雷帕霉素对肺癌细胞mTOR信号通路相关蛋白表达的作用

ＤＯＩ：１０．３９７１／ｊ
．ｉｓｓｎ．１０００－８５７８．２０１１．１０．００３收稿日期：２０１０－０９－２８；修回日期：２０１１－０３－
２２基金项目：广州市教育局科技基金资助项目（穗教科［２００６］６１０３５）；广东省医学科研基金资助项目（Ａ２０１０２４８
）作者单位：１．５１０２６０广州，广州医学院第二附属医院肿瘤科；２．
中山大学肿瘤防治中心作者简介：曾波航（１９６３－）
，男，博士，教授，主要从事肿瘤靶向治疗研究
雷帕霉素对肺癌细胞ｍＴＯＲ信号通路相关蛋白表达的作用
曾波航１，庄　莹１，陈静琦１，江素华１，曾木圣２
Ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　Ｒａｐａｍｙｃｉｎ　ｏｎ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ｍＴＯＲ　Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ　Ｐａｔｈｗａｙ　Ｒｅｌａｔｉｖｅ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　ｉｎ　ＬｕｎｇＣａｎｃｅｒ　
ＣｅｌｌＺＥＮＧ　Ｂｏ－ｈａｎｇ１
，ＺＨＵＡＮＧ　Ｙｉｎｇ１
，ＣＨＥＮ　Ｊｉｎｇ－ｑｉ　１
，ＪＩＡＮＧ　Ｓｕ－ｈｕａ１
，ＺＥＮＧ　Ｍｕ－ｓｈｅｎｇ２
１．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，Ｓｅｃｏｎｄ　Ａｆｆｉｌｉａｔｅｄ　Ｈｏｓｐｉｔａｌ，Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｇｕａｎｇ
ｚｈｏｕ５１０２６０，Ｃｈｉｎａ；２．Ｓｕｎ　Ｔａｔ－ｓｅｎ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　
Ｔｕｍｏｒ　ＣｅｎｃｅｒＡｂｓｔｒａｃｔ：Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ　Ｔｏ　ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ　ｔｈｅ　ｒｅｌａｔｉｏｎ　ｂｅｔｗｅｅｎ　ｔｈｅ　ｆｕｎｃｔｉｏｎ　ｓｔａｔｅ　ｏｆ　ｍＴＯＲ　ｓｉｇｎａｌ　ｐａｔｈｗａｙ　ａｎｄｒａｐａｍｙｃｉｎ　ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ　ｔｏ　ｌｕｎｇ　ｃａｎｃｅｒ．Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｍＴＯＲ　ｓｉｇｎａｌｉｎｇ　ｐａｔｈｗａｙ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｉｎ　４　ｌｕｎｇ　ｃａｎｃｅｒ　ｃｅｌｌｌｉｎｅｓ（ＨＬＡＭＰ，Ｈ１２９９，Ａ５４９　ａｎｄ　ＰＡａ）ｗｅｒｅ　ｄｅｔｅｃｔｅｄ　ｂｙ　Ｗｅｓｔｅｒｎ　Ｂｌｏｔ．ＭＴＴ　ｍｅｔｈｏｄ　ｗａｓ　ｕｓｅｄ　ｔｏ　ｄｅｔｅｒ－ｍｉｎｅ　ｔｈｅ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ　ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ｒａｐａｍｙｃｉｎ　ｏｎ　ｈｕｍａｎ　ｌｕｎｇ　ｃａｎｃｅｒ　ｃｅｌｌ．Ｌｕｎｇ　ｃａｎｃｅｒ　ｃｅｌｌ　ｌｉｎｅｓ　ｗｅｒｅ　ｄｉｖｉｄｅｄ　ｉｎｔｏｒａｐａｍｙｃｉｎ　ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ　ｇｒｏｕｐ　ａｎｄ　ｎｏｎ－ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ　ｇｒｏｕｐ．Ｅｎ　Ｖｉｓｉｏｎ　ｍｅｔｈｏｄ　ｗａｓ　ｕｓｅｄ　ｔｏ　ｄｅｔｅｃｔｅ　ｔｈｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆ　ｒａｐａｍｙｃｉｎ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｉｎ　１００　ｌｕｎｇ　ｃａｎｃｅｒ　ａｎｄ　２０　ｌｕｎｇ　ｎｏｎｍａｌｉｇｎａｎｔ　ｄｉｓｅａｓｅ　ｎｏｒｍａｌ　ｌｕｎｇ　ｔｉｓ－ｓｕｅｓ．