参数
1. 比移值Rf
设R’为单位时间内一个分子在展开剂中出现的几率
设1 R’为单位时间内一个分子在固定相中出现的几率
定时展开保留比 R' uR L1 t L1 u0 L0 t L0
Rf
原点到组分斑点质量中心的距离
原点到溶剂前沿的距离
L1 L0
(R' 1)
2）吸水→失活 →105～110OC烘干30分钟(可逆失水)→吸附力最大 →500OC烘干(不可逆失水)→活性丧失，无吸附力
合用：分析酸性或中性物质
续前
2. 氧化铝
碱性氧化铝 pH 9～10 适于分析碱性、中性物质 中性氧化铝 pH＞7.5 适于分析酸性碱性和中性物质 酸性氧化铝 pH 4～5 适于分析酸性、中性物质
被测物极性强——弱极性吸附剂 被测物极性弱——强极性吸附剂
经典液相色谱法平面色谱分析
18.6 纸色谱法
18.6.1 纸色谱法的分离原理 paper chromatography
～是以纸为载体的色谱法，分离原理
属于分配色谱的范畴。
固定相：纸纤维上吸附的水分。(或甲酰胺、 缓冲液等滤纸可以吸留的物质。) 流动相：不与水相混溶的有机溶剂。或可与 水混溶的溶剂。
l2、l1分别为原点至两斑点中 心的距离， d为两斑点中心间的距离 ，W1、W2为斑 点的宽度。
分离数 定义在相邻斑点分离度为1.177时，在
Rf 0和Rf 1两种组分斑点之间能容纳的 色谱斑点数。
SN l0 /b0 b1 1
其中，b0、b1为Rf 0和1时组分的半峰宽， 二者由外推法获得。
c.点样方法 吸取一定量的样液，轻轻接触于薄层的
点样线上，点样线一般距薄层底边 1.5~2cm， 点间距约0.8~1.5cm(新药典规定为1.5~2.0 cm)。点样后形成的原点面积越小越好，一 般原点直径不超过2~4mm为宜。
展开和展开剂的流速
展开
先预饱和。展开前，将薄层板置于盛有展 开剂的色谱缸内饱和15～30min,此时薄板不与 展开剂直接接触，当色谱缸内展开剂蒸汽、薄 层与缸内大气达到动态平衡时，即饱和时，再 将薄层板浸入展开剂中，称预饱和。
常用展开剂：水饱和的正丁醇、正戊醇、 酚等，即含水的有机溶剂。
为了防止弱酸、弱碱的离解，加入少量 的酸或碱。如甲酸、醋酸、吡啶等。
纸色谱的操作步骤有点样、展开、显色、 定性定量分析几个步骤。
复习题
1、在硅胶薄层板A上，以苯－甲苯（1:3）为 展开剂，某物质的Rf值为0.50，在硅胶板B 上，用相同的展开剂，此物质的Rf值为0.40， 问哪块板的活度大？
液相色谱法
液相色谱法
液相色谱法（liquid chromatography，LC）是一种色谱技术，用于分离
和分析溶液中混合物的化学成分，以确定是否存在或不存在特定成分，如果存在，则存在多少。
我们中的许多人会从上学开始就熟悉平面LC的形式，在滤纸上打上黑色墨水标记，将一端浸入水中，然后观察墨水中的成分颜色是否分开。
但是，分析应用中使用的大多数LC均基于柱色谱法，这将是本文的重点。
顾名思义，高效液相色谱（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）是使用高色谱分辨率进行高效分离的高性能分析。
分离的组分也可以在检测后使用馏分收集器分离，作为纯化的手段。
HPLC有多种不同的配置，可用于分离分子量从半挥发性小分子到几万千道尔顿的大蛋白生物分子的溶解组分。
液相色谱法是一种非常流行的分析技术，广泛用于环境监控，农业，医药领域。
液相色谱法的优缺点
LC通常用于各种应用。
但是，它不适用于挥发性化合物的分离和分析。
仅当所有要分离的组分的蒸气压低于流动相的蒸气压时，才能实现可靠的分析型液相色谱方法。
气相色谱法更适合分析挥发性化合物。
提供各种不同的色谱柱和溶剂，可提供广泛的选择性，从而可以分离极性范围很广的组分。
大分子和小分子同样适用于该技术。
在相对较低的温度下进行有效分离的能力也使LC成为可在气相色谱仪中分解的热不稳定化合物的理想分离技术。
经典液相色谱法练习题（附答案）
经典液相色谱法练习题（附答案）填空题1．硅胶具有微酸性，适用于分离____酸性或中性______物质的分离。
