分子荧光分析方法

荧光与分子结构的关系
分子荧光产生的必备条件
分子必须能够吸收激发光 分子必须具有一定的荧光量子产率
荧光强度( I f ) 发射的光量子数 f 吸收的光量子数 吸收的光强度 (I a )
f
k f ki
kf
影响因素：荧光产生过程中， 辐射和无辐射过程； 与每一过程的速率常数有关； kf 分子结构决定（内因）； 主要取决于化学结构和化学环境和结构共同决定。
固定ex=290nm (MAX)
1→1 1→2 1→4
S1
4400 4000 3600 3200 2800 2400 2000 1600 1200 800
1→4 1→ 1
4 3 2 1
S0
400
0 200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 800 850 900
七、分子荧光光谱仪由哪几部分组成？各部分功能如何？与UVVis有何不同？
九、 分子荧光光谱仪的激发和发射光路为何设计呈直角？
谢谢观赏！
小组成员： 201124005杨文丼 201124010张南炀 201124012尹伟
哪些波长光使乊激发产生荧光？哪个波长激发后所产 生的荧光最强？ ——激发光谱 一定波长的激发光使其产生的荧光哪个波长下最强？ ——荧光光谱
可由实验测定物质分子的激发光谱与荧光光谱来说明。
激发光谱与荧光（发射）光谱


一、荧光的检测
光源发出的紫外可见光通过 激发单色器分出不同波长的 激发光，照射到样品溶液上， 激发样品产生荧光。样品发 出的荧光为宽带光谱，需通 过发射单色器分光后再迚入 检测器，检测不同发射波长 下的荧光强度F。由于激发 光不可能完全被吸收，可透 过溶液，为了防止透射光对 荧光测定的干扰，常在与激 发光垂直的方向检测荧光 （因荧光是向各个方向发射 的）。
荧光光谱中荧光强度最强的波长为 λem 。
λex 与 λem一般为定量分析中所选用的最灵敏的波长。
荧光发射光谱 荧光激发光谱
磷光光谱
200
260 320 380 440 500 560 室温下菲的乙醇溶液荧（磷）光光谱
620



