血库的技术操作规程

血库的技术操作规程
1．目的：建立血库各项操作的技术规范，确保输血安全和血型血清学疾病的准确诊断。

2．依据：全国临床检验操作规程（第二版）、临床输血枝术规范
3．范围：血库工作
4．职责：血库工作人员
5．1 ABO血型定型：
5．1．1原理: 常规的ABO定型,必须用已知型特异性的试剂检查红细胞的抗原(forward typing,正向定型、红细胞定型)，以及用已知的试剂红细胞检查血清中的抗体。

5．1．2试剂和材料:
5．1．2．1 抗A、抗B分型血清试剂，效价分别不低于64和128。

5．1．2．1 3%-5%A、B、O型红细胞盐水悬液。

5．1．2．1 3%-5%受检者红细胞悬液和受检者血清
5．1．3方法:（试管法）：
5．1．3．1正定型: 取试管2支，分别标上A、B字样，向A管滴加A定型试剂2滴，向B管滴加B定型试剂2滴。

向A、B管各滴加待检血样的2%红细胞悬液各1滴，摇匀3000r/min离心15秒，
5．1．3．2反定型：取３支试管分别标上ＡC、ＢC、ＯC,各加受检者血清2滴于管底,分别滴加A、B、O型试剂红细胞悬液1滴混匀，以3000r/min离心15秒，按照有无凝集判定结果：
血型 A 红细胞B红细胞O红细胞
A - + -
B + - -
O + + -
AB - - -
以上，以正、反定型相一致来判定病人血型，若正、反定型不一致，要进一步作血型鉴定。

5．1．4附注: 正、反定型不一致的原因，有技术问题或血清本身问题，常见者有以下数种：5．1．4．1分型血清试剂效价太低亲和力不强。

5．1．4．2红细胞悬液过浓或过淡，抗原抗体比例不适当，使反应不明显误判为阴性反应。

5．1．4．3受检者红细胞抗原位点过少（如亚型）或抗原性减弱（见于白血病或恶性肿瘤）以及类B或cisAB.
5．1．4．4受检者血清蛋白紊乱(高球蛋白血病)或实验时温度过高,常引起细胞呈缗钱状排列. 5．1．4．5受检者血清缺乏应有的抗A或抗B抗体,如丙种球蛋白缺乏症.
5．1．4．6各种原因引起的红细胞溶解,误判为不凝集,部分溶血时,可溶性血型物质中和了相应的抗体.
5．1．4．7由细菌污染或遗传因素引起多凝集或全凝集往往是正反定型不符的原因.
5．1．4．8血清中有意外抗体,如自身抗I,常干扰定型.
5．1．4．9老年人血清中抗体水平大幅度下降.
5．1．4．10如发现ABO正反定型不一致,首先要重复做试验一次.严格执行操作规程,使用质量合格的试剂以及细心观察和解释试验结果,就可以解决问题.对于一些疑难问题必须进一步研究. 5．1．5临床意义：输血原则为同型相输，ABO血型的确定是输血前的第一步检测。

母婴ABO血型不合引起的新生儿溶血病器官移植，供、受体必须ABO血型相符。

5．2 Rh血型定型
5．2．1 原理: Rh血型系统,主要有五种抗血清,即抗D、抗C、抗 E、抗 c、抗 e。

在临床输血中,一般只做D抗原的鉴定,凡被检红细胞和抗D血清凝集者为Rh阳性，不凝集者为Rh阴性。

5．2．2 试剂和材料：
5．2．2．1 IgM/IgG抗D血清
5．2．2．2 3%-5%病人红细胞悬液
5．2．2．3 已知Rh阳性和Rh阴性5%红细胞悬液各1份，作阴阳对照
5．2．3 方法：试管直接离心法：
5．2．3．1 加IgM/IgG抗D血清1滴，加3%-5%病人红细胞悬液1滴，混匀静置1分钟，3000转/分，离心1分钟。

