溶菌酶的提取纯化及纯度测定
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【实验部分】
1.1试剂与仪器
1.1.1试剂250mL烧杯、玻璃棒、小漏斗、定性快速滤纸、50mL量筒、50mL离心管、鸡蛋1只、0.02mo1/LPBS（pH7.0、pH8.0、）,l mLEp管, pH计,移液管1m1、冰醋酸、5mo1/L NaOH,滴管,离心管，样品S1、S2、S-2, CM一纤维素高子交换介质., 0.02mo1/LpH8.0的PBS, 0.6mo1/LNaC1,烧杯（50mL, 250mL）、桔草芽胞杆菌过夜培养物（37℃,18h,160r/min,100/250mL）、0.02mo1/L pH8.0的PBS（测活缓 冲液,含50mmo1/LNaC1）, 0.2mo1/LpH8.0的PBS。
【关键词】溶菌酶，等电点沉淀法，离子交换层析，酶活，提纯【引 言】 对溶菌酶的研究始于20世纪初,人们发现人的唾液、眼泪中存在有 溶解细菌细胞壁的酶,因其具有溶菌作用,故命名为溶菌酶。1937年Abraham和Robinson从卵蛋白中分离出溶菌酶晶体,揭开了研究溶菌酶的历史篇章。 它广泛 存在于鸟类、家禽的蛋清中和哺乳动物的泪液、唾液、血浆、乳汁、胎盘以及体 液、组织细胞内,其中在蛋清中含量最丰富(约0.13% )在一些植物体如卷心菜、 萝卜、无花果和微生物体内也存在溶菌酶,只是含量差异较大。
溶菌酶的提取纯化以及纯度鉴定实验者：钟吴宇豪 绿药1501班201530360127同组者：连学帆 韩家鑫 实验地点：东配302实验日期：2017年5月26日-5月27日 报告完成日期：2017年5月28日 指导老师：易 喻
【摘要】溶菌酶是一种具有水解细菌细胞壁能力的蛋白质，工业上通常 以蛋清为原料，在pH6.5条件下用弱酸性阳离子交换树脂732吸附后，再用硫酸铵洗脱，经透析后冷冻干燥得 到，在医学及食品商具有广泛应用。 本文中我们通过等电点沉淀法对溶菌酶进行粗提取， 然 后通过离子交换层析进一步除去杂蛋白， 提纯所得的溶菌酶粗品， 并且通过紫外分光光度计 检测溶液吸光度来对最后的产品进行纯度及产率鉴定， 确认得到了纯化倍数较高但产率较低 的溶菌酶产品。
菌酶属于冷杀菌,在杀菌防腐过程中不需加热,因而避免了高温杀菌对食品风味 的破坏作用,尤其对热敏感的物质更具有重要意义。 还可以添加到乳粉中,使牛乳 人乳化,以抑制肠道中腐败微生物的生存,同时直接或间接地促进肠道中双歧杆 菌的增殖。此外,还能利用溶菌酶生产酵母浸膏和核酸类调味品。在生物工程研 究上，随着生物科学的发展,溶菌酶已成为基因工程及酶工程中必不可少的工具 酶。在医疗中，溶菌酶对G+、枯草杆菌等有很好的杀灭作用,对大肠杆菌、普 通变球菌等G-也具有一定程度溶解。 此外,溶菌酶与抗菌素合用效果更佳,因而,溶菌酶广泛应用于医药行业,如利用溶菌酶治疗各种五官科炎症,尤其对急性炎 症如急性咽炎、急性喉炎、急性中耳炎等效果明显。溶菌酶在畜禽饲料中，由于 溶菌酶本身是一种天然蛋白质,无毒性,是一种安全性高的饲料酶,它能专一性的 作用于目的微生物的细胞壁,而不能作用于其它物质。该酶对革兰氏阳性菌、枯 草杆菌、耐辐射微球菌有很强分解作用。 为了从鸡蛋清中提取并提纯得到的溶菌酶， 我们分别采用了等电点沉淀法得到了 溶菌酶粗品， 然后通过离子交换层析提纯得到的样品， 最后测定了所制的溶菌酶 活性及蛋白质含量。
Lysozyme is a protein of bacterial cell wall hydrolysis ability, the industry usually with egg white as raw material, 732 exchange resin adsorption with weakly acidic cation under the condition of pH6.5, with ammonium sulfate was dialyzed after freeze drying, is widely used in medicine and food business. In this paper we by isoelectric point precipitation method for crude extraction of lysozyme, followed by ion exchange chromatography to remove impurity protein, lysozyme crude purified, and the measured absorbance of the purity and yield of the final product identification of UV spectrophotometry, confirmed the purification factor was high but low yield the lysozyme product.