激发光谱:固定测量波长(选 最大发射波长),化合物发射的 荧光(磷光)强度与照射光波 长的关系曲线 （图中曲线I ） 激发光谱形状与吸收光 谱形状完全相似，经校正后 二者完全相同！ 发射光谱：固定激发光波长 (选最大激发波长), 化合物发 射的荧光(或磷光强度)与发 射光波长关系曲线(图中曲线 II或III)。
光源 单色器 吸收池
单色器
检测器
信号显 示系统
荧光激发光谱与荧光（发射）光谱
二、激发光谱和荧光光谱
1.激发光谱excitation spectrum：将激发荧光的光源用单色器分光，连 续改变激发光波长，固定荧光发射波长，测定不同波长激发光下物质
溶液发射的荧光强度 (F ) ，作F —λ光谱图称激发光谱。
相对荧光强度
苯 0 10
苯酚 5 18
苯胺 5 20
苯基氰 280~39 0 20
苯甲醚 285~34 5 20
λ emmax (nm) 278~31 285~36 310~40
2）吸电子取代基减弱荧光、加强磷光 —C=0， — COOH ， —NO2
不产生 p →π共轭
O
NO2
硝基苯：不产生荧光、弱磷光
分子被激发到高于S1的电子态的更高振动能级，然而由于内转换和 振动弛豫的速率很快，很快损失多余的能量而衰变到S1电子态的最低振 动能级 尽管分子受激到达不同能级的激发态，不管激发波长如何，电子都 是从第一电子激发态的最低振动能层跃迁到基态的各个振动能层，而与 荧光体被激发至哪一个电子态无关。 无论激发波长是λ1还是λ2，荧光的波长都是λ΄2 激发光谱的形状与发射波长也无关
（1）跃迁类型：具有电子跃迁类型的结构 荧光 n
激发 n 振动弛豫
跃迁是产生荧光的主要跃迁类型
•特点： •较大的摩尔吸光系数 •较短的激发态寿命10-7~10-9s •串越至三重态几率小
（2）具有大的共轭π键结构
共轭度越大，荧光越强。 原因 ：共轭体系越大，离域大π键的电子越容易激发，荧光与磷光越容易
从激发光谱图上可找到发生荧光强度最强的激发波长λex，选用
λex可得到强度最大的荧光。
荧光激发光谱与荧光（发射）光谱
2. 荧光光谱fluorescence spectrum：选择λex作激发光源，用另 一单色器将物质发射（发射光谱） 的荧光分光，记录每一波
长下的 F，作 F - λ 光谱图称为荧光光谱。
产生。
化合物
苯 0.1 1 205 278
萘 0.29 286 321
蒽 0.46 365 400
丁 省 0.60 390 480
戊 0.52 580 640
省
F
λexmax(nm) λemmax (nm)
（3）具在刚性平面结构
0.92
1
0.18
（4）取代基效应
1）给电子取代剂加强荧光 —HN2， — NHR ， —NR2， — OH， — OR ， — CN 产生 p →π共轭 化合物
二苯甲酮：弱荧光、强磷光 S1 →T1的系间窜跃产率接近1
3）取代基的位置
空间位阻对荧光发射的影响
H3C -O3S N CH3
H3C SO3N CH3
F=0.75
立体异构体对荧光发射的影响
H C H C
F=0.03
C H
C
H
反式二苯乙烯 强荧光物质
顺式二苯乙烯 非荧光物质
（5）重原子取代基效应
—Cl， — Br ， —I
S1 →T1的系间窜跃由于重原子的存在增强 含有重原子的溶剂，由于重原子效应荧光减弱、磷光增强。
Βιβλιοθήκη Baidu 思考题：
一、什么是分子发光？分子发光有哪几类？ 二、分子荧光或磷光是如何产生的？ 三、什么是荧光激发光谱？什么是荧光发射光谱？各有何特点和 作用？ 四、为什么荧光发射光谱与激发光波长无关？ 五、何谓Stokes位移？Stokes位移是如何产生的？ 六、分子产生荧光的必备条件是什么？
ex =290nm (MAX)

em= 620nm(MAX)
荧光激发光谱
荧光发射光谱
200
250
300
350
400
450
蒽的激发光谱和荧光光谱
500 nm
荧光光谱与激发光谱形状极为相似，且二者成镜像对称
激光光谱与荧光光谱的应用



1、定性分析 将荧光物质的激发光谱和荧光光谱图的形状、 位置与标准溶液的光谱图迚行比较。跟紫外可 见吸收光谱法相比，因参照图更多，可靠性更 好。 2、定量分析 根据荧光光谱中最大激发波长λex和最大荧光 波长λem，可得到定量分析的最佳条件。
分子荧光分析方法
制作人：杨文丼
第一节 概述

一、分子荧光的定义及发展 二、分子荧光的特点及应用 三、分子荧光与紫外—可见分光光度法的异同
第二节 分子荧光法的基本原理

一、荧光的产生 二、激发光谱和荧光光谱 三、荧光与物质的分子结构
已经知道，荧光是在一定波长光照射下，某些分子受
到激发后发出光量子所致。对一种特定的分子来说：
荧光激发光谱与发射光谱的特征
a.Stokes位移—荧光波长比激发光谱的波长较长
在溶液中，分子荧光的发射相对于吸收位移到较长的波长，称为 Stokes位移。这是由于受激分子通过振动弛豫而失去转动能，也由于溶 液中溶剂分子与受激分子的碰撞，也会有能量的损失。因此，在激发和 发射乊间产生了能量损失。
b.发射光谱的形状与激发波长无关
c. 镜像规则 通常荧光发射光谱与它的吸收光谱（与激发光谱形状一样） 成镜像对称关系。
基态上的各振动能级分布与第一激发态上的各振动能级分布类似； 基态上的零振动能级与第一激发态的各振动能级乊间的跃迁和反跃迁 几率相等
IF4800
4 3 2 1
固定em=620nm(MAX)
1→ 4 1→ 3 1→ 2