并作好阴、阳性对照。

5．2．3．2结果判断：凝集者为Rh（D）阳性；阴性者，要作进一步的检查，防止D U型误判为Rh 阴性。

5．2．4附注:
5．2．4．1 Rh定型时应按抗D血清试剂的使用说明书进行,并注意必须要有严格的对照试验, 包括抗原的阴、阳性对照以及试剂对照试验。

5．2．4．2对于Rh阴性标本,除了做好D U型鉴定外,还应做直接抗人球蛋白试验来分析,防止因为抗体占满红细胞抗原位点,导致假阴性的出现.
5．2．4．3对于Rh阴性急救病人,在库存没有相应Rh阴性红细胞,可以在交叉配血相合的前提下,与临床科室沟通,输Rh阳性红细胞.但在配(发)血报告单上要特别说明.
5．2．4．4假阳性反应原因分析:
受检细胞已被免疫球蛋白致敏,或标本血清中有引起红细胞凝集的因子.
受检细胞与抗血清孵育的时间过长,含高蛋白的定型试剂会引起缗钱状形成.
标本抗凝不当,受检过程中出现凝血或小的纤维蛋白凝块,误判为阳性.
定型血清中含有事先未检测的其它特异性抗体,造成假阳性定型结果.
多凝集细胞造成定型的假阳性.
检定用的器材或抗血清被污染,造成假阳性.
可能出现假阴性的原因:
受检细胞悬液浓度太高,与抗血清比例失调.
漏加或错加定型血清.
定型血清的使用方法错误,没按说明书进行.
离心后重悬细胞扣时,摇动用力过度,摇散微弱的凝集.
抗血清保存不当,导致失效.
5．3 交叉配血的要求和内容：
5．3．1 交叉配血试验也称配合试验，实际上是检查不配合性，使患者、献血者血液间没有可测到的不相配合的抗原、抗体成分。

交叉配血试验通常包括：
受血者血清对供血者红细胞一般称“主侧”配血，因为它是检测对供者红细胞起发应的抗体。

受血者红细胞对供血者血清一般称“次侧”配血，因为它是检测对受血者红细胞起反应的抗体。

受血者红细胞对受血者血清目的是显示自身抗体、直接抗球蛋白试验阳性及红细胞缗钱状假阳性的存在，是自身对照。

5．3．2 交叉配血应在37o C孵育，除了盐水介质、至少还要有抗球蛋白试验，有条件的还可增加白
蛋白介质法、低离子强度介质法（LISS）、酶法等方法。

5．3．3 在交叉配血的任何步骤均不产生溶血或凝集的结果，供者的血液成份才可给患者输注。

5．3．4 一些特殊问题，交叉配血试验中，可能出现的一些问题列举如下：
5．3．4．1 缗钱状的形成血清在室温和37o C中，使红细胞出现了假凝集，造成配血错误，常见于多发性骨髓瘤、巨球蛋白血症、霍奇金病，以及其它表现为血沉加速的一些病例中。

5．3．4．2 交叉配血试验结果不相容，显示有未检明的同种抗体的存在。

在室温反应中，显示有自身抗体。

在抗球蛋白试验中显示有自身抗体。

5．3．4．3存在抗体筛选试验阴性和交叉配血结果阳性的现象，提示可能有未检明的抗体存在。

5．3．4．4交叉配血试验中，离心力不当，造成了假阳性和假阴性。

5．3．4．5水浴箱温度不正确，造成错误的结果。

5．3．4．6蒸馏水中某些离子可造成不正确的结果.
5．3．4．7红细胞不正确的洗涤和悬浮,使抗球蛋白试验出现假阴性。

5．3．4．8血清中含有溶血性抗体,则相应红细胞被溶解而不是凝集,交叉配血结果应为阳性。

如果血清中存在补体而溶血，血清应灭活后再作试验。

5．3．5临床意义：检测受、供血者之间的相容性，预防输血性溶血的发生，确保输血的安全。

5．4 盐水介质配血法（试管法）(本法现不作本院常规工作方法，仅必要时采用)
5．4．1方法
5．4．1．1 抽取受血者静脉血3-4ml，待凝固后分离血清，并将红细胞配成3%盐水悬液。