Ｒｅｓｕｌｔ　ＡＫＴ，Ｓ６Ｋ１，４Ｅ－ＢＰ１，ｅＩＦ４Ｅ　ｗｅｒｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ　ｉｎ　ａｌｌ　ｈｕｍａｎ　ｌｕｎｇ　ｃａｎｃｅｒ　ｃｅｌｌ　ｌｉｎｅｓ．Ｐ－Ｓ６Ｋ１　ｗａｓｈｉｇｈ－ｌｅｖｅｌ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｉｎ　ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ　ｃｅｌｌ　ｌｉｎｅｓ，ｎｏ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｉｎ　ｎｏｎ－ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ　ｃｅｌｌ　ｌｉｎｅ，ａｎｄ　ｉｔ　ｗａｓ　ａｒａｐａｍｙｃｉｎｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ　ｐｒｏｔｅｉｎ．Ｐ－Ｓ６Ｋ１　ｐｏｓｉｔｉｖｅ－ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｒａｔｅ　ｗａｓ　１５％（３／２０）ｉｎ　ｎｏｒｍａｌ　ｌｕｎｇ　ｔｉｓｓｕｅｓ，ａｎｄ　６２％（６２／１００）ｉｎ　ｌｕｎｇ　ｃａｎｃｅｒ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｐ－Ｓ６Ｋ１　ｐｏｓｉｔｉｖｅ－ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｒａｔｅ　ｉｎ　ｓｍａｌｌ　ｃｅｌｌ　ｌｕｎｇ　ｃａｎｃｅｒ（８１％，１７／２１）ｗａｓ　ｈｉｇｈｅｒ　ｔｈａｎ　ｔｈａｔ　ｉｎ　ｎｏｎ－ｓｍａｌｌ　ｃｅｌｌ　ｌｕｎｇ　ｃａｎｃｅｒ（５９％，４５／７９）．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ　Ｔｈｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　Ｐ－Ｓ６Ｋ１ｉｎ　ｈｕｍａｎ　ｌｕｎｇ　ｃａｎｃｅｒ　ｃｅｌｌ　ｌｉｎｅｓ　ｍａｙ　ｒｅｆｌｅｃｔ　ｒａｐａｍｙｃｉｎ　ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ　ｔｏ　ｃａｎｃｅｒ　ｃｅｌｌ　ｔｏ　ａ　ｅｘｔｅｎｔ．Ｂｕｔ　ｏｔｈｅｒｍＴＯＲ　ｓｉｇｎａｌｉｎｇ　ｐａｔｈｗａｙ　ｐｒｏｔｅｉｎ（ＡＫＴ，Ｓ６Ｋ１，ｅＩＦ４Ｅ，４Ｅ－ＢＰ１）ｃａｎ　ｎｏｔ　ｒｅｆｌｅｃｔ　ｒａｐａｍｙｃｉｎ　ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ　ｔｏｌｕｎｇ　ｃａｎｃｅｒ　ｃｅｌｌ．Ｐ－Ｓ６Ｋ１　ｉｓａｒａｐａｍｙｃｉｎ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ　ｐｒｏｔｅｉｎ．Ｔｈｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　Ｐ－Ｓ６Ｋ１　ｉｎ　ｓｍａｌｌ　ｃｅｌｌ　ｌｕｎｇｃａｎｃｅｒ　ｉｓ　ｍｕｃｈ　ｈｉｇｈｅｒ　ｔｈａｎ　ｔｈａｔ　ｉｎ　ｎｏｎ－ｓａｍｌｌ　ｃｅｌｌ　ｌｕｎｇ　ｃａｎｃｅｒ．Ｔｈｅ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｓｕｇｇｅｓｔ　ｔｈｅ　ｂｅｔｔｅｒ　ｃｌｉｎｉｃａｌ　ｅｆｆｅｃｔｏｆ　ｍＴＯＲ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ－ｒａｐａｍｙｃｉｎ　ｉｎ　ｓｍａｌｌ　ｃｅｌｌ　ｌｕｎｇ　ｃａｎｃｅｒ．Ｋｅｙ　
ｗｏｒｄｓ：Ｌｕｎｇ　Ｃａｎｃｅｒ；Ｒａｐａｍｙｃｉｎ；ｍＴＯＲ摘　要：目的　探讨ｍＴＯＲ信号通路的功能状态与肺癌对雷帕霉素敏感度的关系。

