人类胚胎干细胞基础培训教材完整版

人类胚胎干细胞基础培

训教材

HEN system office room 【HEN16H-HENS2AHENS8Q8-HENH1688】

人类胚胎干细胞基础技术

高级培训班

2010-12

目录

1.绪论

本操作手册将为您详细介绍人胚胎干细胞/iPS细胞培养的基础知识、技术细节及相关的产品信息。目的是为了让您更好地培养您购买的细胞，请按照此手册进行培养操作直至获得可靠的冻存细胞。上海斯丹赛生物技术有限公司专业提供各类胚胎干细胞

/iPS细胞及成套产品服务，为您的干细胞研究提供一站式解决方案。

2.饲养层细胞的制备

材料与仪器

成纤维细胞完全培养基，货号EFM-01

胰酶，货号M-005-1

成纤维细胞冻存液（2x），货号EFFM-01

基质胶（Matrigel matrix），BD Pharmingen，货号356235

CF-1小鼠胚胎成纤维细胞（MEF），货号MEF-CF1-01

T25透气培养瓶，NUNC，货号156367

T75透气培养瓶，NUNC，货号156499

2 ml移液管，NUNC，货号159617

5ml移液管，NUNC，货号159625

10 ml移液管，NUNC，货号159633

15ml离心管，货号366036

50ml离心管，货号373660

冻存管，NUNC，货号377267

Thermo-Fisher Finnpipette F3移液器和灭过菌的枪头

生物安全柜，货号

CO2培养箱，Thermo，HERA cell 150i

电子计数器，millipore，货号PHCC00000

电动移液器，Thermo Scientific Finnpipette C1，货号4580800

低速离心机，Thermo Scientific CL10

液氮罐，Thermofisher，货号CN50900

2.1从胎鼠获得小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）

1. 拉断颈椎处死怀孕12-13天的CF-1小鼠，浸入70％的酒精中消毒。

2. 将小鼠放在超净台无菌的解剖盘中，在腹中线处做一横向切口。

3. 剪开的皮肤拉向切口的上下两侧，提起腹膜，将其剪开，充分暴露腹腔。

4. 找出子宫，一只手用无菌钝口镊子轻轻提起子宫，另一只手持无菌镊子小心分离子宫周围的结缔组织。当两侧子宫都与其相连的组织分离好后，用剪刀将左右两侧的子宫在输卵管与子宫角的衔接处剪下，小心剪下子宫的联体部分，置于无菌的60mm 培养皿中。

5. 用无菌的剪刀在子宫头与子宫尾分别剪去输卵管及子宫角部分。

6. 将子宫置于15ml离心管中，用10mlPBS洗三遍。

7. 用尖镊子撕开子宫壁和胎膜，取出胎鼠，放在新的培养皿中。

8. 用8mlPBS 将胎鼠洗三遍。

9. 用灭菌的眼科剪刀去除胎鼠的胚囊，释放胚胎，并胚胎计数。

10. 将胚胎移到干净的培养皿中，PBS洗三次。

11. 用镊子小心的去除胚胎的头和肝脏，PBS洗三次。

12. 将胚胎转移至新的培养皿中，用无菌剪刀将组织充分剪碎，加入％胰酶同时吹打几分钟使其消化均一并彻底酶解。

13. 用同样体积的MEF完全培养基中和胰酶。

14. 一个T75瓶加10ml MEF完全培养基，按照每2-3个胚胎一个T75瓶，将已消化的胚胎加入培养瓶中，放在5％CO2培养箱中培养，培养瓶注明细胞名称，代数及日期。

