转基因猪的研究进展

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猪业科学
SWINE INDUSTRY SCIENCE 2009年 第9期823 讨论
本次试验结果表明，经过近5年的选优提纯，目前杜洛克、长白、大白猪的生长和肉用性能已达到较高水平，生长肥育猪的平均日增重都在800 g 以上，料肉比在2.9以下，背膘较薄，眼肌面积和后腿比例大，瘦肉率达68%左右，肉质完全正常，无PSE 肉、DFD 肉，取得了较理想效果。

这些品种生产的杜×长大日增重达926 g，料肉比2.53，而且杂优率十分明显，分别达13.1%和-7.66%。

文中胴体和肉质性状的杂优率大多较低，这符合一般规律。

至于失水率、肉色及大理石纹等级及贮存损失的杂优率出现偏高、偏低现象，可能主要原因在于抽样误差。

主要参考文献：
[1]施启顺, 柳小春主编. 养猪业中的杂种优势利用[M].长沙: 湖南科技出版社, 1997.
[2]施启顺, 柳小春，陈斌，等.杜洛克、长白、大白猪肉的杂交效果分析[J].上海畜牧兽医通讯,2005,(1):28-29.
[3]施启顺，柳小春，陈斌 等. 杜洛克、长白、大白猪间的二元、三元杂交效果分析[J].养猪,2005,(5):17-18.
[4] 施启顺，柳小春，吴晓林. 杜洛克、长白、大约克猪生长和肉用性状的杂交参数估计[J]. 中国农业科学，1998，31（4）：65-69.[5] Moeller S.J., R.N. Goodwin, R.K. Johnson et al. The nationa l pork producers council maternal line national genetic evaluatio n program: a comparison of six maternal genetic lines for female productivity measures over four parities[J]. J. Anim. Sci., 2004,82(1):41-53.
[6]Rothschild M F, Runvinsky A. The Genetics of The Pigs[M]. CA B INTERNATIONAL,1998,21-34,488-491.
(收稿日期：2008-09-17)
转基因猪的研究进展
杜金芳，王 慧*
（山东农业大学动物科技学院，山东泰安 271018）
摘 要：自80年代转基因动物模型建立以来，转基因动物已应用于生命科学的各个领域，尤其在生物反应器、异种
器官移植和提高动物生产性能等方面得到了广泛的应用。

转基因动物越来越受到人们的重视，由于猪在解剖、组织、生理和营养代谢等方面均与人类最接近，又是一种重要家畜，所以转基因猪的研究越来越受重视。

本文综述了转基因猪的常用技术方法，尤其是显微注射法、核移植法等几种主要方法，评价了转基因的研究概况和转基因猪的热点应用领域等。

关键词：转基因猪；核移植；显微注射法
转基因技术就是用实验方法将外源基因导入猪的基因组，使外源基因与猪的基因组进行整合并在猪体内表达的技术。

猪是与人类生活关系最为密切的家畜之一，由于猪具有妊娠期短、繁殖力高和后代生长快等特点，使猪成为常用的实验动物；又由于猪在解剖、组织、生理和营养代谢等方面均与人类最接近，所以随着转基因技术的发展和人民生活水平的提高，转基因猪成为不可替代的研究模型，因而，吸引了众多科学家的极大热情。

目前，随着分子生物学技术的不断发展和新的精子介导法等转基因方法的不断完善，使转基因猪的研究和应用前景更加诱人。

1 转基因猪的研究方法
1.1 显微注射法
显微注射法是在显微镜下将外源基因注入到原核期或经重构发育至原核期的受精卵细胞的胚胎原核中，注射的外源
基因与胚胎基因组融合，然后进行体外培养，最后移植到受体母畜子宫内发育，这样分娩的动物体内的每一个细胞都含有新的DNA 片段，此即转基因后代。

显微注射法的缺点是：效率较低，位置效应(外源基因插入位点随机性)造成表达结果的不稳定性，动物利用率低。

由于需要注射进核内，所以会有机械损伤而影响细胞的正常生长。

其优点是外源基因的转移率和整合效率都较高。

猪的转移率和整合效率为0.98%。

世界上首次报道的转基因猪就是Hammer 等(1985)用原核注射技术得到的。

1.2 核移植转基因法
细胞核移植一般分为胚胎细胞核移植和体细胞核移植。

体细胞核移植转基因猪的研究进展飞速。

具体的技术方法是，先把外源基因与供体细胞在培养基中培养，使外源基因整合到供体细胞上，然后将供体细胞的细胞核移植到去核卵母细
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胞，重新组成胚胎，再移植到假孕母体，待其妊娠、分娩，
便可得到转基因的克隆动物。

这种方法具有相对较大的优越
性：成功率高，约是显微注射法的2倍；可以预先鉴定供体
细胞与外源基因是否融合；可对基因整合状况及整合位点进
行鉴定和评估；可以预测基因的表达情况；没有位置效应，
节省供体和受体动物的数量及费用。

