流式细胞术的临床应用 PPT
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《流式细胞术》课件
抗体标记
利用特异性抗体与细胞表面抗原结合，将荧光染料标记在细胞上。
细胞分选的原理
流体动力学
通过调整液流速度和压力，控制细胞通过喷嘴的速度 。
静电场
在流动室中施加静电场，使带电的荧光微球和细胞偏 转至收集管中。
声波振荡
利用声波振荡器产生振动，使细胞在流动室中分散并 均匀分布。
数据分析与解读
数据获取
荧光染料干扰
荧光染料可能会产生交叉干扰或淬灭现象， 影响实验结果的准确性。
技术展望与未来发展
1 新技术应用
随着新技术的不断发展，如纳米技术、基因编辑等，流 式细胞术有望在检测灵敏度、特异性及多参数分析等方 面取得突破性进展。
2 人工智能辅助数据分析
随着新技术的不断发展，如纳米技术、基因编辑等，流 式细胞术有望在检测灵敏度、特异性及多参数分析等方 面取得突破性进展。
收集流式细胞仪产生的荧光信号和散射光信号 数据。
数据处理
利用软件对数据进行处理，包括去背景、校正 和归一化等操作。
结果解读
根据数据分析结果，解读细胞的表型、功能和活性等信息。
03
实验操作流程
样品制备
样品来源
流式细胞术的样品主要来自各类组织、血液 、培养细胞等。
样品处理
样品需要经过一系列的处理，如离心、洗涤 、细胞分离等，以去除杂质并获得纯净的细 胞样品。
3 个性化医疗应用
随着新技术的不断发展，如纳米技术、基因编辑等，流 式细胞术有望在检测灵敏度、特异性及多参数分析等方 面取得突破性进展。
4 拓展应用领域
随着新技术的不断发展，如纳米技术、基因编辑等，流 式细胞术有望在检测灵敏度、特异性及多参数分析等方 面取得突破性进展。
感谢您的观看
利用特异性抗体与细胞表面抗原结合，将荧光染料标记在细胞上。
细胞分选的原理
流体动力学
通过调整液流速度和压力，控制细胞通过喷嘴的速度 。
静电场
在流动室中施加静电场，使带电的荧光微球和细胞偏 转至收集管中。
声波振荡
利用声波振荡器产生振动，使细胞在流动室中分散并 均匀分布。
数据分析与解读
数据获取
荧光染料干扰
荧光染料可能会产生交叉干扰或淬灭现象， 影响实验结果的准确性。
技术展望与未来发展
1 新技术应用
随着新技术的不断发展，如纳米技术、基因编辑等，流 式细胞术有望在检测灵敏度、特异性及多参数分析等方 面取得突破性进展。
2 人工智能辅助数据分析
随着新技术的不断发展，如纳米技术、基因编辑等，流 式细胞术有望在检测灵敏度、特异性及多参数分析等方 面取得突破性进展。
收集流式细胞仪产生的荧光信号和散射光信号 数据。
数据处理
利用软件对数据进行处理，包括去背景、校正 和归一化等操作。
结果解读
根据数据分析结果，解读细胞的表型、功能和活性等信息。
03
实验操作流程
样品制备
样品来源
流式细胞术的样品主要来自各类组织、血液 、培养细胞等。
样品处理
样品需要经过一系列的处理，如离心、洗涤 、细胞分离等，以去除杂质并获得纯净的细 胞样品。
3 个性化医疗应用
随着新技术的不断发展，如纳米技术、基因编辑等，流 式细胞术有望在检测灵敏度、特异性及多参数分析等方 面取得突破性进展。
4 拓展应用领域
随着新技术的不断发展，如纳米技术、基因编辑等，流 式细胞术有望在检测灵敏度、特异性及多参数分析等方 面取得突破性进展。
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临床医学技术培训PPT流式细胞术技术(1)
收集数据，进行定量和定性分 析。
流式细胞术的检测原理
细胞染色
使用荧光染料标记细胞 表面的抗原或内部的分
子。
细胞悬浮
将细胞悬浮在液流中， 通过喷嘴引入检测区域
。
激光照射
激光束照射细胞，激发 荧光染料发出荧光。
信号检测
检测器收集荧光和散射 光信号，转化为电信号
。
荧光染料的种类与选择
荧光染料种类
有异硫氰酸荧光素(FITC)、藻红蛋白 (PE)、罗丹明(Rhodamine)等。
疫苗研发
用于监测疫苗接种后免疫 细胞的反应和变化，评估 疫苗的有效性和安全性。
流式细胞术的发展历程
19世纪末期
流式细胞术的初步设想诞生。
20世纪60年代
第一代流式细胞仪问世，可以进行简单的 细胞计数和大小测量。
20世纪80年代
21世纪初
第二代流式细胞仪出现，引入荧光染色和 多参数检测技术，提高了检测的灵敏度和 特异性。
特点
具有高速度、高精度和高通量等 优点，能够同时检测多个细胞参 数，广泛应用于临床医学、生物 学和生物医学研究中。
流式细胞术的应用领域
01
02
03
临床诊断
用于检测血液系统疾病、 免疫系统疾病和肿瘤等， 如白血病、淋巴瘤和实体 瘤的分类和分型。
生物研究
用于研究细胞生长、分化 、凋亡和免疫应答等生物 学过程，以及药物筛选和 基因表达分析等。
荧光染料选择
根据抗原特异性和实验需求选择合适 的荧光染料，确保特异性标记和最佳 信号强度。
03
流式细胞术实验技术
样本的制备与保存
01
02
03
04
血液样本
采集静脉血液，使用抗凝剂， 避免溶血和细菌污染。
流式细胞术的检测原理
细胞染色
使用荧光染料标记细胞 表面的抗原或内部的分
子。
细胞悬浮
将细胞悬浮在液流中， 通过喷嘴引入检测区域
。
激光照射
激光束照射细胞，激发 荧光染料发出荧光。
信号检测
检测器收集荧光和散射 光信号，转化为电信号
。
荧光染料的种类与选择
荧光染料种类
有异硫氰酸荧光素(FITC)、藻红蛋白 (PE)、罗丹明(Rhodamine)等。
疫苗研发
用于监测疫苗接种后免疫 细胞的反应和变化，评估 疫苗的有效性和安全性。
流式细胞术的发展历程
19世纪末期
流式细胞术的初步设想诞生。
20世纪60年代
第一代流式细胞仪问世，可以进行简单的 细胞计数和大小测量。
20世纪80年代
21世纪初
第二代流式细胞仪出现，引入荧光染色和 多参数检测技术，提高了检测的灵敏度和 特异性。
特点
具有高速度、高精度和高通量等 优点，能够同时检测多个细胞参 数，广泛应用于临床医学、生物 学和生物医学研究中。
流式细胞术的应用领域
01
02
03
临床诊断
用于检测血液系统疾病、 免疫系统疾病和肿瘤等， 如白血病、淋巴瘤和实体 瘤的分类和分型。
生物研究
用于研究细胞生长、分化 、凋亡和免疫应答等生物 学过程，以及药物筛选和 基因表达分析等。
荧光染料选择
根据抗原特异性和实验需求选择合适 的荧光染料，确保特异性标记和最佳 信号强度。
03
流式细胞术实验技术
样本的制备与保存
01
02
03
04
血液样本
采集静脉血液，使用抗凝剂， 避免溶血和细菌污染。
《流式细胞术贝克曼》课件
贝克曼流式细胞仪的应用
免疫学研究
贝克曼流式细胞仪在免疫学研究 中广泛应用，可以用于检测免疫 细胞的表面标志物、功能活性以
及免疫细胞的分选和培养等。
血液学研究
贝克曼流式细胞仪可以用于血液 学研究，检测血细胞的表面标志 物、血型抗原等，以及进行血细
胞的分选和培养等。
肿瘤研究
贝克曼流式细胞仪可以用于肿瘤 研究，检测肿瘤细胞的表面标志 物、肿瘤抗原等，以及进行肿瘤
辐射安全
废弃物处理
正确操作仪器，避免对实验人员造成辐射 伤害。
按照规定处理实验废弃物，确保实验室环 境的安全和环保。
贝克曼流式细胞仪的特点
高通量
贝克曼流式细胞仪具有高通量的 特点，能够在短时间内处理大量 细胞样本，提高了实验效率和检
测速度。
高灵敏度
贝克曼流式细胞仪采用先进的光电 检测技术，能够检测到微弱的荧光 信号，具有高灵敏度，能够检测到 低浓度的细胞标记物。
多参数分析
贝克曼流式细胞仪可以同时检测多 个参数，包括细胞大小、颗粒性、 荧光信号等，从而对细胞进行多维 度的分析和分选。
贝克曼流式细胞仪的原理
流式细胞术原理
流式细胞术是一种在液流中快速检测和分选细胞的技术。通 过将单个细胞与荧光染料结合，利用激光束激发荧光，并通 过光电倍增管检测荧光信号，实现对细胞的快速分析和分选 。
贝克曼流式细胞仪的原理
贝克曼流式细胞仪是应用流式细胞术的仪器之一，其原理是 将待测细胞与荧光染料结合后，通过高压液流将细胞送入流 动室，在流动室内与激光束相遇，激发荧光信号，并通过光 电倍增管进行检测和记录。
用于检测精子细胞和卵 子细胞的活性与质量。
流式细胞术的发展历程
20世纪70年代
流式细胞术简介及应用进展课件
流式细胞术简介及应用进展
15
▪高速度：分析细胞数：1000个/s→60000个/s ▪高灵敏度：荧光分子数/细胞：3000→100个FITC； ▪高准确度：区分两个细胞：参数：相差5% →1%； ▪高精度：CV值：7% →< 1%; ▪多参数：荧光：1个 →12个参数； ▪高纯度：分选细胞：80-90% →99.9%; ▪其 它：荧光信号：线性检测→对数检测
电子程序化单细胞分选仪——Electronically programmable individual cell sorter, EPICS (Coulter公司）
流式细胞术简介及应用进展
5
BD FACSCalibur型 FCM （单L，3F）
流式细胞术简介及应用进展
6
Coulter EPICS XL/XL-MCL （单L，4F）
流式细胞术简介及应用进展
11
BD FACSAria
BD FACSCount
CD3\4\8 专为HIV监测设计的经济普及型流式细胞仪
流式细胞术简介及应用进展
12
BD FACSCanto 2L 6C
流式细胞术简介及应用进展
13
BD FACS Calibur 1L 4C
流式细胞术简介及应用进展
14
三、流式细胞术应用的新进展
流式细胞术简介及应用进展
17
2、cytometric bead array (CBA)
微球流式芯片技术(CBA)是一种微球多参数检测分析技 术，它用一系列的微球组合来捕获并结合流式细胞术检 测溶液中被检测物质的量，其采用夹心法分析策略。用 已知的标准品和对照标准曲线就可得出被测样品的浓度。 这种检测方法，既不受样品量的限制，也可同时检测多 项指标参数；客观、省时、人为因素影响小。
流式细胞术原理及应用通用课件
抗菌药物敏感性测试
通过流式细胞术可以检测细菌对抗菌药物的敏感性，为临床合理用 药提供科学依据。
05 流式细胞术的数 据分析与解读
数据文件类型与读取方式
FCS文件
流式细胞术数据文件常用FCS格式，可以使用专业软件（如FlowJo、Cytobank 等）或编程语言（如R、Python等）读取和处理。
快速检测。
多参数分析：可同时检测细胞 的多个参数，如大小、形态、
内部结构、表面抗原等。
灵活性：可根据研究需求灵活 调整检测参数和实验方案。
流式细胞术的应用范围
01
02
03
04
05
基础医学研究
临床医学诊断
用于细胞生物学、免疫学、 辅助临床疾病的诊断、病
遗传学等领域的基础研究， 情评估和疗效观察，如白
历史发展
起源：流式细胞术起源于20世纪60年代，当时为了满足生物医学研 究中对细胞快速、准确分析的需求。
技术发展：随着激光技术、计算机科学和生物学的不断进步，流式细 胞术逐渐发展成为一项高精度、高通量的细胞分析技术。
技术原理与特点
技术原理
液态样本流动：将细胞悬浮于液体中，形成细胞悬液，通过微管道连续流动。
数据读取方式
数据读取方式分为文件导入和实时获取两种。文件导入方式是将存储在硬盘中的 FCS文件导入到分析软件中，而实时获取方式则是通过流式细胞仪与电脑连接， 直接将数据获取到分析软件中。
数据预处理与质量控制
数据清洗
去除噪声、杂质和不必要的信号，以减少分析时的干扰和误差。
补偿调 整
对于多色荧光染色，需要进行荧光补偿调整，以消除荧光染料间的 交叉干扰。
多模态流式细胞术
多模态流式细胞术允许在单个平台上整合多种检测技术，如荧光共振能量转移 （FRET）、质量细胞术等，从而提供更丰富的细胞信息。
通过流式细胞术可以检测细菌对抗菌药物的敏感性，为临床合理用 药提供科学依据。
05 流式细胞术的数 据分析与解读
数据文件类型与读取方式
FCS文件
流式细胞术数据文件常用FCS格式，可以使用专业软件（如FlowJo、Cytobank 等）或编程语言（如R、Python等）读取和处理。
快速检测。
多参数分析：可同时检测细胞 的多个参数，如大小、形态、
内部结构、表面抗原等。
灵活性：可根据研究需求灵活 调整检测参数和实验方案。
流式细胞术的应用范围
01
02
03
04
05
基础医学研究
临床医学诊断
用于细胞生物学、免疫学、 辅助临床疾病的诊断、病
遗传学等领域的基础研究， 情评估和疗效观察，如白
历史发展
起源：流式细胞术起源于20世纪60年代，当时为了满足生物医学研 究中对细胞快速、准确分析的需求。
技术发展：随着激光技术、计算机科学和生物学的不断进步，流式细 胞术逐渐发展成为一项高精度、高通量的细胞分析技术。
技术原理与特点
技术原理
液态样本流动：将细胞悬浮于液体中，形成细胞悬液，通过微管道连续流动。
数据读取方式
数据读取方式分为文件导入和实时获取两种。文件导入方式是将存储在硬盘中的 FCS文件导入到分析软件中，而实时获取方式则是通过流式细胞仪与电脑连接， 直接将数据获取到分析软件中。
数据预处理与质量控制
数据清洗
去除噪声、杂质和不必要的信号，以减少分析时的干扰和误差。
补偿调 整
对于多色荧光染色，需要进行荧光补偿调整，以消除荧光染料间的 交叉干扰。
多模态流式细胞术
多模态流式细胞术允许在单个平台上整合多种检测技术，如荧光共振能量转移 （FRET）、质量细胞术等，从而提供更丰富的细胞信息。
流式细胞术在肿瘤学中的应用ppt课件
骨髓DC : CD14 CD16/ CD85K（ILT3） /CD33
ILT3-PE ILT3-PE CD14+CD16-FITC CD123-PC5 CD123-PC5 外周血DC: CD14 CD16/ CD85K （ILT3） /CD123
生物免疫治疗
CIK细胞(cytokine-induced killer)是一群以 01 CD3+T细胞为主的异质性细胞群体，包括
• 阳性表达抗原设门 • CD85k (ILT3) 阳性设门 • 仅在单核巨噬细胞及DC细胞表达 • 比HLADR表达更具特异性 • 避免阴性设门 • Differentiation of DC subsets: • 外周血DC: CD123+ (IL3Ra) • 骨髓DC: CD33+
ILT3-PE ILT3-PE CD14+CD16-FITC CD33-PC5 CD33-PC5
HIV Apoptosis Immune function Cell signaling Organ transplantation Stem cell Autoimmune Cell adhesion Cell viability Intracellular receptors Intracellular signal transduction Dendritic cells Leukemia Lymphoma Quantitative cell fluorescence
是否达到培养要求、 调节细胞数
培养是否达标、回输 时机
疗效评价、监测、下 次治疗的时机
CIK治疗前患者的免疫功能评价
评价的项目
免疫功能六项：CD3、CD4、CD8、CD4/CD8、 NK、 CIK
ILT3-PE ILT3-PE CD14+CD16-FITC CD123-PC5 CD123-PC5 外周血DC: CD14 CD16/ CD85K （ILT3） /CD123
生物免疫治疗
CIK细胞(cytokine-induced killer)是一群以 01 CD3+T细胞为主的异质性细胞群体，包括
• 阳性表达抗原设门 • CD85k (ILT3) 阳性设门 • 仅在单核巨噬细胞及DC细胞表达 • 比HLADR表达更具特异性 • 避免阴性设门 • Differentiation of DC subsets: • 外周血DC: CD123+ (IL3Ra) • 骨髓DC: CD33+
ILT3-PE ILT3-PE CD14+CD16-FITC CD33-PC5 CD33-PC5
HIV Apoptosis Immune function Cell signaling Organ transplantation Stem cell Autoimmune Cell adhesion Cell viability Intracellular receptors Intracellular signal transduction Dendritic cells Leukemia Lymphoma Quantitative cell fluorescence
是否达到培养要求、 调节细胞数
培养是否达标、回输 时机
疗效评价、监测、下 次治疗的时机
CIK治疗前患者的免疫功能评价
评价的项目
免疫功能六项：CD3、CD4、CD8、CD4/CD8、 NK、 CIK
流式细胞术原理及应用新课件PPT全
流式细胞术是20世纪70年代发展起来的一种技术，有人将流式细胞仪比喻成高级的荧光显微镜。 HLA-B27: 强直性脊柱炎 细胞功能检测：细胞周期、凋亡
Flow Sorting 直方图适用于：单参数分析
SORTING（细胞分选） CD16+56 NK细胞 可利用FCM进行细胞周期分析，适当选择周期特异性药物或非周期特异性药物。
巨血小板
• 细胞凋亡与坏死的区别 一般只测一个参数、不能分选
5、DNA含量分析法（晚晚期）
2F时LO必W需C停Y用TO免M疫E抑TR制Y剂。虽然凋亡与坏死的最终结果极为相似，但
凋亡检测
每一步都有检测它试剂盒们的过程与表现却有很大差别。
光路调节系统固定，自动化程度高，操作简便，易学易掌握,适合
坏死（necrosis）：坏死是细胞受到强烈理 流式细胞分析在人类基因组计划中发挥了重要作用，流式细胞技术的应用也适用于植物，目前这个技术应用范围包括流式核型分析，
目前，该技术以广泛用于生物及医 学基础研究与临床检测，在分子生物学、 免疫学、遗传学、血液学、肿瘤学等领 域内发挥着重要作用。
流式细胞仪
荧光显微镜
Flow Cytometry
控制 一般只测一个参数、不能分选
电脑
人脑
其细胞及组织的变化与坏死有明显的不同。
可利用FCM进行细胞周期分析，适当选择周期特异性药物或非周期特异性药物。
• 空白对照：ALL 应用领域将不断开拓，成为科研与临床不可或缺的重要工具。
随着白细胞分化抗原意义的确认以及单克隆抗体技术的发展，随着人们创新意识的加强，结合计算机技术和其他技术，流式细胞仪的 应用领域将不断开拓，成为科研与临床不可或缺的重要工具。 坏死（necrosis）：坏死是细胞受到强烈理化或生物因素作用引起细胞无序变化的死亡过程。
流式细胞术在临床血液学ppt课件
*
*
*
AML-M4/M5
两型表型相似，但M4较M5表达更多的CD34（＋），CD45-SSC图上，不成熟细胞出现在单核区，重要的表型为CD13、CD33、HLA-DR、CD14和CD15，CD33可表达强于CD13。
*
*
*
AML-M6
特征不明显，HLA-DR，CD34、CD13、CD33、CD19、CD22、CD5、CD7等均阴性，CD45－SSC图显示主要为CD45阴性区域为红系成份，高表达CD71。
*
*
AML-M2
M2与M1的主要区别是成熟度增加，原始细胞减少，CD15表达较M1显著，CD34弱于M1。 CD45-SSC图显示从髓系blast区至成熟骨髓细胞区的连续细胞带，CD45－SSC图有助于确定blasts比例。
*
*
AML-M3
高颗粒性，表现为较高的SSC，多数情况HLA-DR阴性或表达很少，CD34少于M2、一般CD13弱于CD33，大多表达CD117。 M3v低颗粒性，表现为较低的SSC。
CD80 CD86
CD80、CD86表达率（%）
*
对照组B淋巴细胞MHC-Ⅰ与MHC-Ⅱ表达
*
CpG2006诱导B淋巴细胞MHC-Ⅰ与MHC-Ⅱ表达
*
CpG2216诱导B淋巴细胞MHC-Ⅰ与MHC-Ⅱ表达
*
CpG诱导B淋巴细胞MHC分子表达
MHC-Ⅰ MHC-Ⅱ
*
流式细胞仪基本工作原理
光路系统 液路系统 电路系统
*
流式细胞仪光路图
*
外周血FSC-SSC点图
*
荧光信号（FL1、FL2、FL3）
*
滤光片
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CD8-CD28+
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AML-M4/M5
两型表型相似，但M4较M5表达更多的CD34（＋），CD45-SSC图上，不成熟细胞出现在单核区，重要的表型为CD13、CD33、HLA-DR、CD14和CD15，CD33可表达强于CD13。
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AML-M6
特征不明显，HLA-DR，CD34、CD13、CD33、CD19、CD22、CD5、CD7等均阴性，CD45－SSC图显示主要为CD45阴性区域为红系成份，高表达CD71。
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AML-M2
M2与M1的主要区别是成熟度增加，原始细胞减少，CD15表达较M1显著，CD34弱于M1。 CD45-SSC图显示从髓系blast区至成熟骨髓细胞区的连续细胞带，CD45－SSC图有助于确定blasts比例。
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AML-M3
高颗粒性，表现为较高的SSC，多数情况HLA-DR阴性或表达很少，CD34少于M2、一般CD13弱于CD33，大多表达CD117。 M3v低颗粒性，表现为较低的SSC。
CD80 CD86
CD80、CD86表达率（%）
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对照组B淋巴细胞MHC-Ⅰ与MHC-Ⅱ表达
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CpG2006诱导B淋巴细胞MHC-Ⅰ与MHC-Ⅱ表达
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CpG2216诱导B淋巴细胞MHC-Ⅰ与MHC-Ⅱ表达
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CpG诱导B淋巴细胞MHC分子表达
MHC-Ⅰ MHC-Ⅱ
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流式细胞仪基本工作原理
光路系统 液路系统 电路系统
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流式细胞仪光路图
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外周血FSC-SSC点图
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荧光信号（FL1、FL2、FL3）
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滤光片
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CD8-CD28+
流式细胞术的临床应用ppt课件
实验诊断科 分子诊断组
数据分析
设门（gating）：
根据某些特性将分析细胞群
圈起来。
淋巴细胞：FSC/SSC CD45++/SSCdim T淋巴细胞：CD3+/SSCdim
实验诊断科 分子诊断组
数据分析
直方图
单参数分析
横坐标：信号强度
纵坐标：细胞数量
实验诊断科 分子诊断组
数据分析
散点图
双参数分析 横、纵坐标代表的均是信号强度 UL: cd3-cd4+ LL: cd3-cd4UR: cd3+cd4+ LR: cd3+cd4-
实验诊断科 分子诊断组
标本染色的一般方法
FCM的临床应用
已开展的临床项目 其他临床应用
实验诊断科 分子诊断组
标本染色的一般方法
标本来源：
外周血、骨髓、组织块、培养细胞、脑脊 液、胸腹水、肺泡灌洗液(BALF)及其脱落细 胞。 血清和各类体液样本（可溶性蛋白）
实验诊断科 分子诊断组
前期处理
CSF、BALF、胸腹 水等：
结合淋巴细胞绝对数来看待百分比的改变
AIDS
实验诊断科 分子诊断组
已开展的项目
HLA-B27
试剂：BD HLA-B27 Kit 标本：外周血 检测指标： T (CD3+)淋巴细胞上HLA-B27 定性检测
实验诊断科 分子诊断组
实验诊断科 分子诊断组
HLA-B27
临床意义：强直性脊柱炎（高度相关） 遗传性关节炎
数量的检测 采集时机的确定
某些肿瘤
实验诊断科 分子诊断组
已开展的项目
白血病和淋巴瘤（L&L）免疫分型
流式细胞术在肿瘤学中的应用ppt课件
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2、石蜡包埋组织：扩大了FCM分析应用范围，并可以对大量临床随访病例资料进行重新研究与利用。标体制备：①二甲苯脱蜡法②组织清洁剂脱蜡法③甲酸双氧水处理法。 注意事项：①脱蜡完全：检验方法 加入100%乙醇，如果无絮状物浮起，即可视为脱净，反之则没有脱净。②掌握消化时间，避免细胞核消化掉。③切片薄厚适宜，过薄碎片大多，过厚不宜脱蜡。
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流式细胞周期与DNA倍体分析的基本原理
通过DNA检测进行细胞周期分析 细胞周期：G0、G1、S、G2 、M 细胞周期中DNA含量：G0/G1--2C（二倍体） S期--2C→ 4C、G2/M-4C（四倍体）
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DNA荧光染料特异性与细胞DNA结合 DNA含量的多少与荧光染料的结合量成正比，荧光强度与DNA所吸收荧光分子多少成正比。 最常用的荧光染料：碘化丙啶（PI）
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以二倍体参考细胞G0/G1期细胞DNA含量定为2C值DI=1.0，基于标准二倍体细胞的CV在5%以下，判定标准即；DNA二倍体=2C+2CV，DNA异倍体不等于2C+2CV。 1. DI = 1.0 ± 0.1 (0.9~1.10) 为二倍体。 2. DI = 1.0 ± 0.15 (0.85~1.15) 为近二倍体。 3. DI = 2.0 ± 0.1 (1.90~2.10) 为四倍体。 4. DI > 2.10为多倍体 5. 其余DI均为异倍体。
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由于各种实体组织成份、特性各不相同，对不同的实体组织必须采用不同的单细胞分散方法，才能使单细胞产量高，细胞损伤小。
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新鲜组织单细胞悬液制备注意事项： ①手术或活检的新鲜组织及时浸泡于生理盐水。 ②立即送检 ③冷冻或冷藏。（室温过高，放置时间过长而造成组织自溶发生，影响检测结果）
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2、石蜡包埋组织：扩大了FCM分析应用范围，并可以对大量临床随访病例资料进行重新研究与利用。标体制备：①二甲苯脱蜡法②组织清洁剂脱蜡法③甲酸双氧水处理法。 注意事项：①脱蜡完全：检验方法 加入100%乙醇，如果无絮状物浮起，即可视为脱净，反之则没有脱净。②掌握消化时间，避免细胞核消化掉。③切片薄厚适宜，过薄碎片大多，过厚不宜脱蜡。
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流式细胞周期与DNA倍体分析的基本原理
通过DNA检测进行细胞周期分析 细胞周期：G0、G1、S、G2 、M 细胞周期中DNA含量：G0/G1--2C（二倍体） S期--2C→ 4C、G2/M-4C（四倍体）
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DNA荧光染料特异性与细胞DNA结合 DNA含量的多少与荧光染料的结合量成正比，荧光强度与DNA所吸收荧光分子多少成正比。 最常用的荧光染料：碘化丙啶（PI）
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以二倍体参考细胞G0/G1期细胞DNA含量定为2C值DI=1.0，基于标准二倍体细胞的CV在5%以下，判定标准即；DNA二倍体=2C+2CV，DNA异倍体不等于2C+2CV。 1. DI = 1.0 ± 0.1 (0.9~1.10) 为二倍体。 2. DI = 1.0 ± 0.15 (0.85~1.15) 为近二倍体。 3. DI = 2.0 ± 0.1 (1.90~2.10) 为四倍体。 4. DI > 2.10为多倍体 5. 其余DI均为异倍体。
*
由于各种实体组织成份、特性各不相同，对不同的实体组织必须采用不同的单细胞分散方法，才能使单细胞产量高，细胞损伤小。
*
新鲜组织单细胞悬液制备注意事项： ①手术或活检的新鲜组织及时浸泡于生理盐水。 ②立即送检 ③冷冻或冷藏。（室温过高，放置时间过长而造成组织自溶发生，影响检测结果）
流式细胞术原理及临床应用-PPT文档
FCM检测白血病微小残留病变(MRD):
MRD 是 白 血 病 复 发 的 主 要 根 源 ， FCM 的 高 特 异性和敏感性可以在患者缓解期检测是否有残 留病变细胞，早期探测MRD，以免复发
FCM在临床肿瘤学中的应用
1.血液标本的检查 ● 肿瘤患者的免疫功能检查 ● 肿瘤患者的粘附分子检查：在肿瘤的浸润与转
细胞凋亡的生物学意义
胚胎形成、肌体正常发 育、衰老和损伤细胞的清 除以及肿瘤的发生、发展 和转归等都与细胞凋亡有 关。
生物医学的研究热点
FCM在血栓性疾与止血中应用
由于活化血小板是血栓的主要
成分之一，血小板活化程度的增 高与疾病的发生发展有关。 利用 流式细胞仪可检测血小板活化指 标，了解血小板状态和活化进程 。 巨血小板 血小板无力症 网织血 小板
肿瘤细胞耐药性
MDR是由多药耐药基因编码的P糖蛋白（P-gp） 亲脂化合物，包括多种抗癌药物和荧光染料的跨膜性 排出泵。当淋巴细胞出现MDR阳性细胞时，患者对 化疗药物开始出现耐
细胞凋亡是由基因控制的细胞自主的有序 的死亡。它涉及一系列基因的激活、表达以及调 控等的作用；是为更好地适应生存环境而主动争 取的一种死亡过程。 坏死（necrosis）：坏死是细胞受到强烈理化或 生物因素作用引起细胞无序变化的死亡过程。表 现为细胞胀大，胞膜破裂，细胞内容物外溢，核 变化较慢，DNA 降解不充分，引起局部严重的 炎症反应
可用流式细胞仪分析的标本
外周血、骨髓、癌组织、癌旁组织、各种体液 （尿、脑脊液、胸腹水、肺泡灌洗液等）
单细胞生物、特殊处理的植物细胞、某些非细胞 粒子、可溶性分子
流式细胞仪的基本功能
•细胞表型分析：包括细胞膜、胞浆内蛋白表达及核膜成份分析 •DNA含量及细胞周期分析、细胞凋亡检测 •目标细胞分选 •自身免疫性疾病相关HLA抗原分析、自身抗体的检测 •流式蛋白定量技术：血浆中各种细胞因子的含量
流式细胞术的原理及应用ppt课件
➢可把感兴趣细胞分 选到特定培养孔或板 上（4路和24孔板）
➢适用于高速分选和 多色分析
6
在整堂课的教学中，刘教师总是让学 生带着 问题来 学习， 而问题 的设置 具有一 定的梯 度，由 浅入深 ，所提 出的问 题也很 明确
流式细胞仪检测范围
细胞大小
细胞粒度
细 细胞表面面积
胞 结
核浆比例
构 DNA含量与细胞周期
18
在整堂课的教学中，刘教师总是让学 生带着 问题来 学习， 而问题 的设置 具有一 定的梯 度，由 浅入深 ，所提 出的问 题也很 明确
散射光
它反应细胞的物理特性,根据前侧向散射光，可以把不同 类型的细胞群加以区分
FSC（小角散射光)它反 应细胞的相对大小和截 面积的大小
SSC (90度角散射光)代 表细胞的颗粒度和精细 结构的变化
1.液流系统： 细胞悬液被吸入检测室后，在鞘液
(sheath)的约束下，通过喷嘴，使其形成单细 胞悬液。
10
在整堂课的教学中，刘教师总是让学 生带着 问题来 学习， 而问题 的设置 具有一 定的梯 度，由 浅入深 ，所提 出的问 题也很 明确
2.光学系统： 激光是较常用的光源, 稳定性好、单色性好。 散射光和荧光信号被收集、处理转化为数字信号。
FACS Vantage DiVa
科研型（大型机）
特点： ➢多数字化 ➢适用于各类细胞分选 ➢4路分选
5
在整堂课的教学中，刘教师总是让学 生带着 问题来 学习， 而问题 的设置 具有一 定的梯 度，由 浅入深 ，所提 出的问 题也很 明确
FACSAria
科研型
特点： ➢分辨率高
➢选配多种波长和类 型激光器
成,将产生的光信号引导至检测器
➢适用于高速分选和 多色分析
6
在整堂课的教学中，刘教师总是让学 生带着 问题来 学习， 而问题 的设置 具有一 定的梯 度，由 浅入深 ，所提 出的问 题也很 明确
流式细胞仪检测范围
细胞大小
细胞粒度
细 细胞表面面积
胞 结
核浆比例
构 DNA含量与细胞周期
18
在整堂课的教学中，刘教师总是让学 生带着 问题来 学习， 而问题 的设置 具有一 定的梯 度，由 浅入深 ，所提 出的问 题也很 明确
散射光
它反应细胞的物理特性,根据前侧向散射光，可以把不同 类型的细胞群加以区分
FSC（小角散射光)它反 应细胞的相对大小和截 面积的大小
SSC (90度角散射光)代 表细胞的颗粒度和精细 结构的变化
1.液流系统： 细胞悬液被吸入检测室后，在鞘液
(sheath)的约束下，通过喷嘴，使其形成单细 胞悬液。
10
在整堂课的教学中，刘教师总是让学 生带着 问题来 学习， 而问题 的设置 具有一 定的梯 度，由 浅入深 ，所提 出的问 题也很 明确
2.光学系统： 激光是较常用的光源, 稳定性好、单色性好。 散射光和荧光信号被收集、处理转化为数字信号。
FACS Vantage DiVa
科研型（大型机）
特点： ➢多数字化 ➢适用于各类细胞分选 ➢4路分选
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在整堂课的教学中，刘教师总是让学 生带着 问题来 学习， 而问题 的设置 具有一 定的梯 度，由 浅入深 ，所提 出的问 题也很 明确
FACSAria
科研型
特点： ➢分辨率高
➢选配多种波长和类 型激光器
成,将产生的光信号引导至检测器
流式细胞术及其临床应用课件(1)
光源与光学系统
➢ 激发光源 ➢ 光学系统
信号收集与光电转 换系统
计算机与分析系统
细胞分选与浓缩系统
激发光源 滤光片
流动室、鞘 液和样本流
信号检测器
计算机分析
（二）激光光源与光学系统
（一）激发光源 ：激光器
气体激光器：氩离子(488nm、355nm)、氦氖(633nm)、氪离子 (647nm)、氪氩(568nm)；
（四）计算机和分析系统
十字门
线性门
流式细胞仪特点
流式细胞术的最大特点是能在保持细胞及细胞器或微 粒的结构及功能不被破坏的状态下，通过荧光探针的 协助，从分子水平上获得多种信号对细胞进行定量分 析或纯化分选
细胞不被破坏，测量快速、大量、准确、灵敏、定量
目前国内主要流式细胞仪厂家 Beckton Dickinson(BD) BACKMAN COULTER
淋巴细胞亚群分析
试剂：BD Multitest IMK Kit 标本：外周血（常用） 配色：CD3-FITC/CD8-PE/CD45-PerCP/CD4-APC
（三）荧光信号
目前常用FCM配置（BD Calibar） 488nm激光管常用染料有 第一通道（FL1）：FITC (Fluorescein Isothiocyanate) 第二通道（FL2）：PE (Phycorey- thrin) 第三通道（FL3）：PerCP (Peridinin Chlorophyll Protein) PE-Cy7、PE-Cy5、 PerCP-Cy5.5 633nm激光管常用染料有
1
10
2 700
3 720
4
15
……
Counts
0…………101…………102…………103
➢ 激发光源 ➢ 光学系统
信号收集与光电转 换系统
计算机与分析系统
细胞分选与浓缩系统
激发光源 滤光片
流动室、鞘 液和样本流
信号检测器
计算机分析
（二）激光光源与光学系统
（一）激发光源 ：激光器
气体激光器：氩离子(488nm、355nm)、氦氖(633nm)、氪离子 (647nm)、氪氩(568nm)；
（四）计算机和分析系统
十字门
线性门
流式细胞仪特点
流式细胞术的最大特点是能在保持细胞及细胞器或微 粒的结构及功能不被破坏的状态下，通过荧光探针的 协助，从分子水平上获得多种信号对细胞进行定量分 析或纯化分选
细胞不被破坏，测量快速、大量、准确、灵敏、定量
目前国内主要流式细胞仪厂家 Beckton Dickinson(BD) BACKMAN COULTER
淋巴细胞亚群分析
试剂：BD Multitest IMK Kit 标本：外周血（常用） 配色：CD3-FITC/CD8-PE/CD45-PerCP/CD4-APC
（三）荧光信号
目前常用FCM配置（BD Calibar） 488nm激光管常用染料有 第一通道（FL1）：FITC (Fluorescein Isothiocyanate) 第二通道（FL2）：PE (Phycorey- thrin) 第三通道（FL3）：PerCP (Peridinin Chlorophyll Protein) PE-Cy7、PE-Cy5、 PerCP-Cy5.5 633nm激光管常用染料有
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依据流式细胞术测定的细胞参数可分选所需细胞群体： ●电荷式分选
逻辑电路
稳定液流
测量区
液滴形成
液滴充电
液滴偏转
Hale Waihona Puke 分选收集电荷式分选
通道式分选
逻辑电路
稳定液流
测量区
捕获管
分选收集
第二部分
流式细胞术在临床医学中的应用
流式临床应用
淋巴细胞亚群分析 血小板活化 HLA-B27 PNH Th1/Th2 肿瘤学 移植免疫 细胞凋亡 四聚体
Tetramer法
直接法 敏感性高 不受TCR基因型的限制
用Tetramer法研究表明，外周血中仅有0.2-2.5% 的CD8+细胞对CMV和EBV特异
Tetramer法
了解病毒特异性CTL和记忆性CTL 方面的一项革命
检测病毒特异性CD8细胞的金标准 (Gold Standard)
Doherty PC.The numbers game for virus-specific CD8+T cells[J]. Science,1998,280:227
HLA Class I 限定性肿瘤抗原肽
抗原特异性CTL的分析方法
51Cr释放实验
间接法
有限稀释法(LDA)
需大量的特异性CTLs作为效应细胞 需体外扩增，周期长，敏感性低， 费时费力
酶联免疫斑点法(ELISPOT) 难以广泛应用
PCR法
扩增特异T淋巴细胞受体
敏感性高 但只能用于已知TCR基因型的特异性CTLs检测
上机
激光激发
细胞单列通过 测量区
1.散射光信号 2.荧光信号
分离、收集、 分析、光信号
细胞理化特 性分析图
流式细胞仪的构造及原理
FCM测量光信号获取与分析
散射光信号 ●前向散射光(FSC)----细胞大小 ●侧向散射光（SSC)---细胞粒度 （膜的粒度、核大小与粒度、胞质数量） FSC信号越大，表明细胞体积越大；反之，则越小。 SSC信号越大，表明细胞粒度越大；反之，则越小。
分子量 668 394 1069 1183 624 615 350 1270 370
PY
303
结合方式 碱基特异性
嵌入
无
嵌入
无
非嵌入
G-C
非嵌入
GC
非嵌入
AT
非嵌入
AT
非嵌入
AT
嵌入
GC
嵌入 (双链） 无
静电（单链）
嵌入 (双链） GC>AT
静电（单链）
激发锋（nm) 发射锋(nm)
493
630
482
根根据据FSFCS-CS-SSCS二C二维维点点图图，，可可以以容容易易的区区分分L出ymL(yRm3()RG3r)an.(GRr1a)n与(RM1o)n与o(MRo2n)o(R2)
Incident Light Source
Right Angle Light Dectector a Cell Complexity
常
用
淋
R
巴
细
胞
亚
群
报 告 模 式
深圳 市人 民医 院流 式细 胞术 报告 单模 式
HLA-B27
通过CD3PEvsSSC设门，圈定CD3阳性细胞（T淋巴细胞），检测其 B-27的平均荧光强度。如标本的平均荧光强度小于标准微球荧光 强度则为阴性，反之为阳性。
Th1/Th2细胞
616
320,445
575
320,445
575
343
480
343
455
540
650
540
655
492
530
640
549-562
565-574
细胞周期分析
G1
S
Go G2 M
通过荧光探针对细胞周期进行相对DNA含量的测定，可分析细 胞周期各时期的百分比，周期动力参数及DNA异倍体
分选系统（Sorting)
Forward Light Detector a Cell Surface Area
R1
R1
R2
R2
R3
大家应该也有点累了，稍作休息
大家有疑问的，可以询问和交
流式细胞术常用染料及检测波长
荧光染料的发射不同波长
DNA 和RNA荧光探针的理化特性
荧光探针 P1 EB MI CA3 HO33258 HO33342 DAPI 7-AAD AO
自身免疫性疾病
Diabetes, Lyme disease, Multiple sclerosis, Rheumatoid arthritis, Autoimmune vitiligo
移植
EBV and CMV
Tetramer-应用-例证
感染性疾病
➢含有HIV-I型病毒包膜肽等三种抗原肽：HIV特异性CTL数量与血浆中RNA病 毒量有明显的负相关，而与产毒性感染细胞的清除率无关
肿瘤学
细胞凋亡
移植免疫
四聚体
Tetramer-原理
内源性抗原
外源性抗原
Tetramer-原理 MHC Class I-HLA-A2
Tetramer-原理
Tetramer-原理
国外医学免疫学分册 2001；24(2):102-105
Tetramer-应用
感染性疾病
HIV-AIDS, EBV, CMV, HPV, HBV, HCV, Influenza, Measles, Malaria, TB and RSV
肿瘤
Breast, Prostate, Melanoma, Colon, Lung, Cervical, Ovarian and Leukemia
➢慢性HCV感染患者的特异性CTLs数量明显少于急性HCV感染和已康复患者
肿瘤
➢用黑色素瘤抗原诱导潜在的肿瘤特异性T细胞—用Tetramer分离，富集
移植
➢GVHD(移植物抗宿主反应)：受体与供体的次要组织相容性抗原(mHags) 的不同引起，在骨髓移植后早期出现(14天内)，造成骨髓移植失败--HLA-mHags肽四聚体监测mHags特异性CTL，以了解对GVHD的临床 治疗效果
➢HLA-A2/pp65 Tetramer监测肾移植患者感染CMV后的免疫应答能力
第三部分 定量流式细胞术
定量流式细胞术的概述
定量流式细胞术指的是对待细胞的某种生物分子的绝 对计量，而不是阳性细胞的相对百分数。
流式细胞术的临床应用
第一部分
流式细胞仪（FCM)）工作原理
FCM系统结构
流体系统：样本流、鞘液 光学系统：激光光源、分光镜、滤片、
散射光和荧光探测器 分选系统：压电晶体、液流成滴、加电
系统、偏转系统 数据处理系统：计算机工作站
FCM工作原理流程：
加入荧光染料
样本（血液实 体组织）
单细胞悬液
荧光染料特异 染色的样本
逻辑电路
稳定液流
测量区
液滴形成
液滴充电
液滴偏转
Hale Waihona Puke 分选收集电荷式分选
通道式分选
逻辑电路
稳定液流
测量区
捕获管
分选收集
第二部分
流式细胞术在临床医学中的应用
流式临床应用
淋巴细胞亚群分析 血小板活化 HLA-B27 PNH Th1/Th2 肿瘤学 移植免疫 细胞凋亡 四聚体
Tetramer法
直接法 敏感性高 不受TCR基因型的限制
用Tetramer法研究表明，外周血中仅有0.2-2.5% 的CD8+细胞对CMV和EBV特异
Tetramer法
了解病毒特异性CTL和记忆性CTL 方面的一项革命
检测病毒特异性CD8细胞的金标准 (Gold Standard)
Doherty PC.The numbers game for virus-specific CD8+T cells[J]. Science,1998,280:227
HLA Class I 限定性肿瘤抗原肽
抗原特异性CTL的分析方法
51Cr释放实验
间接法
有限稀释法(LDA)
需大量的特异性CTLs作为效应细胞 需体外扩增，周期长，敏感性低， 费时费力
酶联免疫斑点法(ELISPOT) 难以广泛应用
PCR法
扩增特异T淋巴细胞受体
敏感性高 但只能用于已知TCR基因型的特异性CTLs检测
上机
激光激发
细胞单列通过 测量区
1.散射光信号 2.荧光信号
分离、收集、 分析、光信号
细胞理化特 性分析图
流式细胞仪的构造及原理
FCM测量光信号获取与分析
散射光信号 ●前向散射光(FSC)----细胞大小 ●侧向散射光（SSC)---细胞粒度 （膜的粒度、核大小与粒度、胞质数量） FSC信号越大，表明细胞体积越大；反之，则越小。 SSC信号越大，表明细胞粒度越大；反之，则越小。
分子量 668 394 1069 1183 624 615 350 1270 370
PY
303
结合方式 碱基特异性
嵌入
无
嵌入
无
非嵌入
G-C
非嵌入
GC
非嵌入
AT
非嵌入
AT
非嵌入
AT
嵌入
GC
嵌入 (双链） 无
静电（单链）
嵌入 (双链） GC>AT
静电（单链）
激发锋（nm) 发射锋(nm)
493
630
482
根根据据FSFCS-CS-SSCS二C二维维点点图图，，可可以以容容易易的区区分分L出ymL(yRm3()RG3r)an.(GRr1a)n与(RM1o)n与o(MRo2n)o(R2)
Incident Light Source
Right Angle Light Dectector a Cell Complexity
常
用
淋
R
巴
细
胞
亚
群
报 告 模 式
深圳 市人 民医 院流 式细 胞术 报告 单模 式
HLA-B27
通过CD3PEvsSSC设门，圈定CD3阳性细胞（T淋巴细胞），检测其 B-27的平均荧光强度。如标本的平均荧光强度小于标准微球荧光 强度则为阴性，反之为阳性。
Th1/Th2细胞
616
320,445
575
320,445
575
343
480
343
455
540
650
540
655
492
530
640
549-562
565-574
细胞周期分析
G1
S
Go G2 M
通过荧光探针对细胞周期进行相对DNA含量的测定，可分析细 胞周期各时期的百分比，周期动力参数及DNA异倍体
分选系统（Sorting)
Forward Light Detector a Cell Surface Area
R1
R1
R2
R2
R3
大家应该也有点累了，稍作休息
大家有疑问的，可以询问和交
流式细胞术常用染料及检测波长
荧光染料的发射不同波长
DNA 和RNA荧光探针的理化特性
荧光探针 P1 EB MI CA3 HO33258 HO33342 DAPI 7-AAD AO
自身免疫性疾病
Diabetes, Lyme disease, Multiple sclerosis, Rheumatoid arthritis, Autoimmune vitiligo
移植
EBV and CMV
Tetramer-应用-例证
感染性疾病
➢含有HIV-I型病毒包膜肽等三种抗原肽：HIV特异性CTL数量与血浆中RNA病 毒量有明显的负相关，而与产毒性感染细胞的清除率无关
肿瘤学
细胞凋亡
移植免疫
四聚体
Tetramer-原理
内源性抗原
外源性抗原
Tetramer-原理 MHC Class I-HLA-A2
Tetramer-原理
Tetramer-原理
国外医学免疫学分册 2001；24(2):102-105
Tetramer-应用
感染性疾病
HIV-AIDS, EBV, CMV, HPV, HBV, HCV, Influenza, Measles, Malaria, TB and RSV
肿瘤
Breast, Prostate, Melanoma, Colon, Lung, Cervical, Ovarian and Leukemia
➢慢性HCV感染患者的特异性CTLs数量明显少于急性HCV感染和已康复患者
肿瘤
➢用黑色素瘤抗原诱导潜在的肿瘤特异性T细胞—用Tetramer分离，富集
移植
➢GVHD(移植物抗宿主反应)：受体与供体的次要组织相容性抗原(mHags) 的不同引起，在骨髓移植后早期出现(14天内)，造成骨髓移植失败--HLA-mHags肽四聚体监测mHags特异性CTL，以了解对GVHD的临床 治疗效果
➢HLA-A2/pp65 Tetramer监测肾移植患者感染CMV后的免疫应答能力
第三部分 定量流式细胞术
定量流式细胞术的概述
定量流式细胞术指的是对待细胞的某种生物分子的绝 对计量，而不是阳性细胞的相对百分数。
流式细胞术的临床应用
第一部分
流式细胞仪（FCM)）工作原理
FCM系统结构
流体系统：样本流、鞘液 光学系统：激光光源、分光镜、滤片、
散射光和荧光探测器 分选系统：压电晶体、液流成滴、加电
系统、偏转系统 数据处理系统：计算机工作站
FCM工作原理流程：
加入荧光染料
样本（血液实 体组织）
单细胞悬液
荧光染料特异 染色的样本