方法　Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ检测ｍＴＯＲ信号通路中ＡＫＴ、Ｓ６Ｋ１、ｅＩＦ４Ｅ、４Ｅ－ＢＰ１、Ｐ－Ｓ６Ｋ１蛋白在４种人肺癌细胞株的表达；ＭＴＴ法检测雷帕霉素对肺癌细胞增殖的抑制情况，将肺癌细胞分为雷帕霉素敏感组和不敏感组，找出与敏感度相关的差异蛋白，用Ｅｎ　Ｖｉｓｉｏｎ法检测患者肺癌组织中差异蛋白的表达。

结果　ＡＫＴ、Ｓ６Ｋ１、ｅＩＦ４Ｅ、４Ｅ－ＢＰ１蛋白在４种肺癌细胞株中均有表达。

而Ｐ－Ｓ６Ｋ１在不敏感株中未检测到，在敏感株中呈高表达，为雷帕霉素差异蛋白。

Ｐ－Ｓ６Ｋ１在正常肺组织中的阳性表达率为１５％（３／２０例），在肺癌组织中的阳性表达率为６２％（６２／１００例），其中在小细胞肺癌组织中的阳性表达率（８１．０％，１７／２１例）高于非小细胞肺癌组织（５９％，４５／７９例）。

结论　在ｍＴＯＲ信号通路相关蛋白中，仅Ｐ－Ｓ６Ｋ１在一定程度上可预测肺癌细胞株对雷帕霉素的敏感度，为一种ｍＴＯＲ靶向抑制剂———雷帕霉素治疗肺癌的差异蛋白。

Ｐ－Ｓ６Ｋ１在小细胞肺癌中表达较非小细胞肺癌高，提示在Ｐ－Ｓ６Ｋ１表达率高的小细胞未分化肺癌中应用ｍＴＯＲ靶向抑制剂———雷帕霉素的疗效可能更佳。

关键词：肺癌；雷帕霉素；ｍＴＯＲ
中图分类号：Ｒ７３４．２ 文献标识码：Ａ 文章编号：１０００－８５７８（２０１１）１０－１１０５－０４０　引言
哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（ｍａｍｍａｌｉａｎ　ｔａｒｇ
ｅｔｏｆ　ｒａｐａｍｙｃｉｎ，ｍＴＯＲ）可以整合氨基酸、能量、生长因子所激发的信号通路，参与基因转录、蛋白质翻译、核糖体生物合成和细胞凋亡等多项细胞功
·
５０１１·肿瘤防治研究２０１１年第３８卷第１０期
能。

现已发现，许多肿瘤伴有ｍＴＯＲ信号通路调节异常［１－４］。

生长因子通过跨膜信号转导激活ＰＩ３Ｋ，产生ＰｔｄＩｎ（１－４）Ｐ２，ＰｔｄＩｎ（３，４，５）Ｐ３，它们以ＰＨ域与ＰＤＫ和ＡＫＴ结合并激活ＰＤＫ－１，活化的ＰＤＫ－１磷酸化ＡＫＴ并使之活化，ＡＫＴ再直接磷酸化ｍＴＯＲ，活化的ｍＴＯＲ作用于下游的底物。

激活的ｍＴＯＲ至少可调节两种不同的下游底物：Ｓ６Ｋ１和４Ｅ－ＢＰ１，它们是蛋白翻译的关键调节因子。

雷帕霉素（Ｒａｐａｍｙｃｉｎ）能特异性靶向抑制ｍＴＯＲ，阻止Ｓ６Ｋ１和４Ｅ－ＢＰ１磷酸化。

美国国立癌症研究所分析雷帕霉素对６０种肿瘤细胞株的杀伤作用后，发现雷帕霉素能抑制部分肿瘤株细胞，其中对乳腺癌、卵巢癌、白血病、肺癌、肾癌等肿瘤细胞株的生长抑制明显［５－６］。