尽管如此，猪的体细胞克隆效率仍然很低，许多环节
的机制尚不清楚。

2000年，Polejaeva等采用的二步移植法
(Double　nuclear　transfer)也获得了体细胞核移植仔猪。

该法使用MⅡ期卵母细胞在受精时已被精子激活，从而避
免了人工电激活对NT胚造成的不良影响。

因此，被认为比较适合用于猪成体细胞核移植。

2001年，Booth等将除去透明带的卵母细胞用作猪体细胞核移植的受体，并证明了无透明带技术也可应用于猪的核移植。

2002年，Yin等报道用Demecolcine处理MⅡ期卵母细胞，简化了技术方法，具有一定的实用意义。

美国密苏里大学通过克隆技术培育出了含荧光水母基因的小猪。

2006年12月24日，东北农业大学刘忠华教授的转基因克隆猪获得成功，3头含绿色荧光蛋白的转基因克隆猪自然分娩，这是继美国、韩国和日本之后第四例成功通过体细胞核移植方式生产出的绿色荧光蛋白转基因克隆猪。

1.3 单精子显微注射法
猪单精子显微注射(ICSI)技术尚需完善，目前的研究主要集中在注射前精子处理和ICSI卵母细胞的激活处理对ICSI 卵母细胞发育的影响上。

与其他哺乳动物相比，猪的ICSI生产效率依然很低，提高猪ICSI效率的方法还很少，卵母细胞的激活与受精、精子解聚与卵母细胞的激活、胚胎发育之间的精确作用尚未完全搞清楚。

猪ICSI技术不仅起步较晚，而且整个技术环节发展较缓慢，直到2000年，Martin采用体内成熟卵母细胞经ICSI首次得到存活的小猪。

2003年，Michiko等报道了体外成熟培养(IVM)卵母细胞经ICSI得到3头健康小猪。

随着猪IVM 卵母细胞培养体系的建立和成熟，由IVM-ICSI生产的猪的胚胎移植到受体后获得的小猪也逐渐增多。

2006，Kurome 等把精子与携带有人白蛋白(hALB)基因和绿色荧光蛋白(GFP)基因的DNA序列片断共孵化，通过ICSI方法生产的胚胎移植后生产出一头含有hALB和GFP基因的转基因小猪，并且分别用从部分怀孕母猪中获得的胎儿和刚出生的小猪身上取肺、肾、肌肉组织，建立了含有hALB和GFP基因的纯细胞系；又采用体细胞核移植法，获得了6头完整表达hALB和GFP基因的克隆小猪。

由此，形成了以精子载体转基因-ICSI-核移植方法引入的基因在胚胎和小猪中表达一致完整，为生产转基因猪提供了一条简单易行的技术路线。

1.4 扎刺法
扎刺法是在显微注射法定量注射困难的基础上研究出来的，其操作过程是：将胚胎放在含有目的基因的培养液里，用细针快速扎入细胞核后快速拔出，此时外源基因就进入细胞核，细胞膜因结构的流动性而随之关闭，胚胎内进入的溶液很少。

这种操作比显微注射快，对胚胎损害小，但转基因效率较低。

1.5 逆转录病毒感染法
RNA病毒感染宿主细胞后，可反转录成相应的DNA，并整合到宿主细胞的染色体DNA上，据此，可以将外源基因携带进宿主细胞，得到转基因动物。

这种方法在转基因猪的研究中较少使用。

1.6 其他方法
其他转基因方法，如精子载体法、胚胎干细胞介导法、人工酵母染色体法、电转移法等，不适合在转基因猪的研究中使用。

2 转基因猪的应用
2.1 基因工程育种
转基因育种就是通过转基因技术，将外源基因导入动物受精卵内组成一个新的融合基因，使其在动物体内整合与表达，产生具有新的遗传特性的动物。

这样，可以避开物种间杂交不育的生殖隔离，在较短时期内培育出常规方法不能育成或难以育成的动物品种，从而加快动物改良进程，使选择效率提高，改良机会增多，因而极具研究价值。

2002年，日本近畿大学的入谷明等，把菠菜FAD12遗传基因植入猪的受精卵内，成功培育出了比普通猪不饱和脂肪酸含量高20%的转基因猪，为猪的新品种培育作了有益的尝试。

最近，美籍华裔科学家戴易帆等，将一种名为FAT-1的基因植入猪的胚胎中,
之后借助克隆技术培育出了富含
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O-MEGA-3脂肪酸的猪。

