结核病的实验室诊断技术及应用
结核病实验室检查及意义PPT课件
BCG接种者（如果也属于其 它风险人群）
推荐用IGRA
与传染性肺结核患者密切接 触
TST或IGRA
医务工作者
TST或IGRA
无法再来确认TST结果的人 群（例如，流浪汉，注射吸
毒者或交通不方便）
推荐用IGRA
TST，如果TST阴性要用 IGRA确认
没有特定的推荐
TST，用IGRA进一步确认 TST阳性 推荐用TST
非血 样本 的T-SPOT结果 很 强的话 （即 存 在大量 的结 核 效应 T 细 胞）,揭示在这个器官或部位存在活动性结核。
各国对潜伏感染风险人群的筛查指南
风险人群
美国指南Hale Waihona Puke 加拿大指南英国指南
免疫力抑制人群（例如， HIV感染者，使用强的松或
TNF-α抑制剂治疗）
TST或IGRA；如果是阴 性或高度怀疑的，TST和
与BCG的交叉反应
存在
存在的可能性较小
与NTM的交叉反应
存在
存在的可能性较小
与M.TB暴露的相关性
存在
相关性较PPD皮试大
阳性结果与随访期间罹患结核的相互关 系
可重复性
中到显著的正相关 中等，但可变
无充足的证据 较高，但证据较少
T-SPOT实验
阴性结果 提示患者体内不存在针对结核杆菌特异的效应T细胞。假阴性结 果： ①感染阶段不同；②少数免疫系统功能不全/疾病；③实验非正 常操作。
结核分枝杆菌-实验室检查
适用于多种标本；操作简便，价格低廉。 2份痰标本直接涂片抗酸杆菌镜检阳性。
结核杆菌培养
传统方法：L-J固体培养基 快速培养法: 检测细菌生长过程中代谢产生的CO2或消耗的O2， 显微镜直接观察、变色液体培养基等BACTEC MGIT960系统等。
qftt检测的原理及临床应用价值
QFT-T检测的原理及临床应用价值1. 原理介绍QFT-T（QuantiFERON-TB Gold Test）是一种血清学检测方法，用于诊断结核病。
它基于渗透素刺激人体T淋巴细胞，测量干扰素-γ（IFN-γ）的水平。
该检测方法在临床实践中被广泛应用，并且具有明显的优势。
QFT-T检测的原理如下： - 收集患者的静脉血样本，并将其分为三个试管。
- 第一个试管是阴性控制试管，其中只含有血清来激活细胞。
- 第二个试管是激动性试管，其中加入渗透素（TB抗原）来刺激T淋巴细胞产生干扰素-γ。
- 第三个试管是阳性控制试管，其中加入Phytohemagglutinin（PHA）来刺激T淋巴细胞产生干扰素-γ。
- 所有试管培养24小时后，通过酶联免疫吸附试验（ELISA）来测量干扰素-γ的水平。
- 最后通过计算，来确定结核感染的结果。
2. 临床应用价值QFT-T检测在临床上具有较高的应用价值，主要体现在以下几个方面：2.1 早期诊断QFT-T检测可以在结核病早期提供可靠的诊断依据。
相比于传统的结核菌素皮肤试验，QFT-T检测具有更高的灵敏度和特异性，能够更准确地检测出感染者。
2.2 鉴别结核感染与结核病QFT-T检测能够帮助鉴别结核感染与结核病之间的差异。
对于那些接触过结核菌但尚未发展成结核病的患者，QFT-T检测可以帮助确定是否需要进行预防性治疗。
2.3 监测疗效QFT-T检测可以用于监测结核病患者的疗效。
治疗后，干扰素-γ水平会下降，所以通过定期检测QFT-T结果可以评估治疗效果。
2.4 排除结核感染QFT-T检测可以帮助排除结核感染。
对于那些胸部X线检查和症状都不典型的患者，通过QFT-T检测可以帮助减少不必要的结核病治疗。
3. 优势与局限QFT-T检测作为一种新兴的结核病诊断技术，具有以下优势：•高灵敏度和高特异性•操作简单，结果可靠•能够早期发现结核感染•可以在结核菌素皮肤试验失效的情况下使用然而，QFT-T检测也有一定的局限性：•需要专业的实验室设备和技术人员•无法区分活动性结核病与非活动性结核感染•在免疫功能低下的患者中的准确性可能较差4. 结语QFT-T检测作为一种基于干扰素-γ水平测量的新型结核病诊断方法，在临床上具有较高的应用价值。
结核病实验室检查
结核病实验室检查结核病是一种严重的传染病，通常由结核分支杆菌引起。
这种病菌会侵入肺部并引起肺结核，而也可以通过血液传播到其他部位，如淋巴、骨髓和肝脾等。
在许多地方，特别是在发展中国家，结核病仍然是一种普遍的疾病，因此及早诊断和治疗至关重要。
结核病实验室检查是确诊结核病的一种重要方法。
结核病实验室检查通常涉及多种类型的检测，例如：1.酸杆菌检测结核分支杆菌是酸杆菌，因此酸杆菌检测是一种常用的实验室检查方法。
该方法不需要复杂的设备并且具有高度的特异性和灵敏度。
患者的样本可以是咳嗽的痰液、唾液或肺组织，也可以通过胃镜获得胃肠液。
如果酸杆菌检测呈阳性，则可以确诊结核病。
但是，该方法也存在一些局限性，例如在一些情况下不能检测出结核分支杆菌，如某些菌株可以耐受某些药物。
2. 结核抗体检测结核抗体检测是另一种可以用于诊断结核病的实验室检查方法。
该方法通常使用ELISA（酶联免疫吸附试验）或其他类似方法检测患者的血清中是否存在结核抗体，如果测试结果呈阳性，则表示患者可能感染了结核分支杆菌。
但是，结核抗体检测的结果可能会出现假阳性或假阴性的情况，这限制了其在临床实践中的应用。
3.结核病PCR检测PCR检测是检查抗原核酸序列的一种方法。
由于PCR技术可以扩增极微量的DNA，并且非常特异和灵敏，因此可以检测出非常小的感染量。