有关肺癌细胞株对雷帕霉素的敏感度、ｍＴＯＲ信号转导通路蛋白与肺癌细胞对雷帕霉素敏感度之间的关系研究甚少［７］，雷帕霉素差异蛋白在人肺癌组织中的表达则未见报道。

研究雷帕霉素差异蛋白的表达与ｍＴＯＲ抑制剂－雷帕霉素对肺癌细胞敏感度关系，将为ｍＴＯＲ抑制剂的临床应用奠定基础。

１　材料和方法
１．１　材料
１．１．１　试剂　ＲＰＭＩ－１６４０细胞培养液、胎牛血清购自美国Ｇｉｂｃｏ公司。

雷帕霉素、ＭＴＴ购自美国Ｓｉｇｍａ公司。

抗Ｓ６Ｋ１抗体、抗Ｐ－Ｓ６Ｋ１抗体（Ｔｈｒ３８９）、抗ＡＫＴ抗体、抗ｅＩＦ４Ｅ抗体、抗４Ｅ－ＢＰ１抗体、ＥＣＬ化学发光试剂盒、鼠抗人Ｐ－Ｓ６Ｋ１单抗隆抗体（Ｔｈｒ３８９）购自美国Ｃｅｌｌ　Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ公司。

抗ＴＵＢＬＩＮ抗体、ＰＶＤＦ膜购自美国Ｒｏｃｈｅ公司。

辣根过氧化酶标记羊抗兔ＩｇＧ、辣根过氧化酶标记羊抗鼠ＩｇＧ购自美国Ｓａｎｔａ　Ｃｒｕｚｅ　Ｂｉｏｔｅｃｈ－ｎｏｌｏｇｙ公司。

二步法免疫组织化学试剂、ＤＡＢ显色液购自美国ＤＡＫＯ公司。

１．１．２　细胞　Ａ５４９、Ｈ１２９９、ＰＡａ和ＨＬＡＭＰ等４种人肺癌细胞株由广州医学院实验医学中心惠赠。

１．１．３　组织　肺癌组织１００例，其中非小细胞肺癌７９例（含腺癌３８例、鳞癌４１例），小细胞肺癌２１例。

２０例肺良性病变患者正常肺组织作为对照。

１．２　实验方法
１．２．１　Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ检测ｍＴＯＲ信号通路相关蛋白的表达　将生长状态良好的ＨＬＡＭＰ、Ｈ１２９９、Ａ５４９和ＰＡａ细胞，按每５×１０７个细胞加入４００μｌ蛋白样品裂解缓冲液裂解细胞。

收集细胞蛋白，蛋白质浓度经分光光度计定量。

细胞蛋白经β－巯基乙醇９８℃、１０　ｍｉｎ变性。

取２０μｇ蛋白经１０．５％ＳＤＳＰＡＧＥ电泳后，１２０　Ｖ３　ｈ电转移至ＰＶＤＦ膜上，再以５％脱脂奶（溶于ＴＢＳＴ中）封闭过夜。

分别用抗ＡＫＴ一抗、抗ｅＩＦ４Ｅ一抗、抗４Ｅ－ＢＰ１一抗、抗Ｓ６Ｋ１一抗、抗Ｐ－Ｓ６Ｋ１一抗和抗ＴＵＢＬＩＮ一抗４℃孵育过夜。

相应二抗室温孵育１　ｈ，ＴＢＳＴ洗膜１０　ｍｉｎ×３次。

配置新鲜发光液，将膜孵育３　ｍｉｎ，暗室Ｘ线片曝光０．５～５　ｍｉｎ，显影３０　ｓ，定影３０　ｓ成像。

１．２．２　ＭＴＴ法测定雷帕霉素对肺癌细胞的抑制作用根据实验结果将肺癌细胞分为雷帕霉素敏感组和不敏感组。

１．２．３　筛选出差异蛋白并探讨其与肺癌细胞对雷帕霉素敏感度的关系　Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ检测人肺癌细胞株ｍＴＯＲ信号通路相关蛋白（ＡＫＴ、ｅＩＦ４Ｅ、４Ｅ－ＢＰ１、Ｓ６Ｋ１、Ｐ－Ｓ６Ｋ１等）的表达，筛选出雷帕霉素差异蛋白。

用Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ检测雷帕霉素差异蛋白在用药前后的变化并探讨其与肺癌细胞对雷帕霉素敏感度的关系。

１．２．４　收集临床肺癌患者的组织标本及完整的临床病历资料，免疫组织化学Ｅｎ　Ｖｉｓｉｏｎ法检测肺癌组织和肺部良性疾病正常肺组织差异蛋白的表达，分析差异蛋白的表达与肺癌临床病理特征间的关系及其意义。

１．３　结果判定方法
所有切片均由两位病理科医生在双盲的情况下观察。

阳性评判标准：（１）根据细胞质阳性细胞数的多少计分：＜５％的细胞质阳性记为１分；＞５％～３５％的细胞质阳性记为２分；＞３５％～７０％的细胞质阳性记为３分；＞７０％的细胞质阳性记为４分。