2．以聚酰胺为吸附剂时，通常用__极性溶剂_______作流动相。
3．在一定范围内离子交换树脂的交联度越大，则交换容量_小__，组分的保留时间__短__。
4．吸附剂的含水量越高，则吸附性能越__弱__。
选择题1．以硅胶为吸附剂的柱色谱分离极性较弱的物质时，宜选用（B ）A．极性较强的流动相B．活性较高的吸附剂和极性较弱的流动相C．活性较低的吸附剂和极性较弱的流动相D．活性较高的吸附剂和极性较高的流动相2．离子交换树脂的交联度越大则（B）A．形成网状结构紧密、网眼大、选择性好B．形成网状结构紧密、网眼小、选择性好C．交换容量越小D．组分保留时间越短3．样品中各组分的流出柱的顺序与流动相性质无关的是（D）A．离子交换色谱B．聚酰胺色谱C．吸附色谱D．凝胶色谱4．在反相色谱法中，若以甲醇-水为流动相，增加甲醇的比例时，组分的容量因子k与保留时间t R，将如何变化（B）A．k与t R增大B．k与t R减小C．k增大，t R减小D．t R增大，k减小5．色谱用氧化铝（A）A．活性的强弱用活度级I~V表示，活度V级吸附力最弱B．活性的强弱用活度级I~V表示，活度V级吸附力最强C．中性氧化铝适于分离非极性物质D．活性与含水量无关6．液相色谱中，固定相极性大于流动相极性属于（B）A．键合相色谱B．正相色谱C．反相色谱D．离子交换色谱7．凝胶色谱中，分子量较大的组分比分子量较小的组分（A）A．先流出色谱柱B．后流出色谱柱C．几乎同时流出D．在色谱柱一样8．色谱所用的氧化铝（C）A．有碱性和酸性二种，其中碱性使用最多B．有碱性和酸性二种，其中酸性使用最多C．有碱性、中性和酸性三种，而中性氧化铝使用最多D．有碱性、中性和酸性三种，而碱性氧化铝使用最多E．有碱性、中性和酸性三种，而酸性氧化铝使用最多简答题1．用硅胶柱色谱分离极性较强的物质时，吸附剂与流动相的选择原则是什么？为什么？答：选择弱吸附剂，与极性强的流动相原因：略2．根据分离机制不同将液相柱色谱法分类。
液相色谱法和高效液相色谱法
溶剂等级
➢ 不管采用何种途径，配制流动相应用新鲜水，放置 时间越短，水质越高。
➢ 理想的HPLC用水应为18.2MΩ的超纯水，并通过 0.22um的滤膜，除去热源、有机物、无机离子及空 气等。
溶剂等级
有机溶剂的等级 HPLC级 优级纯 分析纯
都经过蒸馏和0.45µm的过滤(除纤维毛,未溶解的机械颗粒） 优级纯的纯度比分析纯大,但里面含有防腐剂和抗氧化剂 HPLC级经过0.2µm的过滤,且除去有紫外吸收的杂质
《仪器分析》
液相色谱法
高效液相色谱法
High Performance Liquid Chromatography
For Short：HPLC
色谱基础知识
主要内容
液相色谱法基础知识 液相色谱仪的主要部件
液相色谱仪的维护
色谱基础知识
色谱起源
1903年俄国植物学家 M. S. Tswett 提出经典液相色谱
C18柱的使用注意点
柱压应低于柱子的承受压力 柱温在40℃左右，最高使用温度为50℃ 缓冲液pH使用范围为2～7
硅胶在PH为3～4时稳定性最好 碱浓度越低，流动相含水量越低，硅胶越稳定。
检测器 进样器
储液瓶 高压输液系统
输液泵
数据处理系统
柱温箱
常用检测器
紫外检测器（UV） 二极管阵列检测器（PDA） 荧光检测器（FL） 示差折光检测器 蒸发光散射检测器
溶剂等级
分析纯级(实线）和 HPLC 级溶剂（虚线）的吸光度比较
甲醇
乙睛
正己烷
溶剂等级
缓冲盐的使用：
使用前必须过滤 使用后一定要对柱子进行清洗 ，以免造成腐蚀、磨
损及阻塞：首先用纯水冲洗10-30min，再用甲醇冲 洗30min(0.5-1ml/min)
经典液相色谱法2
吸附剂粒径对展开速度、Rf 值和分离效果的影响： • 颗粒大，则总表面积小，吸附量低，展开速度快，展 开后斑点较宽，分离效果差。 • 颗粒太小，则展开速度太慢，而且不易用干法铺板。 因此，应该选用颗粒大小适宜的吸附剂，而且其 粒度分布要窄。 吸附剂颗粒大小表示方法： • 颗粒直径(以µm表示)， • 筛子单位面积的孔数(以目表示) 干法铺板所用吸附剂颗粒直径一般在75～100µm 或150～200目较为合适，而湿法铺板则用更细的颗粒， 为10～40µm或250～300目。聚酰胺则一般在100～180 目范围内。高效薄层板的颗粒直径为5～10µm。