在结核病中，PCR检测可以用于检测结核分支杆菌的DNA，以确认病原体的存在。
但是，该方法对样本中的DNA污染非常敏感，因此必须进行严格的实验室操作和质量控制。
总之，结核病实验室检查是确诊结核病的一种重要方法。
这些测试方法都具有不同的优缺点，并且结果可能受到许多因素的影响。
因此，必须在临床实践中综合考虑这些方法的结果和临床表现，以取得最佳的诊断结果。
同时，实验室技术人员必须受过专业培训，严格遵守操作规程，以确保准确诊断和最佳治疗效果。
结核病实验室诊断技术介绍
1．结核分枝杆菌鉴定方法1. 1萋尼氏抗酸染色痰涂片显微镜检查目前萋尼氏抗酸染色痰涂片显微镜检查是我国结核病实验室使用最为普遍的方法，其操作简单快捷，特异性高，设备要求低，但是灵敏度较低，不能及时发现病人。
1.2 发光二极管荧光显微镜（LED荧光显微镜）发光二极管荧光显微镜管利用二极管光源，延长了显微镜使用寿命，不需要暗室，且价格低廉，可以提高涂片的阳性检出率。
目前在国内应用评估结果显示灵敏度较明场显微镜明显提高，已在部分区县开始使用。
1.3 交叉引物恒温扩增结核病诊断技术在恒定温度下，特殊的引物和特异性探针在酶的作用下，反应体系在一个密闭的反应管内反应。
扩增反应一般不超过一个小时，最短半小时。
目前应用玻璃化试剂，稳定性好，便于运输。
目前在国内区县级应用评估。
1.4 夹层杯结核病诊断方法将痰标本（或其它标本）用专用消化灭活液充分消化，完全暴露并保留抗酸杆菌，通过自动离心涂片机（或半自动制片染色机）对消化后的标本进行充分集菌。
直接在夹层杯装置中进行抗酸染色，取出基片或膜片置于普通显微镜进行观察。
夹层杯法操作方便快捷，便于标准化操作，通过消化灭活，安全性改善，阳性检出率也比直接涂片法大大提高。
夹层杯的装置有沉降式和虑过式，适用于不同工作量的医疗机构。
1.5 环介导等温扩增方法采用2对引物在等温条件下即可完成DNA的扩增，扩增结果通过肉眼观察荧光进行判定，诊断是否为结核病。
同时整个反应体系采用封闭系统减少了工作区域扩增子的污染，整个反应过程只需一个小时即可完成，通过肉眼观察荧光判读结果。
2．结核分枝杆菌培养方法2.1 固体培养培养是结核病诊断的精标准，也是获得分离菌株开展耐药检测的前提，我国结核病实验室最常用的是固体罗氏培养法，包括简单法和中和离心法。
虽然培养是诊断的精标准，但是花费时间长，需要4-8周时间。
2.2 液体培养液体培养通过添加生长刺激剂，改变检测方法提高检测灵敏度等方式缩短了阳性报告时间。
结核病实验室诊断技术
GenoType MTBDR and 诊断结核感染及对利福 MTBDRplus；INNO- 平和异烟肼药物敏感性 LiPA Rif.TB
Frane; LW Scientific; Zeiss
诊断结核患者
Cepheid GeneXpert
诊断结核感染及对利福 平的耐药性
WHO推荐的结核新诊断技术
方法 DNA微阵列芯片法
有前景的几种新技术
❖ 分子诊断技术:GeneXpert（Cepheid公司） ❖ 分子线性探针技术:INNO-LIPA（Innogenetics公司） ❖ 反向点杂交技术:GenoType MTBDR （Hain Lifescience）
分枝杆菌菌种鉴定试剂盒（亚能生物） ❖ 基因芯片技术：微阵列芯片法（博奥生物） ❖ 细胞免疫学技术：T-SPOT.TB（Oxford Immunotec公司）
目前诊断方法回顾
细菌学检测方法 ： 涂片、常规培养、快培 其他辅助检查方法：皮试、结核抗体
目前诊断方法的局限性
涂片的缺点： 敏感性低； 特异性差； 无法区别死菌与活菌
培养的缺点： 耗时久，一般需4~8周； 阳性率低，约30%~50%；特异性差， 无法区别MTB与NTM
皮试的缺点： 敏感性低特异性差 抗体检测缺点：敏感性低特异性差
新型诊断技术产品比较
企业 美国 Cepheid
比利时 Innogenetics 德国 Hain Lifescience 中国 亚能生物
中国 博奥生物
英国 Oxford Immunotec
方法
产品特点
GeneXpert
同时检测MTBC和判断利福平耐药； 快速；简便；安全
线性探针杂交法 （INNO-LIPA）
➢ 新的实验诊断技术可弥补传统方法的不足，提高诊 断的灵敏度和特异性，但各有缺点或不足，难以完 全满足临床检测需求，因此，新型结核杆菌诊断技 术及产品的研发势在必行。
结核病实验室诊断技术2017.10.13
• 绝对浓度法 • 比例法
• 液体培养法
基于固体培养基；时间：4周 多种药物
基于液体培养基，时间：4-12天 INH/RFP/SM/EMB/PZA
结核分枝杆菌药物敏感试验
不同药敏方法的差异
三者在临界药物浓度接种菌量、结果判读方法等方面都有一定差 别，导致结果有很少一部分不相符
比例法和绝对浓度法检测结果的一致率4 药均高达96 %以上,对于 结核分支杆菌,二种方法测试 SM INH RFP EMB的耐药率均无显著 性差异
涂片显微镜检查的敏感性
观察到的AFB
AFB估计数量 涂片阳性的可能性(%)
数量
( /ml)
• 0 in ≥100 fields
< 1,000
<10
• 1-2 in 300 fields 5,000 – 10,000
50
• 1-9 in 100 fields about 30,000
80
• 1-9 in 10 fields
结核分枝杆菌药敏试验-菌型鉴定
利用固体罗氏鉴别培养基的鉴别：
