结核病的实验室诊断技术及应用

DNA用于临床检验的不足
“死菌检测呈阳性”，与临床相关性差 不能区分“潜伏感染”“活动性感染” 易交叉污染
反应易受抑制
四、常见的RNA检测技术
NASBA（国外） TMA（国外）
SAT（国内）
TB—SAT 检测技术
SAT技术是将核酸恒温扩增和实时荧光 检测相结合的一种新型RNA检测技术。
一、细菌法
结核菌的培养
结核病病原学诊断的金标准 (培养时间长是其软肋)
一、细菌学检测的新方法 —提高阳性率
发光二极管荧光显微镜（LED） 液体培养（可同时缩短培养时间） 自动化涂片/染色技术（夹层杯法） 不能区分真假、死活；培养仍是金标准 但耗时长、
分枝杆菌固体培养与液体培养比较
液体培养 （BD MGIT960） 疑似新发患者报阳时间 （ d） 复诊患者报阳时间(d) 疑似新发患者阳性率 复诊患者阳性率 污染率 13.63±7.14 22.94±9.55 32.00% 9.30% 6.57% 固体培养 （罗氏L-J） 28.67±10.04 28.53±10.40 17.90% 2.60% 4.0%
操作复杂，时间长；对于原发感染初期或免疫低下人群， 可能存在假阴性。 能否疗效监测？——无大量数据
三、结核DNA检测技术
• • • • • 测序——金标准 荧光定量 PCR 环介导恒温扩增法（LAMP） 基因芯片检测鉴定技术 基因Xpert MTB/RIF检测技术
1. 荧光定量 PCR
• 是应用最为广泛的TB-DNA定量PCR检测 方法 • 具有灵敏度高（10CFU/ml）、特异性强、 线性关系好、操作简单等优点。
T-SPOT
20世纪60年代
GeneXpert
基因芯片
20世纪80年代
SAT
20世纪90年代
灵敏度低 检测周期长 成本低
血清学检测
交叉污染 仪器要求复杂 反应抑制
高灵敏度 高特异性 交叉污染少
WHO不推荐 r-干扰素释放实 验
一、细菌法 直接涂片 （阳性率低—5000以上细菌/ml； 不能区分真假、死活）
γ -干扰素释放实验（IGRAs)
Interferon-Gamma Release Assays
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结核杆菌特异抗原：ESAT-6与CFP10
ESAT-6 :
CFP10 :
早期抗原靶6（Early Secreted Antigenic Rarget 6）
培养滤液蛋白10（Culture Filtrate Protein 10）
ESAT6 + + + -
环境分枝杆菌
M abcessus M avium M branderi M celatum M chelonae M fortuitum M gordonii Mintracellulare
ESAT6 + + + + -
CFP-10 + + + + -
M kansasii
M malmoense M marinum M oenavense M crofulaceum M szulgai M terrae M vaccae M xenopi
结核特异抗原（ESAT-6/CFP 10）刺激 结核特异的效应T淋巴细胞使其分泌γ干扰素
效应T淋巴细胞分泌的γ-干扰素 与膜板预包被的抗γ-干扰素抗体 结合并固定在细胞周围
过夜孵育，洗板，加入酶标二抗
加入显色液，观察结果
1个斑点=1个效应T细胞
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实验效果图
空白对照
抗原A ESAT-6 抗原B CFP10
TB-SAT操作流程
超声波（300W） 痰液预处理 TB-RNA释放 15 min
50 µ l 稀释液 与反应液混合
42℃ 40 min
恒温扩增 实时检测
60℃10 min 42℃ 5 min
全程2小时，会做 PCR，就学的会SAT
TB-SAT检测技术优点
灵敏
检测下限1--10 条菌/ml
污染率低
LAMP法和其他PCR法的比较
LAMP法在结核菌检测中的应用
临床试验
—— LAMP法和对照试剂（BD快速培养）对比结果
灵敏度＝89.54% 特异性＝98.93% 总符合率＝95.31%

