第9章 亲和色谱

生物分离工程 第8章 亲和色谱
清洗
洗去色谱柱空隙中和吸附剂内部的杂质，保证目标产物的吸附
和杂质的去除 一般使用与吸附操作相同的缓冲液进行清洗(pH和离子强度相 同)，必要时加入表面活性剂
洗脱
特异性洗脱和非特异性洗脱 特异性洗脱：用与亲和配基或目标产物具有亲和作用的小分子 化合物 非特异性洗脱：调节洗脱液的pH、离子种类和强度、温度等 理化性质降低目标产物的亲和吸附作用，从而达到洗脱的目的。
模型分析(前述吸附理论和模型均可用于亲和色谱的分析)
生物分离工程 第8章 亲和色谱
8.6 亲和色谱的应用
组织纤溶酶原激活剂(t-PA)的纯化-酶的抑制剂为 亲和配基
t-PA是一种糖蛋白，是治疗血栓等心脑血管疾病的蛋 白药物； t-PA主要存在于动物心脏组织中，但含量很低； 目前主要利用重组DNA动物细胞生产t-PA 赖氨酸、精氨酸、氨基苄脒常用作配基
生物分离工程 第8章 亲和色谱 弱共价键：弱共价键是指结合力较弱的可逆共价键， 如氨基与甲酰基之间形成的Schiff碱，醛基与羟基之间 形成的半缩醛基等均为可逆共价键，结合力较弱。
影响亲和作用的因素
离子强度
提高离子强度使静电引力降低 提高离子强度使氢键作用降低或消除 提高离子强度使疏水相互作用增强
生物分离工程 第8章 亲和色谱
第8章 亲和色谱 Affinity chromatograph
生物亲和作用 亲和色谱原理 亲和色谱介质 亲和吸附平衡 亲和色谱过程分析 亲和色谱的应用 亲和膜色谱 其它亲和分离技术
生物分离工程 第8章 亲和色谱
准备
载体 配基 亲和物 杂质
亲和吸附
解吸
亲和色谱过程示意图
硅胶的活化
硅烷化试剂 配基的固定化 直接固定法(慢) 间接固定法(氧化法，碳二亚胺法，戊二醛活化法)
生物分离工程 第8章 亲和色谱
配基密度对蛋白质吸附的影响
通常情况下，目标产物的吸附容量随配基固定化密度 的提高而增大。但是，当配基固定化密度过高时，配 基之间会产生空间位阻作用(steric hindrance)，影响 配基与目标产物之间的亲和吸附，配基的有效利用率 降低； 因此，配基固定化密度也不宜过高，通常存在最佳密 度值范围。
生物分离工程 第8章 亲和色谱
间隔臂的作用(消除空间位阻的影响)
配基
目 标 分 子
间隔臂
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8.4 亲和吸附平衡
吸附等温线
基本上可用Langmuir或Freundlich方程描述
色素亲和吸附平衡
色素配基研究得最多的是辛巴蓝(Cibacron Blue 3GA, CB) CB与蛋白质的结合机理
亲和配基
酶的抑制剂：蛋白酶均存在抑制其活性的物质，这类 物质称为酶的抑制剂。在生物体内蛋白酶的抑制剂可 与蛋白酶的活性部位结合，抑制酶的活性，必要时保 护生物组织不受蛋白酶的损害。 抗体：利用抗体为配基的亲和色谱又称免疫亲和色谱。 抗体与抗原之间具有高度特异性结合能力。但价格很 贵，只适用于产量较小的某些基因工程药物。 A蛋白：A蛋白分子量约42000，与动物免疫球蛋白具 有很强的亲和作用，可用于分离抗原-抗体的免疫复合 体。

(8 .5 )
吸 附 平 衡 方 程 ( 空 间 质 量 模 型 )：
L t -( n + + K S c S ) q q =K c 1 + K S cS
n
(8 . 6 )
式 中 ， L t为 色 素 配 基 的 总 浓 度 ； K 为 蛋 白 质 与 配 基 的 亲 和 结 合 平 衡 常 数 ； 为 空 间 因 子 ； n为 每 个 蛋 白 质 分 子 结 合 的 CB配 基 分 子 数 。
生物分离工程 第8章 亲和色谱 亲和作用体系 主要亲和作用体系
特异性
A
亲和作用分子对
B
高特异性
群特异性
抗原 荷尔蒙 核酸 酶 免疫球蛋白 酶 凝聚素 酶、蛋白质 酶、蛋白质 酶、蛋白质 酶、蛋白质
单克隆抗体 受体蛋白 互补碱基链段 底物、产物、抑制剂 A蛋白、G蛋白 辅酶 糖、糖蛋白、细胞、细胞表面受体 肝素 活性染料(色素) 过渡金属离子(Cu,Zn,Ni等) 氨基酸(组氨酸等)
生物分离工程 第8章 亲和色谱
亲和吸附剂及其制备方法
基质的活化 溴化腈活化法：用于多糖凝胶的活化，被固定的活 性基团为含氨基的配基(R-NH2)。CNBr活化适用于 RNH2型配基的修饰，如蛋白质类配基。 环氧基活化法：可用于多糖凝胶和表面为氨基的载 体的活化，固定分子为R-NH2，R-OH和R-SH的配 基。常用活化试剂为1,4-丁二醇-二缩水甘油醚 (BGE)和环氧氯丙烷，活化过程需要在强碱作用下 进行。
生物分离工程 第8章 亲和色谱
色素配基的“倒伏”
问题的提出：对于大部分蛋白质，色素 亲和吸附容量均随离子强度增大而降低， 即使是与色素分子带同种电荷的血清白 蛋白。(按理应随离子强度的增大而增大) 在较高盐浓度下，色素分子和琼脂糖凝 胶基质之间可以发生强疏水作用，从而 造成色素配基的“倒伏” 色素配基“倒伏”后，其对蛋白质的吸 附容量下降。(吸附量随离子强度的增大 而降低)
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8.5 亲和色谱过程分析
分离过程 进料吸附
特异性吸附和非特异性吸附：非特异性吸附产生于溶质与固定 相介质和配基分子中某些部位的疏水性和静电相互作用。 要求非特异性吸附尽可能低，以提高目标产物的纯度 – 非特异性吸附与其浓度、性质、载体材料、配基固定化方 法以及流动相的离子强度、pH值和操作温度等因素有关； – 当配基或目标产物带有电荷，或者在修饰配基的时候引入 带电基团时，在较低的离子强度下，亲和吸附对杂质的静 电作用较强，非特异性吸附较大； – 在离子强度较高的情况下，由于间隔臂上碳氢链的疏水性 相互作用较强，也可能使非特异性吸附量增大； – 因此，缓冲液的离子强度一般为0.1~0.5mol/L； – 使用高纯度的配基，提高亲和吸附剂的质量； – 对疏水性较大的蛋白质还可加入表面活性剂。
生物分离工程 第8章 亲和色谱 凝集素：是与糖特异性结合的蛋白质(酶和抗体除外)的 总称，大部分凝集素为多聚体，含有两个以上的糖结 合部位，不同的凝集素与糖结合的特异性不同。 辅酶和磷酸腺苷：各种脱氢酶和激酶需要在辅酶的存 在下表现其生物催化活性，即脱氢酶和激酶与辅酶之 间具有亲和结合作用。磷酸腺苷的腺苷部分与辅酶的 结构类似。 色素配基：三嗪色素与DNA的结合，与蛋白质的结合 过渡金属离子：过渡金属离子可与N、S和O等供电子 原子产生配位健，因此可与蛋白质表面的组氨酸的咪 唑基、半胱氨酸的巯基等发生亲和结合作用；也可能 形成螯合物 组氨酸：具有弱疏水性，可与蛋白质发生亲和作用 肝素
具有亲和作用的分子对之间具有“钥匙”和“锁 孔”的关系是亲和作用的必要条件，但并不充分， 还需要分子或原子水平的各种相互作用才能完整 地体现亲和结合作用，包括：
生物分离工程 第8章 亲和色谱
静电作用：亲和作用分子对的结合部位上带有相反电 荷时，产生静电引力。如果满足“钥匙”和“锁孔” 的关系，在近距离发生的静电引力 很强烈的； 氢键：如果亲和作用分子对的一个分子中含有O原子或 N原子，结合部位之间可以产生氢键作用，形成O-H-O 或O-H-N的氢键结合，但氢键的产生与否受结合部位 之间位置关系的严格制约，O-H-O或O-H-N需排列在一 条直线上； 疏水性相互作用：如果亲和作用分子对的一个分子中 含有芳香环或烃基链等疏水基，另一方的结合部位上 也含有疏水区，则两者之间可发生疏水性相互作用， 如含有脯氨酸等氨基酸残基的蛋白质，胶原与单宁的 结合可通过疏水键结合； 配位键：如果亲和作用分子对均与同一金属离子配位， 则两者之间可通过金属配位键结合；
CB分子中的多个芳环使其具有一定的疏水性，可以和蛋白质 的非极性表面发生疏水性相互作用； CB分子上的蓝色发色基团具有和NAD+和NADP+相类似的构 象和尺寸，从而可以和许多核苷酸依赖酶(例如脱氢酶和激酶) 在二核苷酸结合位点发生强烈的特异性结合； 因为CB分子上的三个芳环氢被带负电荷的磺酸基所取代，又 使其具有阳离子交换基的性质，可以和蛋白质发生静电相互作 用
色素亲和吸附平衡
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色素配基与载体表面之间的吸附平衡： LV + cS LS (8 .4 )
式 中 ， L V 为 未 倒 伏 的 配 基 浓 度 ； LS为 倒 伏 的 配 基 浓 度 ； c S为 盐 浓 度 ； 为 盐 作 用 系 数 ( 表 示 盐 对 色 素 配 基 倒 伏 作 用 影 响 的 大 小 )。 平 衡 常 数 为 ： KS= LS cS LV
生物分离工程 第8章 亲和色谱
S te ric c o n sid e ra tio n s & sp a c e r a rm s
S m a ll lig a n d (< 1 ,0 0 0 )
R isk o f ste ric in te rfe re n c e w ith b in d in g b e tw e e n m a trix a n d ta rg e t m o le c u le
pH值
pH将影响蛋白质的解离。因此，如果静电引力对亲和作用的贡 献较大，则pH变化将严重影响亲和作用
抑制氢键生成的物质
脲和盐酸胍的存在可抑制氢键的形成 但脲和盐酸胍高浓度下(>4mol/L)下容易引起蛋白质的变性
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温度 升高温度使静电作用、氢键及金属配位键减弱 但升高温度使疏水性相互作用增强 离液离子 半径较大的离液离子SCN-、I-等使疏水作用降低 螯合剂 加入乙二胺四乙酸(EDTA)等螯合剂除去金属离子， 会使亲和结合作用消失
Biblioteka Baidu生物亲和纯化
利用生物分子间的这种特异性结合作用的原理进行生物 分离纯化的技术称为亲和分离或亲和纯化，其典型代表为 亲和色谱。
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发展历程
1910年最早报道，发现淀粉选择性吸附α-淀粉酶； 1950s，利用半抗原修饰纤维素从血清中纯化了抗体； 1967，溴化腈活化琼脂糖凝胶制备亲和吸附介质，使 亲和纯化技术从研究走向应用 1980s，快速发展，亲和过滤、亲和分配、亲和反胶团 萃取等
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8.1 生物亲和作用
亲和作用的本质
Lys,Arg,His, Glu,Asp,Cys 静 电 作 用
Ser,Thr,Gln,Asn
Val,Leu,Ile Met,Pro, Phe,Tyr,Trp
蛋白质的结合部位及各种结合作用力
生物分离工程 第8章 亲和色谱 一般认为，蛋白质的立体结构中含有某些参与亲和结 合的部位，这些结合部位呈凹陷或凸起的结构； 能与该蛋白质发生亲和作用的分子恰好是可以进入到 此凹陷结构中； 或者该蛋白质的凸起部位恰好能够进入与其发生亲和 作用的分子的凹陷部位； 就像钥匙和锁孔一样
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干扰素的纯化-免疫亲和色谱
干扰素(interferon, IFN)是一类生理活性蛋白，对癌症、 肝炎等疾病具有特殊疗效 可通过动物细胞培养、基因重组大肠杆菌或重组枯草 杆菌发酵生产； 三嗪类色素对IFN具有亲色作用，色素亲和色谱是纯化 IFN的主要方法； 固定金属离子亲和色谱以及免疫亲和色谱也可用于IFN 的纯化。
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8.2 亲和色谱原理
利用亲和吸附作用分离纯化生物物质的液相色谱 法。亲和色谱的固定相是键合亲和配基的亲和吸 附介质 具有高度的选择性或特异性 对选择性不太强的体系，可采用梯度洗脱或逐次 洗脱的方法
生物分离工程 第8章 亲和色谱
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8.3 亲和色谱介质
O fte n n e e d sp a c e r a rm
S p acer arm
A C ver 990326 30
b u t w a tc h o u t fo r a d so r p tio n to th e sp a c e r !
生物分离工程 第8章 亲和色谱
生物亲和作用
生物物质，特别是酶和抗体等蛋白质，具有识别特定物质 并与该物质的分子相结合的能力。这种识别并结合的能力 具有排他性．即生物分子能够区分结构和性质非常相近的 其他分子，选择性地与其中某一种外子相结合。生物分子 间的这种持异件相互作用称为生物亲和作用