FAT-1的基因取自秀丽线虫，该基因可使普通猪肉的OMEGA-6脂肪酸转变成OMEGA-3脂肪酸(Lai 等，2006)。

2.2 异种器官移植供体
猪器官的形状、体积及遗传物质与人类有很高的相似性，被认为是人类异种器官移植的理想供源。

欧洲国家已将猪的心脏、肾、肝及神经细胞移植给相应器官衰竭的晚期患者及帕金森病患者，但寿命很短。

1906年，Jaboulay 将猪肾移植给一位患肾功能衰竭的年青妇女，移植物存活了3ｄ，手术后病人死于尿毒症。

阻碍异种器官移植工作获得成功的首要问题是排异反应。

英国剑桥伊姆朗公司1993年6月宣布已培育成功37头具有人类基因的转基因猪。

这种猪含加速人体基因退化因子，可防止人们对新移植器官产生排斥现象。

2008年Ekser B 等人研究了异种器官的应用，猪的器官转移到灵长类动物身上的应用获得了很好的结果。

基因敲除猪的诞生坚定了用猪作为异种器官移植供体的信心，因其含有特异性的基因，可使人对猪器官产生排斥作用的免疫系统失活。

目前，利用转基因猪技术克服超级性排斥反应（HAR）的重大突破来自三类方法：一是将人的补体调节蛋白(complement　regulatory　proteins，CRPs)，即以CD55、CD59、CD46为主的细胞膜表面分子的基因转入
猪体内，替代不能有效调节人补体作用的猪自身的CRPs，在不同环节抑制膜表面攻击单位的形成，来保护血管内皮细胞；二是改造HAR 的靶抗原的基因α-1，3Gal。

采用基因敲除技术去掉猪α-1，3Gal 和α-1，3GT 基因；三是联合转基因的思路，进一步研究如何更好地在猪体内进行不同基因的共表达来抑制HAR，将可能成为异种移植中HAR 防治的又一新启示。

总之，将转基因猪的器官用于人体器官移植的技术虽然还存在费用高、效率偏低、操作复杂等问题，但作为医学史上治疗器官衰竭的一种新的途径，必将为患者们带来希望。

2.3 动物生物反应器
1991年6月美国DNA 公司成功的获得了能产生大量人血红蛋白的转基因猪，并于1992年向美国食品药物管理局
（FDA）申报该新药。

Paleyanda 等报道，在转基因猪乳汁中，人凝血因子的含量约为2.7ug/mL，比人血浆中的含量高10倍。

2000年，我国郑新民等用显微注射法，生产出第一批能合成人血清白蛋白(HSA)的转基因猪。

2001年，加拿大的科学家培育出的携带大肠杆菌phytase 基因的转基因猪，这种
猪可在唾液中分泌phytase，从而提高对饲料中磷的消化率，使猪粪中的磷含量比正常猪降低了75%。

2004年，韩国的科学家将治疗脑血栓的遗传基因（TPA）注入猪的受精卵中，成功培育出4头通过乳汁和尿生产能排除脑血栓治疗物质的生化猪。

我国在转基因动物乳腺反应器研究方面的研究较落后，但也开始了hPC 转基因猪生物反应器技术的研究。

2.4 提高生产性能
生长激素(GH)基因是转基因研究运用最早的基因，至今已生产出转GH 基因家禽、鱼类、猪等。

国际上生产的转基因猪中GH 产物已得到表达，使血浆中GH 水平持续性的提高。

转基因猪的增长速度较快，饲料利用率可提高17%，胴体瘦肉率大幅度提高，胴体脂肪为对照组的50%。

我国陈永福、魏庆信等也取得了类似的结果，用自己构建的融合基因DMT/PGH 获得了转基因猪，其生长速度提高了11.8%～14.2%，饲料利用率提高了10%，但这些转基因猪在获得生产性状提高的同时，也留下了一些后遗症，如关节病、肾病及生殖能力丧失等。

2.5 作为人类疾病研究模型
利用转基因动物可建立人类疾病模型，以研究探讨人类遗传性疾病的机理及治疗方法。

迄今，建立了转基因小鼠模型的遗传性疾病有：动物腺粥样硬化病、镰刀型细胞贫血症、老年痴呆症、自身免疫病、淋巴系统病、皮炎等。

猪已被广泛用于生物医学研究，包括皮肤、消化器官和心血管系
统，今后可能成为研究和治疗人类疾病的理想材料。

2008年G.A.Wyszyrnska-Pawelec 等人成功进行了转基因猪做为人骨髓贡献者的研究。

同样，2008年C. Costa 等人进行了转基因猪的软骨作为今后临床应用的材料的研究。

3 转基因猪研究的不足与展望
转基因猪的研究，在短短的几十年里取得了很大成就，目前，仍处于发展阶段，需要尽快解决的问题有：外源基因导入和检测的方法还需要改进和完善；要改变目前转化率低、整合率低的缺点；要解决如何控制目的基因在体内的定点表达问题；要改变目前这种获得的转基因数量少且常有畸形的状况；要控制外源基因在转基因猪表达时所出现的时间或空间的问题，即有异位表达和个体发育不适宜阶段表达的问题。

存在这些问题的关键是，我们目前对猪的基因图谱的
认识还远远不够，在研究中难免有盲目性，而且，我们常常只注意对局部的某个基因和器官的研究，而没有看到整体的功能。

随着时间的推移和科学技术的发展，我们必定会解决这一系列的问题，转基因猪的研究将会取得更卓越的成绩，必
将为人类带来更大的利益。

（参考文献22篇略）（收稿日期：2009-06-30）。