阳性结果预期值＝98.13% 阴性结果预期值＝93.77%
3. 基因芯片检测技术

通量：可同时检测 16-22种常见分枝杆菌 速度：6小时 灵敏度： 103 CFU/ml 可自动或肉眼判读结果
高孟秋 ，γ-干扰素释放试验检测结果的临床 意义解读，中华结核和呼吸杂志，2014
T-SPOT结果解读-阴性结果
除外结核感染 — 所用抗原为MTB特异性抗原 — 机体没有结核特异抗原致敏的T淋巴细胞 — 目前未感染结核分枝杆菌
假阴性： •感染阶段不同（窗口期） •少数免疫系统功能不全/基础疾病的情况，如HIV感染者、肿瘤患者、婴幼儿 等 •特殊肺外结核：结核性脑膜炎、粟粒性结核灵敏度相对较低 •实验非正常操作：细胞计数不够等 高孟秋 ，γ-干扰素释放试验检测结果的临床 意义解读，中华结核和呼吸杂志，2014
-干扰素检测）
WHO关于血清学检测声明
2011年7月20日，世界卫生组织（ WHO ）正式声明，要 求禁止将 血清学检测方法 （抗原，抗体，蛋白芯片等）用 于肺结核和肺外结核的诊断。
WHO warns against the use of inaccurate commercial serological tests for pulmonary and extra-pulmonary TB.
Novel Real-Time Simultaneous Amplification and Testing Method To Accurately and Rapidly Detect Mycobacterium tuberculosis Complex J.Clin.Microbiol.2012,50(3):646.DOL:10.1128/JCM.05853-11.
液体培养在提高阳性率、缩短报阳时间上均优于固体培养。 仍然不能满足临床快速诊断的需要
吴学兵，陆彬，桂晓虹等。液体MGIT培养法在结核分枝杆菌检测中的应用评估。检验医学，2013,3（28）：211-214
二、免疫学检测
血清学检测（抗体、抗原） 结核菌素试验（灵敏度、特异性？） 结核感染T细胞检测（γ
M smegmatis
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准确—T-SPOT临床诊断性能
阴性预测值：93.9%（478/509）
• 特异性
BCG）无交叉反应
阳性预测值：95.4%（624/654）
只针对结核分枝杆菌复合群敏感，与绝大多数环境分枝杆菌和卡介苗（
美国FDA数据：特异性97.1%(297/306) 国内临床数据：特异性94.1%(478/508)
2.环介导恒温扩增法（LAMP）
• 是在恒温下进行PCR扩增，因此操作更为简便，反 应更加快速。65℃扩增40min即可用肉眼观察结果。 扩增阳性标本呈现绿色荧光，反之为阴性。 • 是结核分枝杆菌DNA检测技术的代表-灵敏、快速、
特异、简捷将会极大地推动结核病的防治工作
DNA检测---LAMP
结果判读： 显色目测或 SYBR Green I 等荧光染料
一 个 斑 点 一 个 结 核 效 应 淋 巴 细 胞
=
阳性对照 （PHA）
阴性结果
阳性结果
T-SPOT结果的解读-阳性结果
• 活动性结核病 — 典型结核中毒症状 — 影像学支持 • 潜伏性结核感染 — 无结核中毒症状 — 无其它结核患病证据
— 排除其他诊断
• 陈旧性结核 • MTB感染状态 — 典型结核中毒症状 — 未发现结核患病证据 — 无结核中毒症状 — 既往TB史或明确TB证据 • NTM（四种）感染
结核病实验室诊断技术及应用
全球范围内结核病疫情急剧恶化