（２）根据阳性染色的强度进行计分：未染色为１分为阴性；弱染色为２分；中度染色为３分；重度染色为４分。

统计分析时采用两种计分法的乘积，若乘积≥４分，便认为Ｐ－Ｓ６Ｋ１表达阳性，否则为阴性。

１．４　统计学方法
采用ＳＰＳＳ１６．０软件，用卡方检验的方法对雷帕霉素对肺癌细胞增殖的抑制率和肺癌组织中ｐ－Ｓ６Ｋ１表达的阳性率进行统计学分析。

２　结果
２．１　Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ检测ｍＴＯＲ信号通路相关蛋白的表达
结果显示ｍＴＯＲ的上游蛋白ＡＫＴ及下游蛋白４Ｅ－ＢＰ１、ｅＩＦ４Ｅ、Ｓ６Ｋ１和内参蛋白ＴＵＢ在所有细胞株中均有表达，Ｓ６Ｋ１的活性状态Ｐ－Ｓ６Ｋ１只在ＨＬＡＭＰ、Ａ５４９和ＰＡａ细胞株中表达，在Ｈ１２９９细胞株中未检测到，见图１。

·
６
０
１
１
·肿瘤防治研究２０１１年第３８卷第１０期
图１　４种肺癌细胞株ｍＴＯＲ信号通路相关蛋白的表达
Ｆｉｇｕｒｅ　１　Ｔｈｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｏｆ　ｍＴＯＲ　ｓｉｇｎａｌｉｎｇ
ｐａｔｈｗａｙ　ｉｎ　４　ｌｕｎｇ　ｃａｎｃｅｒ　ｃｅｌｌ　ｌｉｎｅｓ
２．２　雷帕霉素对肺癌细胞增殖的抑制作用
不同浓度（０．１、１、１０、１００　ｎｍｏｌ／Ｌ）的雷帕霉素处理人肺癌细胞株７２　ｈ后，抑制率相邻两组间比较差异有统计学意义（Ｐ＜０．０５）为敏感组（ＨＬＡＭＰ、Ａ５４９和ＰＡａ细胞株），且随浓度增加而相应增加，抑制率相邻两组间比较差异无统计学意义（Ｐ＞０．０５）为不敏感组（Ｈ１２９９）。

１００　ｎｍｏｌ／Ｌ时的抑制率达到最大（Ｐ＜０．０５），敏感组大于３０％，不敏感组小于３０％。

结果表明肺癌细胞株ＨＬＡＭＰ、Ａ５４９和ＰＡａ对雷帕霉素敏感，而肺癌细胞株Ｈ１２９９对雷帕霉素不敏感，见图２。

图２　不同浓度雷帕霉素对肺癌细胞增殖的作用
Ｆｉｇｕｒｅ　２　Ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　Ｒａｐａｍｙｃｉｎ　ｏｎ　ｌｕｎｇ　ｃａｎｃｅｒ
ｃｅｌｌ　ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ
２．３　雷帕霉素差异蛋白
ｍＴＯＲ信号通路相关蛋白的ＡＫＴ、Ｓ６Ｋ１、４Ｅ－ＢＰ１、ｅＩＦ４Ｅ蛋白在所有人肺癌细胞株中均有表达，见图１，而Ｐ－Ｓ６Ｋ１在雷帕霉素敏感株（ＨＬＡＭＰ、Ａ５４９和ＰＡａ）中呈高表达，在雷帕霉素不敏感株（Ｈ１２９９）中未检测到，故把Ｐ－Ｓ６Ｋ１作为雷帕霉素差异蛋白。

２．４　Ｐ－Ｓ６Ｋ１在肺癌组织中表达结果
Ｐ－Ｓ６Ｋ１表达阳性细胞表现为棕黄色至深黄色颗粒，主要分布在肿瘤细胞胞核中，少部分标本中肿瘤细胞的胞核和胞质都可见阳性信号，见图３。

Ｐ－Ｓ６Ｋ１在正常肺组织的阳性表达率为１５％（３／２０例），在肺癌组织的阳性表达率为６２％（６２／１００例），其中在小细胞肺癌的阳性表达率（８１％，１７／２１例）高于非小细胞肺癌（５９％，４５／７９例）。