中性罗氏 培养基
+
噻吩-2-羧酸 肼TCH
+
对硝基苯 甲酸PNB
+
菌型鉴定 NTM
+
+
-
人型Mtb
+
-
-
牛型Mtb
结核分枝杆菌药敏试验-菌型鉴定
• 原理：硝基苯甲酸还原酶机制
绝大部分非结核分枝杆菌能将对硝基-苯甲酸（PNB ）还原为细菌能够利用的对氨基-苯甲酸（PABA），而 绝大部分（98%以上）MTBC缺乏对硝基-苯甲酸（PNB ）还原酶活性，为对氨基-苯甲酸（PABA）将对硝基苯甲酸（PNB）还原为细菌能够利用的对氨基-苯甲酸 （PABA） • 局限：鉴定周期长15天-30天，特异性不高
结核病的诊断标准
结核病的诊断标准结核病是一种由结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis）引起的慢性传染病，影响人类的呼吸系统。
要确诊结核病，医生通常会根据患者的症状、体征、实验室检查及影像学结果来做出判断。
以下是结核病的一般诊断标准及参考内容：1. 临床表现：结核病的常见症状包括长期持续咳嗽，可能伴有咳痰、咯血、胸痛、乏力、发热和体重下降。
因此，在诊断结核病时，医生需要仔细询问病史，包括症状的发生时间、频率、持续时间等。
2. 胸部X线检查：胸部X线是诊断肺结核的常用检查方法。
在结核病初期，胸部X线可能没有明显的异常，但在后期，可以看到肺部阴影、斑点状浸润和块状阴影。
这些结果是结核病的一种指示性特征。
3. 结核菌素皮肤试验（TST）：结核菌素皮肤试验是一种常用的结核病筛查方法。
在TST中，医生会将结核菌素注射到皮肤上，然后观察反应。
如果在48-72小时内形成硬结，则被视为阳性反应。
然而，TST不能区分活动结核感染和旧有感染，所以需要结合其他检查结果来做出诊断。
4. 结核分枝杆菌的培养与检测：通过结核杆菌的培养和分离，可以确定患者是否感染结核分枝杆菌。
这是一种特异性的方法，但需要相当长的时间（一般为6-8周）。
另外，还可以通过监测患者咳嗽样本中的结核分枝杆菌DNA来进行检测。
5. 基因扩增试验（GeneXpert）：GeneXpert是一种快速诊断结核病的分子诊断方法。
通过GeneXpert技术，可以检测结核分枝杆菌的核酸，并确定其对常用结核药物是否具有耐药性。
这是一种快速、高度敏感和特异性的诊断方法。
6. 组织活检：当其他检查结果无法确定患者是否感染结核分枝杆菌时，医生可能会进行组织活检。
在该检查中，医生会收集患者的肺组织样本进行检测，以确定结核分枝杆菌是否存在。
需要指出的是，以上诊断标准及参考内容仅供参考，结核病的确诊仍需要专业医生根据患者的具体情况综合判断。
因此，在怀疑结核病的情况下，请务必就医并寻求专业诊断与治疗。
结核病分子诊断
3、耐药基因检测
多重耐药结核杆菌、广泛耐药结核杆菌的流行， 是结核病防治中的重大问题
耐药的主要原因是药物主要靶点的基因发生了 突变
检测这些耐药基因相关突变，可为临床治疗提 供依据：例如异烟肼耐药菌存在KatG基因突变 或缺失，突变模式为S315T。利福平耐药菌发生 发生了点突变、插入或缺失，突变形式为S531L、 H526Y等。
尿液 清晨第一次全部尿量或24小时尿沉渣
胸腹腔积液 尽快送检、离心
谢谢聆听！
结果判读
试验分四组：空白对照组、抗原组(ESAT-6和CFP10)、阳性对照组(植物血凝素PHA)。
通常正常结果：空白对照孔没有或有很少的斑点而 PHA对照孔斑点数超过20个。 空白对照孔斑点数超 过10个时结果被认为是“不确定”。当PHA对照孔 斑点数少于20个时，检测结果被认为是“不确定”。
如果抗原A和/或抗原B有应答，检测结果为“有反 应性”，参照以下标准：
空白对照孔斑点数为0-5个时且（抗原A或抗原B孔 的斑点数）-（空白对照孔斑点数）≥6；
空白对照孔斑点数为6-10个时且（抗原A或抗原B 孔的斑点数）≥2×（空白对照孔斑点数）；
检测结果为“无反应性”：不符合上述标准且 PHA对照孔正常。
还是死菌，也不能对疗效进行评价。
临床意义：
TB-DNA阳性主要见于：传统培养或涂 片阳性的患者，菌量多，有活力；涂片或培 养阴性的患者，患者菌量少，涂片或培养阳 性率低；经治疗后带有死菌或低活力菌的患 者；体内结核杆菌已死亡，但DNA尚未分 解。
TB-DNA阴性主要见于：非结核分枝 杆菌感染。非结核病患者；不排菌患者。
凡临床怀疑肺结核的患者，在送检痰涂片 和痰培养的同时，送检痰TB-DNA检查。
结核病实验室检测流程标准
结核病实验室检测流程标准结核病是一种由结核分枝杆菌引起的慢性传染病，其传染性强，严重威胁人类健康。
为了及时发现和诊断结核病，实验室检测是必不可少的一环。
本文将从标本采集、实验室检测和结果判读三个方面，介绍结核病实验室检测流程标准。
一、标本采集结核病的标本采集是实验室检测的第一步，其质量直接影响后续检测结果的准确性。
标本采集应在严格的无菌条件下进行，采集的标本应包括痰液、胸腔积液、尿液、脑脊液等。
在采集痰液时，应让患者深呼吸数次，然后咳出痰液，避免口腔分泌物的污染。
采集胸腔积液时，应在穿刺前进行消毒，并在穿刺后立即将标本送至实验室。
采集尿液时，应让患者在清晨第一次排尿时采集，避免尿液的稀释。
采集脑脊液时，应在穿刺前进行消毒，并在穿刺后立即将标本送至实验室。
二、实验室检测结核病的实验室检测主要包括涂片法、培养法、PCR法等。
涂片法是最常用的检测方法，其操作简单、快速，但灵敏度较低。