溶菌酶(1ysozyme)又称胞壁质酶、N-乙酰胞壁质聚糖水解酶。它能水解细菌细 胞壁N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡葡糖之间的β-1,4糖苷键,破坏肽聚糖支架,低滲溶液中细胞在内部滲透压的作用 下胀裂开,引起细菌裂解。溶菌酶主要溶解 革兰氏阳性菌的细胞壁。
溶菌酶是一种无毒、无副作用的蛋白质,又具有溶菌作用,因此可用作食品防腐 剂。目前已广泛应用于水产品、肉食品、蛋糕、清酒、料酒及饮料中的防腐,溶
1.1.2仪器
分光光度计、揺床、高速离心 机，分部收集器,核酸蛋白质检测仪,记录仪,高速 离心机（可用50mL离心管）,冰箱,可见光分光光度计、揺床、烧杯、玻璃棒、漏 斗、滤纸等溶菌酶是一种葡萄糖苷酶,其化学性质稳定,干燥条件下在室温可长期保存而活 性不丧失。在自然界中广泛存在,其中以禽类蛋清中含量较高,鸡蛋中占蛋白总量 的3.5%,所以我们选择使用鸡蛋清来提取溶菌酶。鸡蛋清中溶菌酶 由18种129个気基酸残基组成的单肽链蛋白质,分子中含有4个二硫键,等电点为10.8,对 温度和酸 不敏感,在弱碱性条件下稳定。 鸡蛋清中含13%~15%的蛋自质,除溶菌酶 以外,还有其他的的蛋白质,其主要特点分别如下:
1.1试剂与仪器
1.1.1试剂250mL烧杯、玻璃棒、小漏斗、定性快速滤纸、50mL量筒、50mL离心管、鸡蛋1只、0.02mo1/LPBS（pH7.0、pH8.0、）,l mLEp管, pH计,移液管1m1、冰醋酸、5mo1/L NaOH,滴管,离心管，样品S1、S2、S-2, CM一纤维素高子交换介质., 0.02mo1/LpH8.0的PBS, 0.6mo1/LNaC1,烧杯（50mL, 250mL）、桔草芽胞杆菌过夜培养物（37℃,18h,160r/min,100/250mL）、0.02mo1/L pH8.0的PBS（测活缓 冲液,含50mmo1/LNaC1）, 0.2mo1/LpH8.0的PBS。
【关键词】溶菌酶，等电点沉淀法，离子交换层析，酶活，提纯【引 言】 对溶菌酶的研究始于20世纪初,人们发现人的唾液、眼泪中存在有 溶解细菌细胞壁的酶,因其具有溶菌作用,故命名为溶菌酶。1937年Abraham和Robinson从卵蛋白中分离出溶菌酶晶体,揭开了研究溶菌酶的历史篇章。 它广泛 存在于鸟类、家禽的蛋清中和哺乳动物的泪液、唾液、血浆、乳汁、胎盘以及体 液、组织细胞内,其中在蛋清中含量最丰富(约0.13% )在一些植物体如卷心菜、 萝卜、无花果和微生物体内也存在溶菌酶,只是含量差异较大。
溶菌酶的提取纯化以及纯度鉴定实验者：钟吴宇豪 绿药1501班201530360127同组者：连学帆 韩家鑫 实验地点：东配302实验日期：2017年5月26日-5月27日 报告完成日期：2017年5月28日 指导老师：易 喻
【摘要】溶菌酶是一种具有水解细菌细胞壁能力的蛋白质，工业上通常 以蛋清为原料，在pH6.5条件下用弱酸性阳离子交换树脂732吸附后，再用硫酸铵洗脱，经透析后冷冻干燥得 到，在医学及食品商具有广泛应用。 本文中我们通过等电点沉淀法对溶菌酶进行粗提取， 然 后通过离子交换层析进一步除去杂蛋白， 提纯所得的溶菌酶粗品， 并且通过紫外分光光度计 检测溶液吸光度来对最后的产品进行纯度及产率鉴定， 确认得到了纯化倍数较高但产率较低 的溶菌酶产品。