5．4．1．2将献血者（或供血者）血样以同样方法分离血清，并配成3%红细胞悬液。

5．4．1．3取洁净小试管（10×60MM）两支，1支标明受血者血清（PS）+献血者（或供血者）细胞（DC）为主侧管，另1支标明献血者（或供血者）血清（DS）+受血者细胞（PC）为次侧管。

5．4．1．4按标记主侧管放受血者血清2滴，加献血者（或供血者）红细胞悬液1滴。

次侧管放献血者（或供血者）血清2滴，加受血者红细胞悬液1滴。

混匀，以120g/分离心1分钟，或1300g/分，离心15秒。

轻轻摇动试管，观察结果。

冬季室温较低，应将试管保温，以防冷凝集素引起的凝集反应。

5．4．2结果判断 ABO 同型配血，主侧和次侧均无溶血及凝集表示无输血禁忌，可以输血。

5．4．3附注
5．4．3．1盐水介质配血法也可用玻片法进行操作。

5．4．3．2如盐水介质配血结果阴性，可将原标本做酶法或抗球蛋白法配血。

5．5 抗球蛋白配血法(本法现不作本院常规工作方法，仅必要时采用)
5．5．1方法
5．5．1．1 取试管2支,分别标明主侧和次侧,主侧管加受血者血清2滴和献血者(或供血者) 3%红细胞悬液1滴,次侧管加献血者(或供血者)血清2滴和受血者3%红细胞悬液1滴.
5．5．1．2混合置37 o C 水浴致敏30分钟,取出后用盐水洗涤3次,倾去上清液.
5．5．1．3 加最适稀释度抗人球蛋白血清1滴, 120g/分，离心1分钟，或1300g/分，离心15秒, 观察结果。

5．5．1．4阳性对照：3%不完全抗D致敏的Rh阳性红细胞悬液1滴，加抗球蛋白血清1滴。

阴性对照：3%正常AB血清致敏Rh阳性红细胞悬液1滴，加抗球蛋白血清1滴。

盐水对照：献血者（或供血者）3%红细胞盐水悬液1滴，加等渗盐水1滴，另1管受血者3%红细胞盐水悬液1滴加等渗盐水1滴。

5．5．2结果判定如阳性对照管凝集，阴性对照管盐水不凝集，主侧、次侧配血管都不凝集，表示无输血禁忌。

5．6 改良凝聚胺法（试剂采用：中山生科，产品标准号：YZB/ 国1262-2003，产品注册号：国食药监械（准）2003第3400180）（本法为常规工作采用）
5．6．1 试验原理:
红细胞血型抗原及相应的抗体经低离子介质(L.I.M)快速孵育致敏后,加入由凝聚胺(polybrene)
等带正电荷的大分子聚合物,以减弱红细胞静电斥力,缩短红细胞间距,加速分子运动,帮助红细胞血型抗原与相应的抗体紧密搭桥,再利用机械离心力作用,呈现出肉眼可见的凝集状,这种凝集反应中存在的非特异性免疫凝集因素,可以被附加的假凝集清除液清除,而特异性的免疫凝集对附加的假凝集清除液不敏感,能维持较长时间的凝集状,由此可特异地检出相应的血型抗原或抗体(IgG或IgM). 5．6．2 实验过程：
主（次）侧管加入受（供）血者血清2滴，加供（受）血者3%-4%红细胞盐水悬液1滴。

各管加低离子介质0.8ml,混匀，静置1min,加凝聚胺2滴，混匀，以3500r/min离心15s,倒出上清液（残留约0.1ml）,扣摇，肉眼可见明显的凝集状（如无凝集须重做），再加1滴假凝集清除液于管底，轻摇，凝集1min内消失呈均匀混悬液，再将反应物倒于玻片上借助显微镜观察，镜下无凝集红细胞为阴性，1min内凝集不能被消除，为阳性。