培养法是检测结核分枝杆菌的“金标准”，其灵敏度高，但需要较长的培养时间。
PCR法是一种新兴的检测方法，其灵敏度高、特异性强，但需要较高的技术水平和设备支持。
实验室检测应在严格的无菌条件下进行，避免标本污染和交叉感染。
检测结果应及时记录和报告，确保患者能够及时接受治疗。
三、结果判读结核病的实验室检测结果应根据临床表现和其他检查结果进行综合判读。
涂片法和PCR法的阳性结果可以初步诊断结核病，但需要进一步的确认。
培养法的阳性结果可以确诊结核病，但需要排除其他细菌感染。
实验室检测结果应及时通知临床医生，以便制定合理的治疗方案。
综上所述，结核病实验室检测流程标准包括标本采集、实验室检测和结果判读三个方面。
标本采集应在严格的无菌条件下进行，实验室检测应遵循相应的操作规范，结果判读应综合考虑临床表现和其他检查结果。
只有严格按照标准操作，才能确保结核病的及时发现和诊断，保障人民群众的健康。
简述肺结核上报的诊断标准
简述肺结核上报的诊断标准肺结核是一种由结核分枝杆菌引起的传染病，其临床表现复杂多样，诊断主要依靠临床症状、病史、实验室检查和影像学表现。
为了及时发现和控制肺结核病例，各国纷纷制定了相应的肺结核上报的诊断标准。
一、临床症状和病史：肺结核的临床症状包括咳嗽、咳痰、咳血、胸痛、低热、盗汗、乏力等。
病史方面，需要了解是否有接触过结核病人、结核病史、是否有免疫功能低下等。
二、实验室检查：1. 痰涂片检查：通过显微镜观察痰液中的结核分枝杆菌，阳性结果是肺结核的重要依据。
一般需要连续3天检查，每天早晨采集痰液。
2. 痰液培养：将痰液标本接种到含有结核分枝杆菌培养基的培养皿中，培养约6-8周，观察是否有结核分枝杆菌生长。
3. 结核菌素试验：使用结核菌素皮肤试验，注射结核菌素后观察24-48小时内皮肤反应情况，阳性结果提示免疫系统对结核分枝杆菌曾经暴露过。
4. 基因检测：通过PCR等技术，检测痰液中结核分枝杆菌的核酸，从而快速确定诊断。
三、影像学表现：肺结核在胸部X线片上的表现多种多样，常见的有结节、空洞、浸润阴影等。
结合临床症状和实验室检查结果，结合影像学表现，可以综合判断是否为肺结核。
根据上述诊断标准，肺结核的确诊需要满足以下条件：1. 临床症状符合肺结核的特点，如长期咳嗽、咳痰、咳血等。
2. 有结核病史或曾接触过结核病人。
3. 痰涂片检查连续3天阳性，或痰液培养检查阳性。
4. 结核菌素试验阳性或基因检测阳性。
5. 胸部X线片上有结核的典型影像学表现。
在肺结核的诊断中，临床医生需综合考虑病人的症状、病史、实验室检查和影像学表现。
痰涂片检查和痰液培养是诊断肺结核的重要手段，结核菌素试验和基因检测可以作为辅助手段。
同时，胸部X 线片的观察也对诊断肺结核有重要意义。
通过以上诊断标准的综合判断，可以准确诊断肺结核，并及时采取相应的治疗措施，以避免疾病的进一步传播和加重。
结核病的实验室诊断方法及评价
耐多药结核病的实验室诊断条件：因耐多药结核分枝杆菌的生物危险性，1）需P2及以上实验室，目前我院实验室条件基本具备即将投入运行，2）日常培养及涂片用的生物安全柜滤膜已超出使用年限，工作人员生物安全得不到保障，应定期予以更换。
耐多药结核分枝杆菌主要以结核分枝杆菌体外药物敏感性测定作为其诊断依据。
因此其基础是培养，只有培养出阳性结核分枝杆菌才能进一步通过结核分枝杆菌体外药物敏感性测定诊断是否为耐多药结核分枝杆菌。
1.已进人临床常规应用的测定方法:目前包括绝对浓度法、比例法及应用BACTEC460、BACTEC 960、BacT/ ALERT 3D、ESPII等仪器系统快速检测结核分枝杆菌的药物敏感性。
其中:绝对浓度法以最低抑菌浓度或以无生长为终点作为判断标准，是我国目前普遍采用的方法;比例法以是否能够抑制99%的细菌生长作为判断标准，是世界卫生组织推荐使用的方法;后四种仪器方法则是比例法的特化，其特点是以细菌的代谢过程指示细菌生长状况。
2.处于研究探索阶段的测定方法:此类方法很多，抗性比例法、Etests法、噬菌体生物扩增法、液体变色培养基测定法、荧光素酶测定法、硝酸盐还原试验等。
3分子生物学方法对结核分枝杆菌耐药性检测已有一些进入临床检测。
基因突变是引起抗结核药物耐药性的最主要的原因。
多种以PCR为基础的分子生物学技术用于检测与耐药相关基因的突变，作为快速耐药性检测方法在实验室或临床得到开展。
这些方法具体包括：主要是DNA序列分析法，聚合链反应-单链构象多态性分析（PCR-SSCP），另外还包括基因芯片技术、异质性双链构象分析、变性梯度凝胶电泳、线性探针杂交技术、RNA/RNA错配检测技术和分子灯塔技术等。
由于结核分枝杆菌的耐药性与基因突变的确切关系未完全阐明，检测耐药相关基因的分子生物学方法虽然能快速准确地检测到耐药相关基因的突变，但由于判断药物敏感性时存在固有的缺陷，检测结核分枝杆菌耐药性的基因型鉴定法不能完全替代表型鉴定法。
结核病实验室课件
谢谢
行检测
4
结果分析：根 据检测结果判 断患者是否患
有结核病
血液检测
结核菌素试验 （TST）：检测结
核菌感染
结核菌培养：检测 结核菌的存在
抗结核药物敏感性 试验：检测抗结核
药物的敏感性
结核病分子生物学 检测：检测结核菌 的基因型和耐药性
影像学检测
01
胸部X线检查： 发现肺部病变， 判断病变性质
02
胸部CT检查： 显示肺部病变 细节，判断病 变范围
保持通风：保持 实验室通风良好， 降低空气传播风 险
定期消毒：定期 对实验室进行消 毒，确保环境安 全
疫苗研发
01
疫苗类型：结核病疫苗主要有卡介苗、BCG、MVA等
02
研发进展：目前卡介苗是唯一广泛使用的结核病疫苗，其他疫苗尚在研发中
03
疫苗效果：卡介苗对预防结核病有一定效果，但保护率有限
04
研发挑战：结核病疫苗研发面临诸多挑战，如疫苗保护率低、免疫原性差等
结核病
结核病的症状
咳嗽、咳痰、胸 痛、呼吸困难等
呼吸道症状
发热、盗汗、乏 力、体重下降等
全身症状
淋巴结肿大、皮 疹、关节痛等局
部症状
结核病潜伏期较 长，症状不明显，
容易被忽视
结核病实验室检 测
痰液检测
1
痰液采集：使 用无菌容器收
集患者痰液
2
痰液处理：将 痰液进行离心、
沉淀等处理
3
痰液检测：使 用显微镜、培 养基等方法进
结核病实验室课件
演讲人
目录
01. 结 核 病 基 础 知 识
02. 结 核 病 实 验 室 检 测
03. 结 核 病 实 验 室 诊 断
肺结核诊断金标准
肺结核诊断金标准肺结核是一种由结核分枝杆菌引起的慢性感染性疾病，其诊断具有一定的难度和复杂性。
为了提高肺结核的诊断准确性，医学界制定了一系列的诊断标准，其中最具权威性和指导性的就是肺结核诊断金标准。
本文将详细介绍肺结核诊断金标准的内容和应用。
首先，肺结核诊断金标准包括临床表现、病原学检查、影像学检查和实验室检查等方面的内容。
在临床表现方面，患者通常会出现长期咳嗽、咳痰、乏力、体重减轻等症状。
病原学检查主要是通过痰涂片和培养来检测结核分枝杆菌的存在，影像学检查则是通过X光、CT等技术来观察肺部病变情况，实验室检查则包括血液、尿液等生化指标的检测。
其次，肺结核诊断金标准的应用需要综合考虑患者的临床表现、实验室检查和影像学检查等多方面的信息。
在临床表现方面，需要注意患者的症状持续时间、发热情况、咳痰性质等，病原学检查则需要重点观察痰涂片和培养结果，影像学检查则需要结合X光和CT的表现来判断肺部病变的情况，实验室检查则需要关注血液、尿液等指标的异常情况。
最后，肺结核诊断金标准的应用有助于提高肺结核的诊断准确性和及时性，有利于早期治疗和控制疾病的传播。
因此，医务人员在进行肺结核诊断时，应当严格按照肺结核诊断金标准的要求进行，综合分析患者的临床表现、实验室检查和影像学检查等信息，以确保诊断的准确性和及时性。
总之，肺结核诊断金标准是肺结核诊断的重要依据，其应用能够提高肺结核的诊断准确性和及时性，有助于早期治疗和控制疾病的传播。
因此，医务人员应当熟练掌握肺结核诊断金标准的内容和应用要求，以提高对肺结核的诊断水平和治疗效果。
结核病实验室检测新诊断技术
HAIN和目前常规药敏方法比较
比较项目 时间
生物安全级别要求 人员培训
操作简易程度 仪器设备
HAIN 1-2天 较低 2-3天 简单 性价比较高
常规药敏方法 2-3个月
二级实验室 2-3个月 复杂 --
对环境洁净度要求
较高，易出现 假阳性
较高
四、GENECHIP基因芯片耐多药 检测技术
适用范围： 1、TB复合群鉴定。 2、TB菌种鉴定。 3、利福平和异烟肼耐药检测 。 原理：多重PCR扩增和反向杂交来识别。
，
耐药检测基因芯片
基因芯片是基于特定基因位点突变与耐药性的相关性，通 过PCR扩增和核酸杂交技术，检测荧光信号的有无，判断 特定位点的突变情况和细菌耐药性的检测方法。
结核分枝杆菌耐药检测基因芯片基于rpoB/katG/inhA的基 因突变，快速检测分离株或者痰样本中结核杆菌耐药性 （利福平、异烟肼）。
发光二极管荧光显微镜（LED）
镜下视野
发光二极管荧光显微镜（LED）
不需要加热玻片，步骤简单 视野比普通的显微镜大大2-4倍 • 对数目少的不必使用镜油 • 节省人力时间，时间为普通的1/4每天可检查至少60个涂
片 • 可帮助早期诊断肺结核 – 即使菌浓度较低 • 杆菌也有很高的灵敏度，与ZN相比阳性发现率平均增加
适用范围：痰涂片镜检 十一五国家重大科技专项：泰兴、江阴 厂家：湖南天骑公司 原理：集菌法
流程图
痰标本消化灭活 基片的夹层杯
离心 细菌附着在基片
在夹层杯中
直接染色 取出基片
于载玻片上
镜检 自动阅片计算机报告系统。
所需仪器设备：普通的抗酸染色液、彭氏杯 （专利）、涂片机、KP21型快速干片机、抗 酸杆菌自动阅片计算机报告系统。
结核病实验室检查的临床意义
结核菌培养临床价值
确诊结核病
1份痰标本直接涂片抗酸杆菌镜检阳性+1份 痰标本结核分枝杆菌培养阳性即可确诊。 痰涂片阴性，肺部影像学检查符合活动性 肺结核影像学表现+1份痰标本结核分枝杆 菌培养阳性
用于耐多药结核疗效判定
治愈： （1）患者完成疗程，且在疗程的后12个月，至少最 后5次痰培养（每次间隔至少30天）连续阴性。 （2）如出现1次痰培养阳性，其后痰培养（间隔至 少30天）最少连续3次阴性。 失败： 治疗的最后12个月，5次痰培养中有两次或两次以 上阳性；或者在最后的3次，培养中有任何一次是 阳性。
Chiappini E, Fossi F, Bonsignori F, et al. Utility of interferon-γ release assay results to monitor anti-tubercular treatment in adults and children. Clin Ther, 2012, 34: 1041-1048.
