枯草芽孢杆菌培养基的优化研究

毕业论文

课题名称枯草芽孢杆菌培养基的优化研究

2014年5月18日

目录

摘要 (Ⅰ)

Abstract (Ⅱ)

1 前言 (1)

2 材料与方法 (3)

2.1材料以及试剂 (3)

2.2实验主要仪器设备 (4)

2.3试验方法 (4)

3 结果与分析 (6)

3.1 单因素试验结果 (7)

3.2 正交试验结果 (11)

4 结论及讨论 (13)

参考文献 (15)

致谢 (16)

枯草芽孢杆菌培养基的优化研究

摘要

本文选取BPG液体培养基研究该培养基配方对枯草芽孢杆菌生长的影响，通过相关资料的查询，选取葡萄糖、蛋白胨、牛肉膏、磷酸二氢钾这四个因素变量。先通过单因素实验确定这四个因素的最适含量，再进行L9(34)正交试验确定BPG液体培养最适培养基组合。最终得到最佳培养基配方含量是牛肉膏4.0g，蛋白胨3.8g，NaCl 3.3g，葡萄糖4.0g，淀粉3.3g，KH2PO4 3.4g，MnSO4·7H2O 0.2g，蒸馏水1000mL，pH7.0，其枯草芽孢杆菌生长量为3.631×107 CFU/mL。

关键词：枯草芽孢杆菌；葡萄糖；蛋白胨；牛肉膏；磷酸二氢钾；正交实验

Bacillus subtilis culture medium optimization research

Abstract

This article selected BPG liquid medium to study the culture medium formula of the effect on bacillus subtilis growth, through the relevant information query, glucose, peptone and beef extract, potassium dihydrogen phosphate this four factors variables. First determined by single factor experiment, the optimum content of these four factors, then L9 (34) orthogonal test to determine the BPG liquid culture combination optimal medium. Finally it is to know the best culture medium formula content is 0.40 g of glucose, peptone 0.38 g, 0.36 g beef paste, potassium dihydrogen phosphate 0.34 g. Keywords:Glucose, peptone and beef extract, potassium dihydrogen phosphate, single factor experiment, orthogonal experiment

1前言

芽孢杆菌是人类最早发现的细菌之一[1]。枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis），为芽孢杆菌属的革兰氏阳性菌，芽孢大小为0.6～0.9×1.0～1.5 μm，外形为椭圆或柱状，一般处在菌体中央部位，形成芽孢后细菌体不会膨胀。菌落外观粗劣并且不通透，颜色为白色和微黄色，在液体培养基中生长时，会形成皱褶，生长需要氧气。

枯草芽孢杆菌是一种重要的α-淀粉酶的生产细菌，它能合成α-淀粉酶及多种酶类，与消化道和动物体内的消化酶类共同发挥作用。它在成长的过程中产生的枯草菌素、多粘菌素等活性物质，对致病菌和内源性感染的致病菌有着非常显著的抑制作用，而且作为好氧菌，可以迅速消耗肠道环境中的氧气，引起肠道缺氧，促进细菌的生长，并产生乳酸和其他有机酸，降低肠道pH值，对其他病原菌的生长起到不可忽视的作用[2]。同时枯草芽孢杆菌是一种多功能、高效、安全和极具开发潜力的微生物菌种，已经广泛应用于各类科研领域，跟随着科研水平的提高和经济的发展，枯草芽孢杆菌与人们的日常生活越来越密切，随之而来的就是对枯草芽孢杆菌越来越多的培养研究，为了在工业生产中提高枯草芽孢杆菌的产量和降低生产成本，因此我们需要研究出更好的枯草芽孢杆菌培养基[3]。

到目前为止，对枯草芽孢杆菌的国内外研究不在少数。1945年约翰逊报告了枯草芽孢杆菌防治植物病害的控制作用。此后，枯草芽孢杆菌制备的生防制剂用来防治植物病害的研究成为了国内外研究的热门话题。1980年Papavizas G C报导，枯草芽孢杆菌可以用来防治水稻等作物受多种真菌的病害[4]。1992年Hwang等报导，枯草芽孢杆菌可以防治豌豆的根腐病[5]。20世纪90年代后，国外已有了多种枯草芽孢杆菌制剂投入市场。美国Agraquest公司用枯草芽孢杆菌QST 713菌株和QST 2808菌株分别研制出活菌杀菌剂SerenadeTM和Souata AS，已在美国登记使用，叶面喷施能防止蔬菜，樱桃，葡萄，葫芦和核桃，霜霉病，白粉病，灰霉病，细菌和真菌疾病。GBO3和MBI 600分别由古斯塔夫森和微生物公司美国发展公司，根施或种子处理可以防止霉菌，镰刀菌，链格孢和丝核菌引起的大豆，小麦，棉花和花生根腐病。2001古斯塔夫森将淀粉芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌的生物防治剂混合在一起，称为BioYield，解淀粉芽孢杆菌变种植物生长促进剂taensa商品生产，商品taegrotm，用于灌木、树苗和装饰植物根部的室内培养，用来防治根腐病和枯萎病[6]。

海内少许公司也对具备生防功能的枯草芽孢杆菌进行了研究，涉及的防治对象有土传病害和果实病害、大田作物的叶部病害等。不同菌株有着不同的抑制作用，抑菌作用，抑菌机理。如今已从植物的根部泥土、植物和叶片上分离出的许多枯草芽孢杆菌对不同作物的真菌和细菌病害具有抑制作用，与人工诱变方法做比较提高了应变和这些菌株的发酵条件，学习的效率，通过对一些抗菌物质的分离和研究它的特点，同时进行温室和田间生物防治剂的试验，海内已经成功研究出并投入生产的枯草芽孢杆菌商品制剂有根腐消等。云南农业大学和中国农业大学共同研制的微生物农药“百抗”获得农业部登记注册，在多个省市推广使用，推广面积约为4667 hm2，主要防治三七根腐病、水稻纹枯病、烟草黑胫病，百抗的主要有效成分是枯草芽孢杆菌B908[7]。江苏省农业科学院陈志谊等经过生物防治水稻病的研究获得了50.0％~81.0％的防治水稻纹枯病的效果，现已在江苏等地得到广泛推广；黑龙江省级科学研究院应用微生物研究所研发出来的枯草芽孢杆菌水剂主要用来防治瓜类及保护地蔬菜枯萎病、豆类根腐病和立枯病，已在黑龙江等地进行普及应用[8]。

枯草芽孢杆菌是当前应用最广泛的工业酶生产菌种之一，根据部分统计，枯草芽孢杆菌生产的酶占全部酶市场的50 %[9]。由于枯草芽孢杆菌的优点，如安全性好、产酶量高、种类多和环保，在现代工业生产中被广泛用作生产菌种，在各领域发挥着重要作用，如发酵法生产的食品，饲料，酶洗，纺织，皮革，造纸，医药等。枯草芽孢杆菌作为植物病害生防细菌之一，有较强的防病功能，美国到现在已有4 株枯草芽孢杆菌生防菌株获得环保局商品化或有限商品化生产应用许可，如美国AgraQuest 公司用枯草芽孢杆菌QST713菌株开发出活菌制剂杀菌剂SerenadeTM，并在2000 年通过美国环保局(EPA) 的登记，用作防治多种作物的白粉病、灰霉病等病害；中国利用枯草芽孢杆菌，植物病害的防治已达到世界先进水平，商业制剂已研制成功并投入雅宝，百抗，丰宁生产，小麦曲宁产品如[10]。枯草芽孢杆菌是基因工程菌的受体，是制备近200基因原核和真核细胞的本源，无论是在生产或研究中，都处于中心位置，对它的研究涉及各个方面[11]。枯草芽孢杆菌是国内准许使用的饲料微生物菌种，由于它的无毒害，经常被制造成为微生物添加剂，使用在改善动物肠道功能、促进动物生长和预防疾病等方面。枯草芽孢杆菌的内生孢子存在于制剂中，在动物肠道中，孢子能迅速恢复和分泌高活性的上肠蛋白质，脂肪，淀粉，有助于牧草碳水化合