5．6．3 结论：阳性表示受（供）血者血清中含供（受）血者红细胞血型抗原相应的抗体(IgG或IgM)，供受者不相容，阴性表示供受者相容。

5．6．4注意事项：
5．6．4．1 操作者须严格按照操作说明书进行试验，红细胞浓度、血清滴量、反应时间、离心速度等均可影响试验结果。

5．6．4．2检测标本如为非抗凝血，标本含抗凝成分的含量过高明显干扰凝集反应时，可适当调加凝集胺的滴量，以中和抗凝成分的干扰。

5．6．4．3试验温度以20-37o C为宜,若疑为冷凝集,37o C水浴1分钟,在此温度下观察,凝集消失,说明存在冷凝集.
5．6．4．4试剂检验:取自身血清与自身红细胞用本试验方法作阴性对照试验;取IgG抗D血清与抗D阳性的红细胞用本试验方法作阳性对照,对照试验结果符合,试剂有效。

5．6．4．5疑难结果以抗人球蛋白试验(AGT)作终判试验.
5．7 ABO -HDN 血型血清学检查
5．7．1原理：新生儿溶血病是由母婴血型不合引起,可见于ABO、Rh及MN等血型系统。

胎儿和新生儿红细胞被来自母亲的IgG抗体所包被，并在婴儿的网状内皮系统内受到免疫性破坏。

病情的严重程度不同，重者在宫内死亡，轻者临床上仅由血清学试验检测才能发现。

5．7．2婴儿及其父母ABO血型鉴定：此鉴定是检查新生儿溶血病的第一步，以便考虑以后进一步检查的程序。

5．7．3患儿血样检查：诊断ABOHDN的最有力证据是证实患儿红细胞被来自母亲的IgG抗A（B）所致敏。

5．7．4直接抗人球蛋白试验
5．7．4．1 取患儿红细胞配成5%悬液。

以IgG抗D血清致敏O型红细胞（37o C、1小时）配成5%悬液作为阳性对照。

5．7．4．2取玻璃试管三支，其中两支加5%患儿红细胞悬液各50ul，另一支加阳性对照红细胞悬液50ul，以生理盐水洗涤三次。

5．7．4．3 一支患儿红细胞与阳性对照管加抗人球蛋白各2滴，另一支患儿红细胞加生理盐水100ul作自身阴性对照，3000转/分离心15秒（两次）。

5．7．4．4轻轻摇散，在低倍镜下观察有3-5个红细胞聚集可判阳性（可使红细胞呈流动状态下观察，可见聚集的红细胞团不分散，一块流动）。

5．7．5 患儿红细胞抗体释放试验（热放散法）
5．7．5．1患儿红细胞用盐水洗涤3次，取压积红细胞1ml左右，加等量或半量盐水，置试管中。

5．7．5．2将试管放在56o C水浴中不断振摇10分钟,取出后置预先准备盛有56o C热水的离心套管内,立即3000转/分，离心3分钟。

吸取上层液（即放散液）备用。

5．7．5．3将放散液分为3份，加入3个小试管中，分别加入3%的A、B、O型酶处理红细胞悬液1滴，37o C致敏，60分钟。

5．7．5．4取出后用盐水洗3次，加入抗IgG（或广谱）最适稀释度抗人球蛋白血清2滴，3000转
/分，离心15秒2次。

肉眼观察结果。

按图1分析结果。

（图1）患儿红细胞抗体释放试验意义
指示红细胞
A B O 意义
+ - - 放散出IgG抗A
- + - 放散出IgG抗B
+ + - 放散出抗C(交叉反应性抗体),或同时放散出IgG抗A
或抗B
- - - 未放散出抗体
O※ O + 放散出ABO血型以外的抗体
注: ※=+或-
5．7．5．5在放散试验的结果观察中,会遇到一中交叉反应性抗体(抗C),这是O型人血清中除抗A、B以外的第三种抗体，表示的符号有抗C、抗A、B（抗A+B）等。