全球1/3人口（约20亿）已感染了结核菌， 人口的大规模流动
结核病与艾滋病同时流行 结核菌耐多药菌株的出现 患病率高， 新发患者93万/年，结核菌感染率为约40％ 死亡率高，每年死亡人数达13万 耐药率高 常规结核病实验室检测方法诊断阳性率不到60％。
MKA
MCH MMA MFO MTE MNO
堪萨斯分枝杆菌
龟分枝杆菌龟亚种 海/溃疡分枝杆菌 偶发/猪分枝杆菌 土分枝杆菌 不产色分枝杆菌
MSC
MAB MXE MGI MPH MGO
瘰疠分枝杆菌
龟分枝杆菌脓肿亚种 蟾蜍分枝杆菌 浅黄分枝杆菌 草分枝杆菌 戈登分枝杆菌
MUA
MSZ MDI MSI CC
潜伏感染：RNA不转录
不易污染：靶标和扩增产物都是RNA
TB-SAT检测区分MTB和NTM
结核分枝杆菌复合群 （MTB）： 人型结核分枝杆菌 牛型结核分枝杆菌 非洲型结核分枝杆菌
非结核分枝杆菌 （NTM）： 研究表明，TB-SAT可 以区分如下NTM：堪 萨斯分枝杆菌、胞内分 枝杆菌、龟分枝杆菌、 戈登分枝杆菌、海分枝 杆菌等18种
RNA易降 解，环境中存在时间短
42℃恒温扩 增,30分钟内扩增10亿倍
快速
特异
rRNA特异性非 常高
简便
无提取步骤， 扩增结束即得出结果。
RNA诊断技术的优势
灵敏度高：RNA ≥ DNA拷贝数 与临床相关性好：区分“死活菌”： 减少抗生素滥用
可以诊断“活动性感染”：
活动性感染：RNA转录活跃
结核
胞内
Journal of Clinical Microbiology. 2010, 48(10): 3654–3660.
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ห้องสมุดไป่ตู้
检测全程仅需6小时
同时鉴定MTC与21种NTM
MSM MIN 耻垢分枝杆菌 胞内分枝杆菌 MTC MAV 结核分枝杆菌复合群 鸟分枝杆菌 MTR MGA 次要分枝杆菌 胃分枝杆菌
T-SPOT的应用
优点：使用血液标本，取样简单；可用于肺内和肺外结核
检测；阴性预测值很高，可用于排除结核感染。 缺点： 阳性预测值约80%，不能用于结核的确诊 不能确定是否是肺结核（肺外）

不能区分是活动性和潜伏性结核
不能区分某些非结核分枝杆菌（堪萨斯、苏氏、戈登、海 分枝杆菌）
母牛分枝杆菌
苏尔加分枝杆菌 迪氏分枝杆菌 猿猴分枝杆菌 质控点
4.Xpert MTB/RIF检测技术
GeneXpert应用
•1、TB复合群鉴定。 •2、利福平耐药检测 。 •3、WHO推荐 •4、Xpert®MTB/RIF检测试剂的阳性检出率 低于人们对分子生物学诊断试剂高敏感度的 预期值，（1000CFU/ml）
• 灵敏度
基本不受免疫力低下/受抑制影响，在肺外结核患者中有很高的检出率
美国FDA数据：灵敏度95.6%(175/183) 国内临床数据：灵敏度95.3%(624/655)
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T-SPOT相关指南
•T-SPOT®.TB是采用γ -干扰素释放试验（IGRA）原理，获得 美国FDA认证、欧盟CE认证和首个中国CFDA认证的商业化
蛋白质组学的发展 3、4、7种结核杆菌优势表位抗原 （16KD、38KD、MPT64、ESAT-6、CFP10、Mtb8、Mtb8.4、 Mtb16.3）制备多靶点蛋白微阵列 大量的文献报道其敏感性 特异性均显著高于涂片与培养法 可用于结核病的临床辅助诊 断，提高痰涂片和痰培养假阴性的检测率
参考文献略
《摘自2014年中国结核病监测报告》
我国是世界上仅低于印度和印尼的第三结核病大国

早期快速诊断与治疗成为制约结核病防控的关键因素

结核病检测技术发展历程
分子诊断时代
DNA诊断：
细菌法： 直接镜检 体外培养
19世纪中叶
RNA诊断：
TMA NASBA
免疫学检测： Ab Ag PPD
PCR LAMP
•由结核杆菌基因组RD1区相同的操 纵子编码的蛋白 •所有的卡介苗（BCG）均丢失RD1 和RD2
•绝大多数的环境分枝杆菌(NTM)也 不存在RD1和RD2区
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结核杆菌特异抗原：ESAT-6与CFP10
抗原 抗原
CFP-10 + + + -
结核菌群
M tuberculosis M africanum M bovis BCG substrain gothenburg moreau tice tokyo danish glaxo montreal pasteur
产品
•列入欧美25个国家结核诊疗指南
2011年英国NICE指南、2010年美国最新结核诊疗指南、
2010年加拿大结核指南
•美国CDC推荐—卡介苗（BCG）接种人群结核感染检测首选
• 国内风湿科和消化科已列入专家共识
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快速—T-SPOT的实验步骤
用BD CPT 管或Ficoll提取液收集外周 血单个核细胞