在薄层色谱使用的一般条件下，固定相、流动 相都不很明确，它们都与蒸汽相一起维持着一种变化 的状态，在分离过程中这三相都可能不断在变化。 • 在使用混合溶剂时，在展开过程中极性较弱、沸点 较低的溶剂在薄层板边缘容易挥发，致使边缘部分的 展开剂中极性溶剂的比例增大，使Rf值相对变大。同 一物质在同一薄层板上出现中间部分的Rf值比边缘的 Rf值小，这种现象称为边缘效应。
2. 软板的制备：直接铺制吸附剂。 3. 粘合薄层板(硬板)的铺制 (1)粘合剂：粘合剂的种类与用量会影响分离的效果，常用 的有煅石膏、羧甲基纤维素钠(CMC−Na) 和某些聚合物 如聚丙烯酸等。参看《分析化学实验》。 (2)倾注法制板：1. 在玻板上倾倒吸附剂糊，2. 用洁净玻棒 涂铺均匀，3. 稍加振动。 (3)平铺法制板：在水平台面上先放置玻璃平板，上面放置 载板，二边加上玻璃条做成的框边(框边高于载板0.25～ lmm)，将吸附剂糊倒在载板上，刮平并振动均匀。 上述两法所铺薄层板只适宜于一般定性分离，不宜 于定量分离。
2．相对比移值 (Rr) 由于影响 Rf 值的因素很多，要在不同实验室、不 同实验者间严格控制色谱条件的一致性，达到 Rf 的可 比性很困难。因此建议采用相对比移值(relative Rf ；Rr) 作为定性参数： Rr = Rf (a)／Rf (s) =la／ls (19·2)
常见的几种色谱分析方法
由于环境分析的对象广泛、内容多样、样品易变、一般含量极微且分析要求十分严格，所以分析化学中各种先进的方法和技术，在环境分析中都得到了广泛的应用。
但从环境分析的实际应用来看，下面一些方法是更为常用的。
1、化学分析法这是一种以化学反应为基础的分析方法。
它的特点是具有很高的准确度，但灵敏度较低，因此只适于分析环境样品中的常量组分。
目前在测定化学耗氧量、生物耗氧量、溶解氧等例行监测项目中，仍很重要。
2、色谱分析法色谱分析法是一种重要的分离、分析技术，它是将待分析样品的各种组分一一加以分离，然后依次鉴定或测定各个组分。
色谱分析法按所用流动相的不同，主要分为气相色谱法与液相色谱法（包括离子色谱法）。
在环境分析中，他们承担着不多数有机污染物的分析任务，也是对未知污染物作结构分析和形态分析的强而有力的工具。
气相色谱法直到今天仍然是分析环境有机污染物的主要方法，它也是美国环保局于1979年底公布的水中114中污染物分析方法的基础。
但它仅适于分析易挥发性组分，对于70%以上低挥发性、大分子量、热不稳定或离子型化合物，如果不进行适当的衍生化就不能直接测定。
在这方面，液相色谱法恰好可以弥补其不液相色谱法的流动相是液体，它的粘度和密度都比气体大得多，为了使流动相有较快的流速，必须使用高压泵来加速流动相的输送，所以通常又将这类液相色谱法称为高效液相色谱法。
它对于相对分子质量为300-2000的化合物、热不稳定化合物或离子型化合物都能进行分析，因此它的分析对象范围要宽得多。
用它进行环境样品的常规分析，完成一次测定仪需一分钟，其柱后检测器的灵敏度可达皮克级，因此是目前迅速发展的一个领域。
色层分析法是一种经典的分离、分析方法，包括柱层析法和纸层析法，以及在两者基础上发展起来的薄层层析法，它们在环境分析中都有应用，而尤以后者应用更多。
光学分析法包括许多具体的分析方法，它们都是建立在物质发射的电磁辐射或电磁辐射与物质相互作用的基础之上。
《液相色谱法》PPT课件
§7-1 概述
（1）液相色谱简介
（2）液相色谱的发展
（3）液相色谱的分类
§7-2 液相色谱仪
（1）液相色谱仪
（2）液相色谱仪的流程图
（3）液相色谱仪的工作过程
（4）液相色谱仪的基本组成系统
（5）高压泵
精选课件ppt
1