Ｐ－Ｓ６Ｋ１在肺癌组织中的表达较正常肺组织的表达高，差异有统计学意义（χ２值＝１４．８３，Ｐ＜０．０５）。

Ｐ－Ｓ６Ｋ１表达阳性率在非小细胞癌与小细胞癌之间的差异有统计学意义（Ｐ＜０．０５）；其中在非小细胞癌中，Ｐ－Ｓ６Ｋ１阳性表达率在腺癌与鳞癌之间的差异无统计学意义（Ｐ＞０．０５），见表１。

表１　Ｐ－Ｓ６Ｋ１蛋白在肺癌组织的表达
Ｔａｂｌｅ　１　Ｐ－Ｓ６Ｋ１　ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ　ｉｎ　ｈｕｍａｎ　ｌｕｎｇ　ｃａｎｃｅｒ　ｔｉｓｓｕｅｓＤｉｓｅａｓｅｓ　Ｔｏｔａｌ　Ｐｏｓｉｔｉｖｅ
Ｐｏｓｉｔｉｖｅ
ｒａｔｅ（％）Ｌｕｎｇ　ｃａｎｃｅｒ　１００　６２　６２
ＳＣＬＣ　２１　１７　８１
ＮＳＣＬＣ　７９　４５　５７
Ｌｕｎｇ　ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ　３８　２５　６５．８
Ｌｕｎｇ　ｓｑｕａｍｏｕｓ　ｃａｒｃｉｎｏｍａ　４１　２０　４８．８
Ｎｏｒｍｕｌ　ｌｕｎｇ　ｔｉｓｓｕｅ　２０　３　１
５
３ａ：ＳＣＬＣ；３ｂ：Ｌｕｎｇ　ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ
图３　Ｐ－Ｓ６Ｋ１在小细胞肺癌和腺病细胞中的阳性表达
（Ｅｎ　Ｖｉｓｉｏｎ　×２００）
Ｆｉｇｕｒｅ　３　Ｔｈｅ　ｐｏｓｉｔｉｏｎ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　Ｐ－Ｓ６Ｋ１ｉｎ　ＳＣＬＣ　ａｎｄＬｕｎｇ　ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ（Ｅｎ　Ｖｉｓｉｏｎ　×２００）
３　讨论
雷帕霉素是一种大环内酯类抗菌素，能特异性靶向抑制ｍＴＯＲ，阻止Ｓ６Ｋ１和４Ｅ－ＢＰ１磷酸化，具
有靶向抗肿瘤细胞作用，可阻止肿瘤细胞在Ｇ
１
期，诱导细胞凋亡，抑制肿瘤血管形成，抑制肿瘤侵袭和转移。

雷帕霉素仅能抑制部分肿瘤细胞株，同一肿瘤不同的细胞株之间对雷帕霉素的敏感度也存在差异［１－６］。

Ｎｏｈ等［８］用１５种乳腺癌细胞株细胞证实１２株细胞对雷帕霉素敏感，研究者还发现雷帕霉素体外对肿瘤细胞株作用存在较大差异，本实验中发现了有对雷帕霉素敏感的肺癌细胞株（ＨＬＡＭＰ、Ａ５４９和ＰＡａ），也有对雷帕霉素耐药的肺癌细胞株（Ｈ１２９９）。

Ｈｉｒｏａｋｉ等［９］在人大肠癌实验研究中发现雷帕霉素抑制大肠癌细胞增殖的同时下调雷帕霉素敏感株Ｐ－Ｓ６Ｋ１的表达，发现４０％的大肠腺瘤和腺癌有
·
７
０
１
１
·
肿瘤防治研究２０１１年第３８卷第１０期
Ｐ－Ｓ６Ｋ１的表达，表明了４０％的大肠腺瘤和腺癌可能会对雷帕霉素治疗敏感。

Ｎｏｈ等［８］发现肿瘤细胞Ｓ６Ｋ１过度表达和ＡＫＴ磷酸化表达与乳腺癌细胞株对雷帕霉素敏感度有关。

本实验通过使用Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ法检测ｍＴＯＲ相关上下游蛋白的表达情况，发现位于ｍＴＯＲ上游的ＡＫＴ蛋白及下游的Ｓ６Ｋ１、４Ｅ－ＢＰ１、ｅＩＦ４Ｅ蛋白在所有的肺癌细胞株中均有不同程度的表达，但Ｓ６Ｋ１的磷酸化形式Ｐ－Ｓ６Ｋ１仅在对雷帕霉素敏感的ＨＬＡＭＰ、Ａ５４９、ＰＡａ细胞高表达，而在Ｈ１２９９细胞中缺失。

表明肺癌细胞株ＨＬＡＭＰ、Ａ５４９、ＰＡａ细胞中ｍＴＯＲ信号通路处于活化状态，而肺癌细胞株Ｈ１２９９细胞的ｍＴＯＲ并非处于活化状态，所以细胞的增殖不受ｍＴＯＲ的影响。

换而言之，代表ｍＴＯＲ信号通路处于活化状态的Ｐ－Ｓ６Ｋ１与肺癌细胞株对雷帕霉素敏感度存在相关性。

为了进一步探讨Ｐ－Ｓ６Ｋ１与雷帕霉素敏感度的关系，本实验还测定了经雷帕霉素处理后敏感株的Ｐ－Ｓ６Ｋ１表达情况。

结果显示，经雷帕霉素处理后，敏感株ＨＬＡＭＰ、Ａ５４９细胞中Ｐ－Ｓ６Ｋ１蛋白表达较用药前明显降低。

表明雷帕霉素能同时下调Ｐ－Ｓ６Ｋ１的蛋白表达，提示Ｐ－Ｓ６Ｋ１在一定程度上可以代表雷帕霉素敏感度。

与Ｈｉｒｏａｋｉ等［９］研究结果相仪，表明Ｐ－Ｓ６Ｋ１可以作为ｍＴＯＲ抑制剂———雷帕霉素抑制肿瘤生长的标志物。

同时说明了在肿瘤细胞中，雷帕霉素阻断ｍＴＯＲ是通过抑制Ｓ６Ｋ１效应而抑制细胞增殖，或许在部分肿瘤中，ｍＴＯＲ信号通路是活化的，但并非细胞周期中所必须的，即或许存在对雷帕霉素不敏感的其他通路。

本部分实验研究结果分析显示肺癌组患者Ｐ－Ｓ６Ｋ１的表达阳性率为６２％，肺良性病变患者Ｐ－Ｓ６Ｋ１表达均为阴性，两组间比较差异有统计学意义（Ｐ＜０．０５）。

一般认为，ｍＴＯＲ在正常组织细胞中呈低度表达，而在大多恶性肿瘤中呈异常高表达，异常高表达的ｍＴＯＲ在肿瘤的发生、发展中起重要作用，且与肿瘤的临床病理特征具有一定的相关性［３］。

Ｓ６Ｋ１作为ｍＴＯＲ重要的下游物质，Ｐ－Ｓ６Ｋ１是其活化形式，Ｐ－Ｓ６Ｋ１的存在表明ｍＴＯＲ信号通路处于异常活化状态。

因此，Ｐ－Ｓ６Ｋ１在肺癌患者中的高表达可以代表ｍＴＯＲ的活性，通过Ｐ－Ｓ６Ｋ１的检测，在肺癌与肺良性病变的鉴别中具有较高的特异性。

我们的研究还发现Ｐ－Ｓ６Ｋ１在肺癌中高表达，在正常肺组织中低表达。

Ｐ－Ｓ６Ｋ１在小细胞肺癌的表达较非小细胞肺癌高，这可能与小细胞肺癌分化程度极低有一定的关系，具体机制尚不清。

Ｐ－Ｓ６Ｋ１在小细胞肺癌的高表达提示在临床治疗中，小细胞肺癌患者使用ｍＴＯＲ抑制剂治疗可能获得更佳疗效。

目前雷帕霉素没有在临床上用于肺癌的治疗，但一系列的研究结果提示，随着对ｍＴＯＲ通路研究不断深入，雷帕霉素及同类药物有可能成为肺癌靶向治疗的新策略。

综上所述，雷帕霉素能抑制肺癌细胞的增殖，同时下调Ｐ－Ｓ６Ｋ１的表达。

Ｐ－Ｓ６Ｋ１在一定程度上代表肿瘤细胞对雷帕霉素敏感度。

检测Ｐ－Ｓ６Ｋ１不仅在肺癌与肺良性疾病的鉴别中有重要的意义，还可能有助于选择患者接受ｍＴＯＲ抑制剂治疗。

参考文献：
［１］　Ｂｊｏｍｓｔｉ　ＭＡ，Ｈｏｕｇｈｔｏｎ　ＰＪ．Ｔｈｅ　ＴＯＲ　ｐａｔｈｗａｙ：ａ　ｔａｒｇｅｔ　ｆｏｒｃａｎｃｅｒ　ｔｈｅｒａｐｙ［Ｊ］．Ｎａｔ　Ｒｅｖ　Ｃａｎｃｅｒ，２００４，４（５）：３３５－３４８．［２］　Ａｓａｎｏ　Ｔ，Ｙａｏ　Ｙ，Ｚｈｕ　Ｊ，ｅｔ　ａｌ．Ｔｈｅ　Ｒａｐａｍｙｃｉｎ　ａｎａｌｏｇ　ＣＣＩ－７７９ｉｓ　ａ　ｐｏｔｅｎｔ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ　ｏｆ　ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ　ｃａｎｃｅｒ　ｃｅｌｌ　ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｂｉｏｃｈｅｍ　Ｂｉｏｐｈｙｓ　Ｒｅｓ　Ｃｏｍｍｕｎ，２００５，３３１（１）：２９５－３０２．
［３］　Ｐｅｔｒｏｕｌａｋｉｓ　Ｅ，Ｍａｍａｎｅ　Ｙ，Ｌｅ　Ｂａｃｑｕｅｒ　Ｏ，ｅｔ　ａｌ．ｍＴＯＲ　ｓｉｇｎａ－ｌｉｎｇ：ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ　ｆｏｒ　ｃａｎｃｅｒ　ａｎｄ　ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ　ｔｈｅｒａｐｙ［Ｊ］．Ｂｒ　ＪＣａｎｃｅｒ，２００６，９４（２）：１９５－１９９．
［４］　Ｗａｎｇ　Ｘ，Ｐｒｏｕｄ　ＣＧ．Ｔｈｅ　ｍＴＯＲ　Ｐａｔｈｗａｙ　ｉｎ　ｔｈｅ　Ｃｏｎｔｒｏｌ　ｏｆＰｒｏｔｅｉｎ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ［Ｊ］．Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ），２００６，２１（４）：３６２
－３６９．
［５］　Ｓａｒｂａｓｓｏｖ　ＤＤ，Ｇｕｅｒｔｉｎ　ＤＡ，Ａｌｉ　ＳＭ，ｅｔ　ａｌ．Ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎａｎｄ　ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　ＡＫＴ／ＰＫＢ　ｂｙ　ｔｈｅ　ｒｉｃｔｏｒ／ｍＴＯＲ　ｃｏｍｐｌｅｘ［Ｊ］．Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００５，３０７（５７１２）：１０９８－１１０１．
［６］　Ｖｉｇｎｏｔ　Ｓ，Ｆａｉｖｒｅ　Ｓ，Ａｇｕｉｒｒｅ　Ｄ，ｅｔ　ａｌ．ｍＴＯＲ－ｔａｒｇｅｔｅｄ　ｔｈｅｒａｐｙｏｆ　ｃａｎｃｅｒ　ｗｉｔｈ　ｒａｐａｍｙｃｉｎ　ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ［Ｊ］．Ａｎｎ　Ｏｎｃｏｌ，２００５，１６
（４）：５２５－５３７．
［７］　庄莹，曾波航，曾木圣．雷帕霉素对人肺癌细胞株增殖抑制的研究［Ｊ］．广州医学院学报，２００８，３６（３）：６－９
［８］　Ｎｏｈ　ＷＣ，Ｍｏｎｄｅｓｉｒｅ　ＷＨ，Ｐｅｎｇ　Ｊ，ｅｔ　ａｌ．Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔｓ　ｏｆ　ｒａｐａ－ｍｙｃｉｎ　ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ　ｉｎ　ｂｒｅａｓｔ　ｃａｎｃｅｒ　ｃｅｌｌｓ［Ｊ］．Ｃｌｉｎ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ，２００４，１０（３）：１０１３－１０２３．
［９］　Ｎｏｚａｗａ　Ｈ，Ｗａｔａｎａｂｅ　Ｔ，Ｎａｑａｗａ　Ｈ．Ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｒｉｂｏ－ｓｏｍａｌ　ｐ７０　Ｓ６　ｋｉｎａｓｅ　ａｎｄ　ｒａｐａｍｙｃｉｎ　ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ　ｉｎ　ｈｕｍａｎ　ｃｏｌｏｒ－
ｅｃｔａｌ　ｃａｎｃｅｒ［Ｊ］．Ｃａｎｃｅｒ　Ｌｅｔｔ，２００７，２５１（１）：１０５－１１３．
［编辑：安　凤；校对：刘红武］
·
８
０
１
１
·肿瘤防治研究２０１１年第３８卷第１０期。