人教版高中生物必修2-6.2拓展资料：基因探针及其应用

基因探针及其应用

当前人类基因组研究方兴未艾，许多基因的结构、功能相继得到阐明。人类基因组有3×109个碱基对，约有10万个基因在不停地工作，我们该如何从这庞大的基因组中找到自已感兴趣的目的基因，尤其是单拷贝基因？这里就需要用到核酸杂交技术。所谓核酸杂交，是根据碱基配对原理，以已知DNA片断（基因片断）作为探针与待测样品DNA片断进行杂交，从而判断两者的一致性或同源性程度。其中，选择、制备合适的基因探针至关重要。

1. 基因探针的概念

基因探针，即核酸探针，是一段带有检测标记，且顺序已知的，与目的基因互补的核酸序列（DNA或RNA）。基因探针通过分子杂交与目的基因结合，产生杂交信号，能从浩翰的基因组中把目的基因显示出来。根据杂交原理，作为探针的核酸序列至少必须具备以下两个条件：①应是单链，若为双链，必须先行变性处理。②应带有容易被检测的标记。

探查不同的目的基因和不同种类的基因缺陷，应当选择使用不同种类和长度的探针。

2.基因探针的种类

总体上，基因探针可以分为人工合成的DNA探针和天然的克隆探针两钟。

2.1 人工合成的DNA探针（主要是指寡核苷醚探针）

用磷酸三酯法或亚磷酸三酯法等化学法人工合成，目前均由DNA合成仪合成。最常见的寡核苷酸探针长度在18～30个碱基之间。其特异性可以根据需要加以改变，以识别靶序列中单碱基变化。如果被测基因的序列已知，基因缺陷主要是点突变，可以人工合成一段与被测序列互补的寡苷酸探针。通常是两种寡核苷酸探针同时使用，一个与正常序列互补，一个与缺陷序列互补，通过分子杂交，将缺陷基因与正常基因区别开来。

2.2 天然的克隆探针是对天然核酸序列进行克隆得到，大致包括cDNA探针、基因组探针、RNA探针、内含子序列探针和小卫星DNA探针等。最常见的有三种：①cDNA探针：经典方法是先从细胞总RNA中分离出mRNA，再由逆转录途径从mRNA合成cDNA，构建cDNA文库，并用适当方法从文库中筛选出所需的cDNA克隆。也可应用PCR法从总RNA构建cDNA文库，再克隆到

某种质粒中，经细菌扩增，可得大量的重组质粒。通过限制性内切酶切下特异cDNA，再进行标记，即可获得用于杂交的探针。②基因组探针：这类探针是直接从人基因文库中筛选而得，故包含内含子序列。其制备过程大致如下：将人基因组DNA切割成20 kb左右的片断，以λDNA为载体，组建成包括所有人类基因的基因文库。从基因文库中可以筛选出各种特定的基因重组体，再经次级克隆，将一段特异基因重组到不同质粒上。经筛选、扩增后，抽提质粒DNA，并用限制性内切酶切下特异DNA片断，再进行标记，制成基因组探针（见图1）。③RNA 探针：将一段已知的基因序列重组在细菌启动子的后面，在细菌RNA聚合酶的作用下，加入标记底物，就可合成拷贝数很高的RNA探针。RNA探针的特征是单链、与DNA结合更牢、拷贝数高、容易制备。天然的克隆探针具有较长的序列和更高的复杂性，因而通常要比寡核苷酸探针具有更高的特异性，一般也容易获得较强的杂交信号。

3. 基因探针的标记和工作程序

作为探针的核酸样品必须进行标记才能被检测。基因探针的标记可分为放射性同位素标记和非放射性同位素标记两种。

放射性标记常用的同位素有32P、35S、125I及3H等。标记方法是依靠酶促反应将用同位素标记的核苷酸掺入到探针中。标记好的探针即可用于和待测样品DNA进行杂交反应，然后通过放射自显影来检测（图2）。放射性标记探针与放射自显影检测相结合为当前应用的杂交分析提供了最高的灵敏度和最强的分辨率。然而放射性同位素的污染、昂贵、半衰期短、自显影时间长及对人体有危害等缺点，使得放射性标记探针的应用尤其是商业性应用受到一定限制。所以非放射性标记探针取代放射性标记探针将是趋势。