第七章 液相色谱(liquid chromatography)
吸附色谱 吸附能，氢键 异构体分离、族分离，制备
分配色谱 疏水分配作用 各种有机化合物的分离、分析与制备
凝胶色谱 溶质分子大小 高分子分离，分子量及其分布的测定
离子交换色谱
库仑力
无机离子、有机离子分析
离子排斥色谱 Donnan膜平衡 有机酸、氨基酸、醇、醛分析
离子对色谱 疏水分配作用 离子性物质分析
疏水作用色谱 疏水分配作用 蛋白质分离与纯化
手性色谱
立体效应 手性异构体分离，药物纯化
亲和色谱 生化特异亲和力 蛋白、酶、抗体分离，生物和医药分析
两种最常用的色谱法
（一）吸附色谱法（adsorption chromatography） 以吸附剂为固定相的色谱方法称为吸附色
谱法。使用最多的吸附色谱固定相是硅胶，流 动相一般使用一种或多种有机溶剂的混合溶剂。 在吸附色谱中，不同的组分因和固定相吸附力 的不同而被分离。
（6）梯度洗脱装置 （7）进样器 （8）色谱柱 （9）色谱填料 （10）检测器 （11）数据处理系统与自动控制单元
§7-3 新型液相色谱仪简介
（1） waters的UPLC （2）岛津高效率HPLC-2010A/2010C型 （3）岛津LC-VP系列应用系统离子色谱仪
液相色谱法
（2）平面色谱法（Planar Chromatography）
按平面色谱材料不同可分为: 薄 层 色 谱 法 （ Thin Layer
相之间发生反复多次的分配过程。 色谱分离过程是不同物质分子在相对运动的两相之间，多次
分配平衡而得到分离的过程。
2.分配系数（distribution coefficient）K
在一定的温度和压力下，某个组分在固定相（S）与流 动相（m）中达到分配平衡时的浓度之比，称为该组分 的分配系数，即，K = Cs/Cm 。
按流动相分
按机理分
气相色谱（GC） 液相色谱（LC） 超临界流体色谱（SFC） 吸附色谱 分配色谱 离子交换色谱 排阻色谱 亲和色谱
三、色谱分离过程
（一）、色谱法的基本步骤
1、制备成色谱床：根据试样分析目的选择固定相，按操作 形式的要求制备成色谱床（装填成色谱柱，或涂铺到薄层 板上等）。 2、进样（或点样）。将处理好的样品以一定方式加到固定 相的一端。 3、洗脱或展开。将流动相以一定速率载运样品连续通过固 定相，使样品各组分在两相相对运动中彼此分离。 4、收集从色谱床上分离的各组分，进行检测（定性、定量 分析）。
气相色谱仪
气相色谱仪结构示意图
薄层色谱法
1956年出现薄层色谱法。
薄层色谱法
凝胶过滤色谱法
1959年出现凝胶过滤色谱法。
高效液相色谱法
1968年前后产生高效液相色谱法。
高效液相色谱仪
超临界流体色谱法(Supercritical Fluid，SCF)
高效液相色谱法
31
特点： 特点： 氰基键合相选择性与硅胶类似 键合相选择性与硅胶类似， ① 氰基键合相选择性与硅胶类似， 但极性更小。相同流动相， 但极性更小。相同流动相，组分保留 时间小于硅胶。 时间小于硅胶。 氨基键合相 主要用于糖类分析， ② 氨基键合相 主要用于糖类分析， 糖类分析专用柱 分析专用柱。 是糖类分析敏度： 紫外、荧光、电化学、 紫外、荧光、电化学、质谱等高灵敏 度检测器使用。 度检测器使用。 最小检测量： 最小检测量： 10-9 ~10-11 g 4. 高度自动化： 高度自动化： 采用色谱专家系统为核心的色谱智 能化和仿真优化技术， 能化和仿真优化技术，使 HPLC不仅能 不仅能 自动处理数据，绘图和打印分析结果， 自动处理数据，绘图和打印分析结果， 而且还可以自动控制色谱条件。 而且还可以自动控制色谱条件。
32
2. 流动相极性与容量因子的关系 流动相极性大，洗脱能力增加， 流动相极性大，洗脱能力增加， k 减小，tR 减小；反之， k 与 tR 均 减小， 减小；反之， 增加。 增加。 极性小的组分先出柱
33
四、正、反相色谱法 正相HPLC（normal phase HPLC） （ 正相 ） 固定相： 固定相：极性 常用：改性硅胶 硅胶、 常用：改性硅胶、氰基柱 流动相: 非极性（或弱极性） 流动相 非极性（或弱极性） 常用： 正己烷 常用： 流动相极性小于固定相极性
11
第二节 分离机制 一、液-固吸附色谱法 固吸附色谱法
(Liquid-Solid Chromatography)
（一）吸附机理 根据吸附剂对样品中各组分的吸 根据吸附剂对样品中各组分的吸 附能力差异而分离 而分离。 附能力差异而分离。 吸附过程是被分离组分的分子 与流动相分子争夺吸附剂表面活性 中心(active center)的结果。 的结果。 中心 的结果
液相色谱法的分离原理
液相色谱法的分离原理
液相色谱法（liquid chromatography, 简称LC）是一种基于溶液中被分离物质与固定相之间选择性相互作用力的色谱技术。
它利用固定在柱上的固体填充物（固定相）的特异性相互作用能力来实现样品中化合物的分离。
液相色谱法的分离原理主要包括以下几个方面：
1. 吸附色谱分离原理：这是最常见的液相色谱分离原理。
其基本原理是样品中的组分与填充柱固定相表面发生吸附作用，进而通过洗脱溶液中的移动相来实现物质的分离。
不同样品成分与固定相的相互吸附作用力的强弱决定了它们在柱中被保留的时间，从而实现分离。
2. 分配色谱分离原理：这种原理主要通过溶液中的物质在两个不同相之间的分配系数来实现分离。
柱内装有极性或非极性的液体填充物，移动相通过填充物时，样品中的成分会在两相之间进行不断地分配与再分配，从而实现分离。
3. 离子交换色谱分离原理：这种分离原理主要基于固定相上存在离子交换基团（阳离子或阴离子交换树脂）。
样品中的离子与交换基团之间发生离子交换反应，从而实现物质的分离。
离子交换色谱主要用于有机物或无机离子的分离和富集。
4. 凝胶过滤色谱分离原理：该原理利用固定相的孔隙大小与样品成分的分子量相比较，使分子小的物质能渗透进入孔隙内，而分子大的物质则在固定相表面滞留，从而实现分离。
总的来说，液相色谱法利用固定相与溶液中组分之间的相互作用力来实现样品的分离，不同的分离原理会根据具体的实验需求和样品特性来选择和优化。
分析化学答案第18章 经典液相色谱法
第18章 经典液相色谱法思考题3. 已知某混合物试样A 、B 、C 三组分的分配系数分别为440、480、520，三组分在薄层色谱上R f 值的大小顺序如何？解： ∵m sf V V K R +=11，Vs 、Vm 一定，K 越大，R f 越小。
∴ R fA > R fB > R Fc习题1. 假如一个溶质的分配比为0.2，求它在色谱流动相中的百分率是多少。
解：∵2.0==ms W W k %3.83%1002.011%100=⨯+=⨯+=s m m W W W A2. 一根色谱柱长10cm,流动相流速为0.01cm/s ，组分A 的洗脱时间为40min ，A 在流动相中消耗多少时间？ 解：min 7.166001.0100=⨯==u L t 即A 在流动相中消耗的时间为16.7min.3. 已知A 与B 物质在同一薄层板上的相对比移值为1.5。
展开后，B 物质色斑距原点9cm ，此时溶剂前沿到原点的距离为18cm, 求A 物质的展距和R f 。
解：5.19)()(====A B A B f A f t l l l R R R l a = 9×1.5 = 13.5 cm 75.0185.130===l l R A fA4. 今有两种性质相似的组分A 和B ，共存于同一溶液中。
用纸色谱分离时，它们的比移值R f 分别为0.45和0.63。
欲使分离后两斑点中心间的距离为2cm ，滤纸条应取用多长？ 解：设A 组分的展距为l A , 则B 组分的展距为l A +2 ,45.00==l l R A fA 63.020=+=l l R A fB cm l 1.1145.063.020=-=即溶剂前沿至样品原点应为11.1cm 。
5. 用薄层色谱法在高效薄层板上测得如下数据：l 0 = 127mm ，R f = 0的物质半峰宽为1.9mm ，R f =1的物质半峰宽为 4.2mm ，求该薄层板的分离数。
液相色谱法3-TLC、PC
经典薄层
高效薄层
点样体积 溶液浓度
1～5μ l 0.01～1.00%
100～500nl
原点直径 起始线距底边距离 展距 点与点间距 固定相颗粒直径
5mm(3mm) 1.5cm 10～15cm 1～2cm 10～40μ m(20μ m)
1～2mm 1cm 5～7cm 0.5cm 5～10μ m(7μ m)
有些组份在紫外光照射下产生荧光，可在紫外灯下用铅笔 将组份斑点描绘出来。
常用的显色方法有喷洒显色剂、碘蒸气熏或氨水熏等。
3、固定相的变化
平面色谱操作大多是敞开的，与大气接触，与柱色谱不 同。在上样时，吸附薄层会吸收空气中的水或减活，从 而造成结果不重现。
（四）吸附剂的选择
根据被测物极性和吸附剂的吸附能力
被测物极性强——弱极性吸附剂 被测物极性弱——强极性吸附剂
（五）展开剂的选择
1、原则：要同时考虑固定相、流动相、被分离物质的性质。 2、选择合适的Rf值（据展开剂极性） 3、选择较好的选择性（据溶剂的三角形分类）
后，110℃烘烤 专属显色剂 喷雾：人工、机械
（三）定性分析
1、比移值Rf（图示）
Rf
原点到组分斑点质量中心的距离
原点到溶剂前沿的距离
L1 L0
色谱条件一定，Rf只与组分性质有关，是薄层色谱基
本定性参数，说明组分的色谱保留行为。
K’大，则移动慢，比移值小, Rf↓ ； 正相薄层板，对于极性组分 (R f 1)
目测 斑点面积 薄层扫描TLCS
(2)间接测定（洗脱测定）
分离后刮下相应的固定相，用溶剂将组分洗下，进行紫外测定。
（七） 薄层扫描法（ TLCS）
经典液相色谱分析技术—薄层色谱分离分析技术
定量毛细管
全自动点样仪
全自动点样仪
平口微量注射器
仪器分析技术
四、展开容器
展开缸应适合薄层板的大小，并配有严密的盖子，展开缸底部应 平整光滑，侧面应便于观察，常用的有以下两种。
平底色谱专用展开缸
双槽薄层色谱专用展开缸
仪器分析技术
五、显色剂
✓ 通用型：与多数有机化合物反应，显示相同颜色斑点 ✓ 专属型：对特定官能团化合物起反应，显示特定颜色斑点。
• 由于参考物与组分在完全相同的条件下展开，能消除系统 误差，重复性和可靠性都比比移值好。
• Rr可以大于1，也可以小于1。
仪器分析技术
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仪器分析技术
薄层色谱分离分析技术
——薄层色谱参数介绍
仪器分析技术
主要内容
1
相平衡参数
2
分离度
仪器分析技术
一、相平横参数 分配系数K= Cs/Cm
K、k与Rf值的关系：
（ 0.2%～0.5% ） 。具体操作如下
2、市售薄板 ➢ 普通薄层板：玻璃、聚酰胺薄膜、铝基薄层板 ➢ 高效薄层板：固定相粒径为5-7μm
仪器分析技术
自制薄板的操作方法
将1份固定相和3份水（或羧甲基纤维素钠水溶液）在研钵中沿同一 方向研磨混匀，去除表面的气泡后，置玻璃板上使涂布均匀，或倒入涂布 器中，在玻板上平稳地移动涂布器进行涂布(涂层厚度为0.2mm～0.3 mm) ，取涂好的薄层板，置水平台上于室温下晾干后，在110℃活化30分钟， 立即置于有干燥剂的干燥器中备用 。
硅胶类薄层板
仪器分析技术
二、点样
普通板 点样基线：距底边2.0cm 圆点状：直径≤3mm 条带状：点样宽度5～10mm 点或条带间距：＜8mm 点样量：＜10μl
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2、性能
③再生
交换
RSO3-H+ + Na+ + Cl- 再生 RSO3-Na+ + H+ + Cl-
RCH2N(CH3)3+OH- + Na+ +Cl-
准确称取……加正己烷……索氏提取 10h……加样于硅胶柱上(硅胶12g，硅胶柱为 由10x250mm的玻璃柱，湿法装柱)。先用约 50ml石油醚洗涤，再用石油醚—乙醚—甲酸 (89：11：1) 洗脱，收集……
—分析化学. 2002，30（8）：
901
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应用实例
（二）化学分离
藏药湿生扁蕾的化学成分研究Ⅰ
碱性氧化铝 pH 9～10 适于分析碱性、中性物质 如：生物碱
中性氧化铝 pH 7.5 适于分析酸性碱性和中性物质 如：生物碱、挥发油、萜类、甾体及在酸碱中不稳定的
苷类、酯、内酯等化合物 酸性氧化铝 pH 4～5 适于分析酸性、中性物质
如：酸性色素、氨基酸、对酸稳定的中性物质
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6
硅胶、氧化铝的含水量与活性关系
常用：硅胶、氧化铝、聚酰胺、活性炭、大孔树脂
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4
1. 硅胶（SiO2·H2O）中等极性吸附剂
吸附机制： 表面的硅醇基，与物质形成氢键 失活：水与硅醇基结合使其失去活性 活化：105-110℃加热30min
适用范围：微酸性（pH=4~5）， 适于酸性和中性物质
粒度：100-200目
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5
2. 氧化铝
交换 CH2N(CH3)3+Cl-+ NaOH
再生
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3、分离机理：选择系数不同 离子价数越高，原子序数越大，水合离子 半径越小和离子交换树脂的亲和力越大， 即选择系数越大
4、应用：离子型化合物 中药生物碱提取物
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应用实例
（一）样品预处理 高效液相色谱法测定银杏外种皮中银杏酸的含量
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讨论
1、Rf与K有关，即与组分性质（溶解度）以及薄层板 和展开剂的性质有关
2、色谱条件一定，Rf只与组分性质有关，是薄层色 谱基本定性参数，说明组分的色谱保留行为
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3. 相对比移值Rs
Rs
Rf（组） 原点到组分斑点质量中心的距离 L1 Rf（参） 原点到参考物斑点质量中心的距离 L2
2
（一）分离原理
各组分与流动相分子争夺吸附剂表面活性中心， 利用吸附剂表面的活性吸附中心对不同组分的吸附 能力差异而实现分离
固定相为固体吸附剂，属吸附色谱
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3
（二）、吸附剂
对吸附剂的要求： （1）具有较大的表面积和一定的吸附能力 （2）颗粒要有一定的细度(d=75-150μm，即
100-200目)，且粒度均匀 （3）与洗脱剂及样品不起反应
第10章 经典液相色谱法
液相色谱法：以液体为流动相的色谱法称～。
▪ 经典液相色谱：固定相颗粒较大且不均匀
常压下输送流动相
柱效较低
分析周期长
▪ 现代液相色谱：固定相颗粒小且均匀
高压下输送流动相
柱效较高
分析实周用文档期短
1
第1节 液-固吸附柱色谱
（一）分离原理 （二）常用吸附剂 （三）色谱条件的选择
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氢键能力↑强 组分越后出柱
粒度：20~100目
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（三）色谱条件的选择：
依据被测组分、吸附剂和流动相的性质
1. 被测组分性质（极性大小）： 烷烃＜烯烃＜醚<硝基化合物<二甲胺＜酯＜酮
＜醛<胺＜酰胺＜醇＜酚＜羧酸
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2. 吸附剂的选择： 吸附剂的活性↑大，对被测组分的吸附能力↑强 强极性物质——选择弱吸附剂 弱极性物质——选择强吸附剂