它针对的特异性是A和B抗原所共有的，因而它能凝集A型和B型红细胞。

5．7．5．6 Wiener等认为一个血型抗原可以有多种特异性（见图2）如一个A1血型抗原有A1、A和C三个特异性，而不是在红细胞上有A1、A和C三个抗原。

（图2）特异性解释
红细胞上
血型抗原特异性血清中抗体
A型 A1 A1、A 、C 抗 B
B型 B B、C 抗 A
O型 - - 抗A、抗B、抗C
AB型 AB A、B、C
5．7．6患儿血清中游离抗体测定
5．7．6．1取小试管3支，每支加患儿血清2滴。

5．7．6．2分别加入3%的A、B、O型红细胞盐水悬液（标准红细胞）1滴，37o C致敏60分钟后取出，若致敏已发生凝集，证明存在相应的抗体，则不必继续往下做。

5．7．6．3 若不凝集，用盐水洗3次后加入抗IgG（或广谱）最适稀释度抗人球蛋白血清1滴，3000转/分，离心15秒2次。

轻轻摇散，肉眼观察结果。

按图3分析结果。

（图3）新生儿血清中游离抗体检查
指示红细胞
A B O 意义
+ - - 游离的抗A
- + - 游离的抗B
+ + - 游离的抗A、抗B或抗C
O ※ O + 游离的ABO系统以外抗体
- - - 无游离抗体
注: ※=+或-
5．8 产前（HDN）血型血清学检查：包括产妇夫妻各自ABO血型检查和不规则抗体筛选以及IgG 抗A（B）测定。

以下介绍IgG抗A（B）的测定:
5．8．1原理： ABO-HDN由于 IgG抗A（B）引起，所以检测母亲血清中有无IgG性质的抗体并滴定其效价，即可预测ABO-HDN发生的可能性。

人血清中抗A、抗B往往是IgG和IgM混合物，它们具有相同的特异性，要单独测定IgG抗A（B）必须除去IgM抗A（B）的干扰。

方法有巯基乙醇法（2-Me）
和HAB血型物质中和法，本院血库采用了巯基乙醇法（2-Me）。

5．8．2巯基乙醇法原理
血清以巯基乙醇（2-Me）处理后IgM抗体分裂为6-7亚单位虽然仍保持与抗原结合的能力，但已失去其与相应红细胞凝集的作用。

IgG抗体分子则不被称为2-Me灭活，保持与红细胞致敏的血清学特性。

IgA抗体分子可部分被灭活（7S单体不被影响，9S及11S多聚体被灭活）。

5．8．3试剂和材料：
5．8．3．1 0．2M-Me应用液：取2-Me１．6ml,以PH 7.4 PBS(KH2PO4 １．73g,NA 2 H2PO4’12H2O 19.35g,NaCL 8g,加蒸馏水至100 ml ), 稀释至100 ml ,分装安瓶,每支1ml或2ml保存4 o C备用。

也可购买已制成2-Me商品试剂（本院采用中山生科公司配好的Me应用液）。

本试剂必须避光保存。

5．8．3．2 受检者血清
5．8．3．3 3%A型和B型红细胞PBS(或NS)悬液
5．8．3．4 一步法促进剂
5．8．4 方法
5．8．4．1 吸取受检者血清0.4ml,加2-Me应用液0.4ml,混合将试管口塞紧,置37o C水浴中2小时.
5．8．4．2排列小试管(10mm╳60mm)两排,每排8支，每管各加NS 0.1ml。

5．8．4．3每一排的第一管加2-Me处理血清0.1ml,混合后吸出0.1ml移至第二管内，以此类推,作倍量稀释至第8管,每管内留有1：4、1：8……1:512不同稀释度血清各0.1ml。

5．8．4．4第一排每管各加3% A型红细胞悬液50ul,第二排每管各加3% B型红细胞悬液50ul,置37℃水浴中孵育1min，加一步法促进剂1到2滴， 3000转/分,离心15秒。

轻轻摇动试管,观察结果。

5．8．4．5结果判定：红细胞凝集的最高稀释度的倒数即为IgG抗A或抗B效价，正常人效价一般小于1：32。