菌酶属于冷杀菌,在杀菌防腐过程中不需加热,因而避免了高温杀菌对食品风味 的破坏作用,尤其对热敏感的物质更具有重要意义。 还可以添加到乳粉中,使牛乳 人乳化,以抑制肠道中腐败微生物的生存,同时直接或间接地促进肠道中双歧杆 菌的增殖。此外,还能利用溶菌酶生产酵母浸膏和核酸类调味品。在生物工程研 究上，随着生物科学的发展,溶菌酶已成为基因工程及酶工程中必不可少的工具 酶。在医疗中，溶菌酶对G+、枯草杆菌等有很好的杀灭作用,对大肠杆菌、普 通变球菌等G-也具有一定程度溶解。 此外,溶菌酶与抗菌素合用效果更佳,因而,溶菌酶广泛应用于医药行业,如利用溶菌酶治疗各种五官科炎症,尤其对急性炎 症如急性咽炎、急性喉炎、急性中耳炎等效果明显。溶菌酶在畜禽饲料中，由于 溶菌酶本身是一种天然蛋白质,无毒性,是一种安全性高的饲料酶,它能专一性的 作用于目的微生物的细胞壁,而不能作用于其它物质。该酶对革兰氏阳性菌、枯 草杆菌、耐辐射微球菌有很强分解作用。 为了从鸡蛋清中提取并提纯得到的溶菌酶， 我们分别采用了等电点沉淀法得到了 溶菌酶粗品， 然后通过离子交换层析提纯得到的样品， 最后测定了所制的溶菌酶 活性及蛋白质含量。
Lysozyme is a protein of bacterial cell wall hydrolysis ability, the industry usually with egg white as raw material, 732 exchange resin adsorption with weakly acidic cation under the condition of pH6.5, with ammonium sulfate was dialyzed after freeze drying, is widely used in medicine and food business. In this paper we by isoelectric point precipitation method for crude extraction of lysozyme, followed by ion exchange chromatography to remove impurity protein, lysozyme crude purified, and the measured absorbance of the purity and yield of the final product identification of UV spectrophotometry, confirmed the purification factor was high but low yield the lysozyme product.
溶菌酶(1ysozyme)又称胞壁质酶、N-乙酰胞壁质聚糖水解酶。它能水解细菌细 胞壁N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡葡糖之间的β-1,4糖苷键,破坏肽聚糖支架,低滲溶液中细胞在内部滲透压的作用 下胀裂开,引起细菌裂解。溶菌酶主要溶解 革兰氏阳性菌的细胞壁。
溶菌酶是一种无毒、无副作用的蛋白质,又具有溶菌作用,因此可用作食品防腐 剂。目前已广泛应用于水产品、肉食品、蛋糕、清酒、料酒及饮料中的防腐,溶
1.1.2仪器
分光光度计、揺床、高速离心 机，分部收集器,核酸蛋白质检测仪,记录仪,高速 离心机（可用50mL离心管）,冰箱,可见光分光光度计、揺床、烧杯、玻璃棒、漏 斗、滤纸等溶菌酶是一种葡萄糖苷酶,其化学性质稳定,干燥条件下在室温可长期保存而活 性不丧失。在自然界中广泛存在,其中以禽类蛋清中含量较高,鸡蛋中占蛋白总量 的3.5%,所以我们选择使用鸡蛋清来提取溶菌酶。鸡蛋清中溶菌酶 由18种129个気基酸残基组成的单肽链蛋白质,分子中含有4个二硫键,等电点为10.8,对 温度和酸 不敏感,在弱碱性条件下稳定。 鸡蛋清中含13%~15%的蛋自质,除溶菌酶 以外,还有其他的的蛋白质,其主要特点分别如下: