量子点在生物医学领域的应用

基金项目:吉林省科学技术厅资助项目(NO.20082123)*通讯作者

文章编号:1007-4287(2009)06-0847-03

量子点在生物医学领域的应用

王雅丽,张玉成,张桂珍*

(吉林大学中日联谊医院中心实验室,吉林长春130033)

生命科学的高速发展离不开新技术新方法的应用。近些年来,量子点在生物医学领域的应用已经成为人们广泛关注的研究热点之一,量子点在体内外成像,靶向标记特异组织和细胞等方面均取得了新的进展。相对于传统的荧光染料分子而言,量子点具有其独特的特性及优点。本文对近年来量子点在生物医学领域的诸多应用及进展做一综述。1 量子点基本组成结构及光学特性

1.1 量子点概念 量子点(Quantum Dots,QDs),也称半导体纳米晶(Nanocrystals,NCs),它是由 族元素或! ∀族元素组成的小于100nm 的半导体纳米微晶体,当这些半导体纳米微晶体的直径小于激子的波尔直径(<10nm)时,这些半导体纳米微晶体由于受到量子尺寸效应和介电限域效应的影响,从而表现出独特的光学特征[1-3]。

1.2 量子点的光学特性及优点 QDs 与传统的有机荧光染料相比,其光学特性有:

1.2.1 QDs 的激发光波长(e xcitation wave lengths)范围宽且连续分布,其荧光可以被波长小于其量子限域峰的任意光源所激发,而其发射波长(emission wa ve lengths)的范围窄且呈对称分布[4,5]

,可检测到的光谱范围内同时使用多个探针,而发射光谱不出现交叠。

1.2.2 QDs 的发光特征具有严格的量子尺寸效应,通过改变量子点粒径大小可获得从紫外到近红外范围内任意点的光谱[6],这样仅用一种波长的激发光源便可激发多种荧光,进行多元荧光检测。1.2.3 QDs 的抗光漂白能力强,光漂白作用是指由光激发引起发光物分解而导致的荧光强度降低的现象

[7]

。有机荧光染料的光漂白速率很快,而QDs 的

光漂白作用则远远小得多。

1.2.4 QDs 的荧光寿命长[8]

,典型的有机荧光染料的荧光寿命仅为几纳秒,这与很多生物样本的自发

荧光衰减的时间相当。而QDs 的荧光寿命可持续长达数十纳秒,这使得当光激发数纳秒以后,大多数自发荧光背景已经衰减,而QDs 荧光仍然存在,此时即可获得无背景干扰的荧光信号。2 量子点的修饰

直接制备的QDs 很难与生物大分子发生作用,所以制备好的QDs 需要对其表面进行修饰来提高它的光学特性以及它与生物大分子连接的能力。Nie 等[9]利用巯基乙酸修饰QDs,游离的羧基不仅使QDs 的水溶性增强,还可以与生物大分子结合。3 量子点与生物大分子偶联

生物分子通过与QDs 结合后才能用于生物医学,结合的方式主要有直接结合、共价偶联、静电吸附、间接偶联[10,11]。直接结合是指量子点表面基团和生物分子表面基团直接作用后将生物分子连接到量子点上的方式,这种连接方式难度较大,一般不易采用。共价偶联是利用量子点表面修饰的羧基,通过酶促交联剂EDC 的作用,与生物分子表面的氨基进行共价偶联,这种偶联方式得到的偶联复合物稳定,但偶联过程比较复杂。静电吸附是通过静电力进行偶联[12],通常先把一活性基团连在QDs 上,同时用另一活性基团修饰生物大分子,利用两活性基团的静电作用力即可将QDs 与目标分子结合,这种偶联方式得到的偶联复合物不是足够稳定,但偶联过程比较简单快捷。间接偶联是指通过其它亲和系统来将量子点与生物分子结合在一起的方法,常用的亲和系统包括生物素 链亲和素、生物素 卵白素[13,14]亲和系统,这些亲和系统能起到很好的桥梁作用,将生物分子连接到量子点上面。4 量子点在生物分析中的应用4.1 量子点在细胞成像中的应用

量子点已成功地应用于细胞的不同组分、蛋白以及亚细胞结构的标记,其基本原理是当量子点与特异性抗体交联后,量子点 抗体复合物就会与细胞内的不同细胞器或骨架系统结合,在受到光激发后发出特定波长的荧光。Wu 等[7]采用荧光免疫法,

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证明了QDs标记抗体能特异的识别亚细胞水平的分子靶点,他们用QDs标记的羊抗鼠I gG作为二抗,结合Her2抗体,观察到乳腺癌细胞表面的Her2抗原。同时也采用不同颜色的QDs与链亲和素连接,然后配合生物素标记的二抗和特异性单抗,在同一光源照射下,可观察到不同颜色极易区别的细胞表面的Her2和核抗原,也能同时识别胞浆微管蛋白,与有机荧光染料Alexa488相比,QDs发射的荧光较强且稳定性好。Sukhanova等[15,16]用QDs对乳腺癌细胞膜上的P 糖蛋白(P gp)进行了免疫荧光检测和三维共聚焦分析,P gp能过度表达于MCF7r乳腺癌细胞膜上,可以介导多药耐药性(multidrug resistance, MDR)表型的形成,可作为MCF7r细胞的特异性靶点,将抗P gp抗体作为一抗,QDs结合多价二抗与之结合进行荧光成像,这种结合具有很高的特异性,用不表达膜P gp的MCF7细胞作为对照时,发现无明显荧光信号。进一步的对照实验,将细胞不先与一抗结合而直接结合二抗,结果无明显荧光信号也充分证明这一点,通过该技术完成的乳腺癌细胞膜P gp三维重建的图像清楚显示了过度表达的P gp 在乳腺癌细胞膜上的分布情况,其效果远远优于FI TC、Alexa Fluor等其他荧光染料,这为乳腺癌的分子生物学研究提供了最直观的依据。现今,通过文献查到的标记过的组分包括:活体细胞中的核蛋白、线粒体、吞噬体、复合胺转换蛋白、前列腺特异性膜抗原、Her2蛋白、氨基乙酸受体、erbB/HER细胞传输膜受体和P2糖蛋白等;固定细胞中的微管蛋白、肌动蛋白丝、Mortalin(热休克蛋白70家族蛋白质)、细胞角蛋白、细胞膜蛋白与受体等[17,18]。上述这些细胞组分的标记对于研究疾病的产生和发展,以及诊断都具有十分重要的意义。

4.2 量子点在活体成像中的应用

量子点不仅可以用于体外细胞的标记,好多研究者对量子点在活体成像实验同样感兴趣。Gao 等[19]研制了一种多功能QDs探针,能够对动物活体内的肿瘤进行靶向并同时成像,这种探针包含一种两亲性三嵌段共聚物、特异性靶向配体和多个PEG 分子,两亲性三嵌段共聚物可用来保护QDs不发生聚集和具有足够的稳定性,特异性靶向配体用于与肿瘤抗原结合,而PEG分子则可以改善量子点的生物相容性和循环寿命。前列腺特异性膜抗原(prostatespecific me mbrane antigen,PSMA)是一种细胞表面标志物,存在于前列腺上皮细胞和新生的血管内皮细胞上,可以作为前列腺癌QDs成像的特异性靶点,该研究组运用结合PSMA抗体的QDs通过小鼠尾静脉注射来靶向能够表达PSMA的前列腺癌并成像,用无肿瘤的小鼠作为对照,发现结合了PSMA 抗体的量子点在肿瘤生长部位定位、积累并且发出很强的荧光信号,而对照组则无明显信号,进一步研究表明这种通过肿瘤特异性抗原#抗体结合的QDs 主动靶向比单纯的被动靶向要迅速、高效得多,在体内研究中,该小组用QDs成功实现了裸鼠前列腺癌模型的非损伤性成像,在活体模型中肉眼即可清晰观察到肿瘤的部位,这给前列腺癌的诊断和预后的研究开辟了一条新的思路。Kim等人[20]将量子点注射到小鼠的前肢皮下和猪的腹股沟皮下,通过术中显像系统能观察到量子点进入了淋巴系统,几分钟后量子点迁移到腋前线的位置,在相同位点再注入异硫蓝,则会出现荧光信号和蓝色染料共区域化的现象,而异硫蓝是组织学诊断前哨淋巴结公认的试剂,这就从侧面证明,荧光信号出现的位点也同样是前哨淋巴结的位点,这样,通过荧光显像系统就可以观察到前哨淋巴结的位置,为外科术中找到前哨淋巴结创造了便利的条件。

4.3 量子点在长效标记中的应用

基于量子点荧光寿命长这个优点,研究者可以利用量子点做长效标记。Jaiswal等[21]首先用二氢硫辛酸对QDs进行包裹修饰,然后通过内吞作用将QDs标记在Hela细胞的囊泡内,标记的QDs第12天仍稳定存在于细胞中;他们还通过QDs与生物素连接而成的QDs 生物素荧光探针,对表面生物素化的Hela细胞膜进行特异性标记,标记的QDs在活细胞内能连续承受激发光照射14小时而荧光强度不发生明显的减退,在12天后细胞内仍能检测到可见荧光。因此,QDs可以用来制备追踪标记分子,用于细胞生长过程中的动态研究。

4.4 量子点在信号转导机制研究中的应用

信号转导机制是近年来众多领域的研究热点之一,它是靶向治疗的基础。Lidke等[22]利用QDs探针成功实现了erbB/HER受体介导的信号转导途径的检测,他们首先证明QDs与EGF交联仍具有结合力且可通过细胞内吞作用能与erbB1受体主动结合,用QDs荧光示踪EGF与erbB1结合和信号转导的过程,直接实时动态观察到一个信号分子从细胞膜结合、通过细胞线状伪足、胞吞内化以及与erbB2、erbB3相互作用的全过程,证明了线状伪足存在一种新的逆向转运机制,而以前这些只能在固定细胞或通过生化分离的方法才能检测,可见量子点在实时动态

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#Chin J Lab Diagn,June,2009,Vol13,No.6