• 灵敏度
基本不受免疫力低下/受抑制影响，在肺外结核患者中有很 高的检出率
美国FDA数据：灵敏度95.6%(175/183) 国内临床数据：灵敏度95.3%(624/655)
实验结果的解释
• 阴性结果 提示患者体内不存在针对结核杆菌特异的效应T细胞。 假阴性结果： ①感染阶段不同；②少数免疫系统功能不全患者 • 阳性结果 提示患者体内存在针对结核杆菌特异的效应T细胞，患者存在结 核感染。但是否是活动性结核病，需结合临床症状和其它检测 指标综合判断。 假阳性结果： ① 4种环境分枝杆菌感染时：M.kansasii（堪萨斯）、M.szulgai （苏氏）、M.marinum（海）、M.gordonae（戈登）
结核病实验室诊断PPT课件
结核杆菌离心制片技术
2015年7月至2015年11月，对本院257例痰液和纤维支气管镜灌洗液 进行直接涂片法和离心制片法比对验证试验，结果如下：
直 接
离心制片法
涂
合计
片
阳性
阴性
法
阳 性
41
0
41 (15.9%)
阴 性
17
199
216 (84.1%)
合
58
199
计 （22.6%） (77.4%)
257
• Xpert MTB/RIF 在MDR或HIV问题不十分 严重的地区，可以考虑作为显微镜检查基础 之上的后续检测，特别是用于涂阴标本的进 一步检测。
体外r-干扰素释放试验
• 蛋白质水平
结核菌素试验（TST）
潜伏性结核 （LTBI）
T-SPOT.TB QuantiFERON-TB Gold in-tube (QFT-GI)
药物 RFP INH SM EMB CPM OFX ETH PAS LVF MOF RFB AMI KAN CLO
耐药 例数
80 146 94
58 50 61 41 49 53
62
60 11 13 87
耐药率 %
15.7
28.6
18.4
11.4
9.8
11.9
8.0
9.6
10.4
12.1
11.7
2.2
灵敏度
基本不受免疫力低下/受抑制影响，在肺外结核患者中有 很高的检出率
美国FDA数据：灵敏度95.6%(175/183) 国内临床数据：灵敏度95.3%(624/655)
体外r-干扰素释放试验
实 验 效 果 图
阴性结果
结核杆菌的三种实验方法的应用评估
结核杆菌的三种实验方法的应用评估目的比较痰涂片法、荧光定量PCR法和结核抗体检测法对结核病的诊断意义。
方法选取2014年7月～10月在我院诊疗疑似或确诊患者172例，进行涂片抗酸染色、荧光（PCR）检测和采集血样进行结核抗体检测。
结果172例检样中，抗酸染色痰液标本阳性例只有20例阳性率为11.6%。
荧光PCR法阳性率55例，阳性率31.2%，结核抗体阳性例为87例；阳性率为50.6%。
结论三种方法中，以结核抗体阳性率最高，荧光PCR法次之，抗酸染色法阳性率最低，如果三种方法联合运用，相互佐证，可提高准确性。
标签：结核杆菌；检测方法结核杆菌又称分枝杆菌，是引发结核病的病原菌，可能对全身的各大器官造成侵害，临床中以肺结核最为常见。
结核杆菌细胞含有大量分枝菌酸，染色后能抵抗强脱色剂盐酸乙醇的脱色，故又称抗酸杆菌，结核杆菌是引起结核病的病原菌，可侵犯全身器官，但以肺结核为多见。
结核病至今仍为重要的传染病，近年来，因艾滋病、吸毒等社会原因及免疫制剂的应用，其发病呈上升趋势。
鉴定结核杆菌的方法有很多[1]。
本研究应用痰涂片染色法、PCR-荧光法、结核分枝杆菌抗体检测，对172例标本同时进行比较和评价。
1资料与方法1.1一般资料收集自2014年7月～10月在我院诊疗疑似或确诊的患者标本172例。
所有患者均通过痰涂片抗酸结核杆菌检验、胸部X线片、临床表现以及结核菌素试验等诊断为肺结核。
涂片法和荧光PCR为痰标本。
嘱患者留取晨痰2～5ml（结核患者需停抗结核药3d）。
结核抗体检测则采静脉血2ml。
1.2方法1.2.1涂片染色镜检是临床常用的简易快速的检查方法：取痰或其他已外理好的标本0.1ml，于载玻片上均匀涂抹成2cm×2.5cm椭圆形范围，以自然干燥和火焰固定后，进行抗酸染色，采用珠海贝索生物技术有限公司的结核染色液。
染色步骤：①石碳酸复红溶液染色20min；②5%盐酸酒精脱色3min；③亚甲基蓝溶液染色30S。
结核病实验室检查
肺穿刺活检
通过穿刺获取肺部病变组织，进行病理学检查，是确诊结核病的可靠方法。
淋巴结活检
对肿大淋巴结进行穿刺或切除，进行病理学检查，有助于结核病的诊断。
其他检查方法
结核菌素试验
通过皮内注射结核菌素，观察皮肤反 应，用于判断是否感染结核分枝杆菌 。
分子生物学检测
利用聚合酶链式反应（PCR）等技术 检测结核分枝杆菌的核酸，具有较高 的灵敏度和特异性。
结核病实验室检查
汇报人：文小库
2024-01-07
CONTENTS
• 结核病概述 • 结核病实验室检查的重要性 • 结核病实验室检查方法 • 结核病实验室检查结果解读 • 结核病实验室检查的局限性
01
结核病概述
结核病的定义
01
结核病是一种由结核分枝杆菌感 染引起的慢性传染病，主要侵犯 肺部，但其他器官也可受累。
结核病实验室检查通常需要使用昂贵的试 剂和设备，导致检查费用较高，不利于在 资源有限地区推广。
结果解读的局限性
解读难度大
结核病实验室检查结果较为复杂 ，需要专业医生进行解读，对于 基层医疗机构和广大患者来说存
在一定难度。
主观性强
结核病实验室检查结果的解读需 要医生根据患者的临床表现和其 他检查结果进行综合判断，不同 医生之间的主观判断可能存在差
异。
动态监测困难
结核病实验室检查结果的动态监 测对于病情评估和治疗效果判断 具有重要意义，但实际操作中存
在一定困难。
结核病抗药性问题
抗药性普遍存在
结核病菌对抗结核药物产生抗药 性的现象较为普遍，导致治疗时 间延长、疗效下降和复发率增加
。
抗药性监测困难
抗药性监测需要专业的实验室技术 和设备，且监测周期较长，不利于 及时发现和处理抗药性问题。
结核病实验室检查程序
结核病实验室检查程序
1. 什么是结核病？
结核病是一种由结核分枝杆菌引起的感染疾病，可以影响到人体的各个器官，但最常见的是肺结核。
结核病可以通过空气飞沫传播，而且早期症状不明显，所以容易被忽视或误诊。
及时的检查和治疗非常重要。
2. 哪些人需要进行结核病实验室检查？
结核病实验室检查通常用于以下情况：
1）接触过结核病患者的人；
2）具有结核病高危因素的人，比如长期接触输血者；
3）在体检中发现患者的结核病危险因素比较高；
4）治疗结核病的患者需要定期检查。
3. 结核病实验室检查的种类
结核病实验室检查主要分为两类：诊断性检查和疗效监测。
诊断性检查包括结核杆菌培养、结核杆菌鉴定、结核文菌鉴定、结核菌DNA 检测、结核菌皮试等。
其中结核杆菌培养是目前诊断肺结核的主要方法，通过培养痰液或其他组织中的结核杆菌来确定是否感染。
疗效监测包括结核杆菌培养和药敏试验、结核杆菌抗体测定、病变尺寸监测、放射学监测等。
4. 检查前的准备和注意事项
在进行结核病实验室检查前需要注意以下几点：
1）停止抗生素的治疗，因为抗生素可能影响实验室检查结果；
2）搜集好标本，可以是痰液、尿、体液、组织等；
3）在进行实验室检查前需要先做结核菌皮试确认是否感染结核杆菌。
5. 结论
结核病是一种潜伏期较长的传染病，定期进行结核病实验室检查对早期确诊和及时治疗非常重要。
目前常用的检查方法包括结核杆菌培养、结核菌DNA检测等，但需要注意检查前的准备和注意事项。
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潜伏感染：RNA不转录
不易污染：靶标和扩增产物都是RNA
TB-SAT检测区分MTB和NTM
结核分枝杆菌复合群 （MTB）： 人型结核分枝杆菌 牛型结核分枝杆菌 非洲型结核分枝杆菌
非结核分枝杆菌 （NTM）： 研究表明，TB-SAT可 以区分如下NTM：堪 萨斯分枝杆菌、胞内分 枝杆菌、龟分枝杆菌、 戈登分枝杆菌、海分间上均优于固体培养。 仍然不能满足临床快速诊断的需要
吴学兵，陆彬，桂晓虹等。液体MGIT培养法在结核分枝杆菌检测中的应用评估。检验医学，2013,3（28）：211-214
二、免疫学检测
血清学检测（抗体、抗原） 结核菌素试验（灵敏度、特异性？） 结核感染T细胞检测（γ
ESAT6 + + + -
环境分枝杆菌
M abcessus M avium M branderi M celatum M chelonae M fortuitum M gordonii Mintracellulare
ESAT6 + + + + -
CFP-10 + + + + -
M kansasii
M malmoense M marinum M oenavense M crofulaceum M szulgai M terrae M vaccae M xenopi
一 个 斑 点 一 个 结 核 效 应 淋 巴 细 胞
=
阳性对照 （PHA）
阴性结果
阳性结果
T-SPOT结果的解读-阳性结果
• 活动性结核病 — 典型结核中毒症状 — 影像学支持 • 潜伏性结核感染 — 无结核中毒症状 — 无其它结核患病证据
— 排除其他诊断
• 陈旧性结核 • MTB感染状态 — 典型结核中毒症状 — 未发现结核患病证据 — 无结核中毒症状 — 既往TB史或明确TB证据 • NTM（四种）感染
TB-SAT操作流程
超声波（300W） 痰液预处理 TB-RNA释放 15 min
50 µ l 稀释液 与反应液混合
42℃ 40 min
恒温扩增 实时检测
60℃10 min 42℃ 5 min
全程2小时，会做 PCR，就学的会SAT
TB-SAT检测技术优点
灵敏
检测下限1--10 条菌/ml
污染率低
M smegmatis
12
准确—T-SPOT临床诊断性能
阴性预测值：93.9%（478/509）
• 特异性
BCG）无交叉反应
阳性预测值：95.4%（624/654）
只针对结核分枝杆菌复合群敏感，与绝大多数环境分枝杆菌和卡介苗（
美国FDA数据：特异性97.1%(297/306) 国内临床数据：特异性94.1%(478/508)
结核
胞内
Journal of Clinical Microbiology. 2010, 48(10): 3654–3660.
26
检测全程仅需6小时
同时鉴定MTC与21种NTM
MSM MIN 耻垢分枝杆菌 胞内分枝杆菌 MTC MAV 结核分枝杆菌复合群 鸟分枝杆菌 MTR MGA 次要分枝杆菌 胃分枝杆菌
MKA
MCH MMA MFO MTE MNO
堪萨斯分枝杆菌
龟分枝杆菌龟亚种 海/溃疡分枝杆菌 偶发/猪分枝杆菌 土分枝杆菌 不产色分枝杆菌
MSC
MAB MXE MGI MPH MGO
瘰疠分枝杆菌
龟分枝杆菌脓肿亚种 蟾蜍分枝杆菌 浅黄分枝杆菌 草分枝杆菌 戈登分枝杆菌
MUA
MSZ MDI MSI CC
高孟秋 ，γ-干扰素释放试验检测结果的临床 意义解读，中华结核和呼吸杂志，2014
T-SPOT结果解读-阴性结果
除外结核感染 — 所用抗原为MTB特异性抗原 — 机体没有结核特异抗原致敏的T淋巴细胞 — 目前未感染结核分枝杆菌
假阴性： •感染阶段不同（窗口期） •少数免疫系统功能不全/基础疾病的情况，如HIV感染者、肿瘤患者、婴幼儿 等 •特殊肺外结核：结核性脑膜炎、粟粒性结核灵敏度相对较低 •实验非正常操作：细胞计数不够等 高孟秋 ，γ-干扰素释放试验检测结果的临床 意义解读，中华结核和呼吸杂志，2014
《摘自2014年中国结核病监测报告》
我国是世界上仅低于印度和印尼的第三结核病大国
早期快速诊断与治疗成为制约结核病防控的关键因素
结核病检测技术发展历程
分子诊断时代
DNA诊断：
细菌法： 直接镜检 体外培养
19世纪中叶
RNA诊断：
TMA NASBA
免疫学检测： Ab Ag PPD
PCR LAMP
DNA用于临床检验的不足
“死菌检测呈阳性”，与临床相关性差 不能区分“潜伏感染”“活动性感染” 易交叉污染
反应易受抑制
四、常见的RNA检测技术
NASBA（国外） TMA（国外）
SAT（国内）
TB—SAT 检测技术
SAT技术是将核酸恒温扩增和实时荧光 检测相结合的一种新型RNA检测技术。
结核病实验室诊断技术及应用
全球范围内结核病疫情急剧恶化
全球1/3人口（约20亿）已感染了结核菌， 人口的大规模流动
结核病与艾滋病同时流行 结核菌耐多药菌株的出现 患病率高， 新发患者93万/年，结核菌感染率为约40％ 死亡率高，每年死亡人数达13万 耐药率高 常规结核病实验室检测方法诊断阳性率不到60％。
T-SPOT
20世纪60年代
GeneXpert
基因芯片
20世纪80年代
SAT
20世纪90年代
灵敏度低 检测周期长 成本低
血清学检测
交叉污染 仪器要求复杂 反应抑制
高灵敏度 高特异性 交叉污染少
WHO不推荐 r-干扰素释放实 验
一、细菌法 直接涂片 （阳性率低—5000以上细菌/ml； 不能区分真假、死活）
操作复杂，时间长；对于原发感染初期或免疫低下人群， 可能存在假阴性。 能否疗效监测？——无大量数据
三、结核DNA检测技术
• • • • • 测序——金标准 荧光定量 PCR 环介导恒温扩增法（LAMP） 基因芯片检测鉴定技术 基因Xpert MTB/RIF检测技术
1. 荧光定量 PCR
• 是应用最为广泛的TB-DNA定量PCR检测 方法 • 具有灵敏度高（10CFU/ml）、特异性强、 线性关系好、操作简单等优点。
RNA易降 解，环境中存在时间短
42℃恒温扩 增,30分钟内扩增10亿倍
快速
特异
rRNA特异性非 常高
简便
无提取步骤， 扩增结束即得出结果。
RNA诊断技术的优势
灵敏度高：RNA ≥ DNA拷贝数 与临床相关性好：区分“死活菌”： 减少抗生素滥用
可以诊断“活动性感染”：
活动性感染：RNA转录活跃
母牛分枝杆菌
苏尔加分枝杆菌 迪氏分枝杆菌 猿猴分枝杆菌 质控点
4.Xpert MTB/RIF检测技术
GeneXpert应用
•1、TB复合群鉴定。 •2、利福平耐药检测 。 •3、WHO推荐 •4、Xpert®MTB/RIF检测试剂的阳性检出率 低于人们对分子生物学诊断试剂高敏感度的 预期值，（1000CFU/ml）
一、细菌法
结核菌的培养
结核病病原学诊断的金标准 (培养时间长是其软肋)
一、细菌学检测的新方法 —提高阳性率
发光二极管荧光显微镜（LED） 液体培养（可同时缩短培养时间） 自动化涂片/染色技术（夹层杯法） 不能区分真假、死活；培养仍是金标准 但耗时长、
分枝杆菌固体培养与液体培养比较
液体培养 （BD MGIT960） 疑似新发患者报阳时间 （ d） 复诊患者报阳时间(d) 疑似新发患者阳性率 复诊患者阳性率 污染率 13.63±7.14 22.94±9.55 32.00% 9.30% 6.57% 固体培养 （罗氏L-J） 28.67±10.04 28.53±10.40 17.90% 2.60% 4.0%
Novel Real-Time Simultaneous Amplification and Testing Method To Accurately and Rapidly Detect Mycobacterium tuberculosis Complex J.Clin.Microbiol.2012,50(3):646.DOL:10.1128/JCM.05853-11.
LAMP法和其他PCR法的比较
LAMP法在结核菌检测中的应用
临床试验
—— LAMP法和对照试剂（BD快速培养）对比结果
灵敏度＝89.54% 特异性＝98.93% 总符合率＝95.31%
阳性结果预期值＝98.13% 阴性结果预期值＝93.77%
3. 基因芯片检测技术
通量：可同时检测 16-22种常见分枝杆菌 速度：6小时 灵敏度： 103 CFU/ml 可自动或肉眼判读结果
蛋白质组学的发展 3、4、7种结核杆菌优势表位抗原 （16KD、38KD、MPT64、ESAT-6、CFP10、Mtb8、Mtb8.4、 Mtb16.3）制备多靶点蛋白微阵列 大量的文献报道其敏感性 特异性均显著高于涂片与培养法 可用于结核病的临床辅助诊 断，提高痰涂片和痰培养假阴性的检测率
参考文献略
•由结核杆菌基因组RD1区相同的操 纵子编码的蛋白 •所有的卡介苗（BCG）均丢失RD1 和RD2
•绝大多数的环境分枝杆菌(NTM)也 不存在RD1和RD2区
11
结核杆菌特异抗原：ESAT-6与CFP10
抗原 抗原
CFP-10 + + + -
结核菌群
M tuberculosis M africanum M bovis BCG substrain gothenburg moreau tice tokyo danish glaxo montreal pasteur