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平面色谱法
按固定相类型分类： 硅胶、氧化铝 →薄层色谱法 滤纸 →纸色谱法 聚酰胺薄膜
特点：设备简单，分析速度快 应用：中药的定性鉴别
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平面色谱法
1、原点、溶剂前沿、展距
2、比移值（Rf）
1
l R f l0
l0
Rf 1 k
l
分离的前提： k不同
可用范围：0.2-0.8 最佳范围：0.3-0.5
硅胶含水量% 0 5 15 25 38
活度级 Ⅰ Ⅱ Ⅲ Ⅳ Ⅴ
氧化铝含水量% 0 3 6 10 15
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ活度测定法：Brockmamn法
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7
3、聚酰胺
[ ] O
CH 2
CH 2
C
CH 2
CH 2
CH 2
N
n
H
商品名：锦纶、尼龙-6
不溶于水和有机溶剂，易溶于浓无机酸
分离机制：主要是氢键吸附 适用对象：黄酮类、鞣质、醌
✓ 讨论
• 参考物与被测组分在完全相同条件下展开 可以消除系统误差，大大提高重现性和可靠性；
• 参考物可以是后加入纯物质，也可是样品中已知组分 • 相对比移值Rs与组分、参考物性质及色谱条件有关，
亲脂性成分用氯仿、乙酸乙酯
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4. 三者关系图示：
组分 极性 非(弱)极性
吸附剂 活性小 活性大
流动相 极性
非极性或弱极性
物质的极性与双键、极性基团、分子内氢键有关
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（四）、操作方法
1、色谱柱的制备 要求：填装均匀、紧密，不能有气
泡。 装柱时柱要垂直，表面平整。 固定相的用量适宜。
中国中药杂 志
2004，29（11）：1055
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小结
经典液相柱色谱的主要用途： 色谱分析前样品预处理、化学分离 熟悉各种柱的使用 掌握常用吸附剂的性质 掌握色谱条件的选择 掌握洗脱规律
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第3节 平面色谱法
操作形式:平面 流动相：展开剂 操作：点样、展开 驱动力:毛细管力
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柱体：色谱柱、注射器 方法：干装法、湿装法
2、上样
3、洗脱
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第2节 离子交换柱色谱法
1、离子交换树脂：
树脂：母体骨架是苯乙烯和二乙烯苯聚合而成 的球形网状结构的高分子聚合物
-SO3H、-COOH 钠型
-N(CH3)3+、-NH2 氯型
阳离子交换树脂 阴离子交换树脂
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2、性能
①交联度：交联剂（如二乙烯苯）的用量 阳离子交换树脂交联度以8％， 阴离子交换树脂交联度以4％左右为宜。 ②交换容量
酸性成分：硅胶
碱性成分：氧化铝 黄酮类：聚酰胺
用量： 化学分离：30倍 10倍
除杂：
3、流动相的选择
“相似相溶”原则 ：分离极性大的物质应选用 极性大的溶剂作流动相，分离极性小的物质应选 用极性小的溶剂作流动相，
流动相极性： 烷烃< 苯< 乙醚< 氯仿< 酯 <酮 <醇 <水 常用：不同配比的甲醇-水或甲醇