2.2MEF的传代

1. 将T75瓶中的MEF培养基吸出。

2. 加入大约3ml胰酶，于37℃的CO2培养箱中放置3-5分钟

3. 取出瓶子，轻轻晃动，可以看见白色的细胞层开始从瓶子的底壁掉落。确保瓶盖是拧紧的。用手掌根轻拍瓶侧3-5次。在灯下观察细胞是否已从瓶子上脱落。

4. 加入同等体积（3ml）的MEF培养基，混匀，吹打几次以形成单细胞悬浮液。

▲Note: 这一培养基是包含血清的，将会完全抑制胰酶的活性。

5. 补加42mlMEF培养基到瓶子中，使总体积达到50ml，混匀。

6. 将上述细胞悬浮液均分至5个新的T75瓶子中，每瓶10ml。

7. 放在5％CO2培养箱中培养，逐日观察。

2.3MEF的冻存

1. 吸去培养液，加％胰酶至完全覆盖瓶底（以T75为例）。

2. CO2培养箱中孵育3-5分钟，不时轻拍瓶壁，使细胞层脱落。

3. 加入同等体积的MEF培养液中和胰酶，吹打混匀。

4. 将其转移至15ml离心管，用电子计数器进行细胞计数后，以1000rpm的速度离心5分钟。

5. 移去上清，用少量新鲜的MEF培养液重悬细胞沉淀。

6. 缓慢加入等量的MEF细胞冻存液（2x）并混匀。

7. 分装上述细胞悬液于2ml冻存管中，每管。

8. 在冻存管上注明细胞名称，代数，数目，冻存时间。

9. 将冻存管放到冻存盒中，-80℃冰箱过夜。

10. 最后将冻存管转移至液氮罐中以便长期保存。

2.4MEF的失活

1. MEF传代到3－5代时，当细胞铺满培养瓶后（以T75为例），加3ml ％胰酶，放入37℃的CO2培养箱孵育3-5分钟。

2. 加入同等体积的MEF培养液中和胰酶，用移液枪吹打几次以形成单细胞悬浮液。

3. 将所有细胞悬液混合到一个50ml离心管中，补加适量新鲜的MEF培养液。

4. 取上述细胞悬液，转移至新的15ml离心管中，用培养液稀释，混匀。

5. 用电子计数器计数细胞。

6. 将原来的50ml离心管封口，使用gama射线辐照仪，50－80戈雷辐照。

7. 辐照完后，以1000rpm的速度离心5分钟。

8. 移去上清，用适量新鲜的MEF培养液重悬细胞。用于培养人胚胎干细胞的饲养层细胞标准浓度是～30,000 cells/cm2。按照此标准铺板。具体铺板步骤请见3饲养层细胞的准备。对于暂时不用的细胞，将其冻存，需要时复苏。具体冻存步骤请见 MEF 的冻存。

3.饲养层细胞的准备

材料和仪器

CF-1小鼠胚胎成纤维细胞（MEF），货号MEF-CF1-01

成纤维细胞完全培养基，货号EFM-01

基质胶（Matrigel matrix），BD Pharmingen，货号356235

CO2培养箱，Thermo，HERA cell 240

Thermo-Fisher Finnpipette F3移液器和灭过菌的枪头

T25透气培养瓶，NUNC，货号156367

2 ml移液管，NUNC，货号159617

5ml移液管，NUNC，货号159625

10 ml移液管，NUNC，货号159633

电动移液器，Thermo Scientific Finnpipette C1，货号4580800

加入足量的基质胶均匀铺到瓶（或孔板或皿）底部，以能覆盖全部底部为准，譬如

T25透气培养瓶以超过为宜。

37℃培养箱放置至少30min。

从培养箱中取出瓶（或孔板或皿），轻轻推送板子将未被基质胶覆盖的地方再次覆盖，然后立即吸弃基质胶。

加入适量成纤维细胞完全培养基（37℃预孵育超过10min），譬如T25透气培养瓶以加入4ml为宜。

从液氮中取出冻存的失活过的MEF细胞，立即投入37℃水浴中，迅速解冻（1min之内）。

根据预实验将相应数量的饲养层细胞加到之前已经准备好的瓶（或孔板或皿）中，混

匀。推荐的饲养层细胞密度为3万cells/cm2。

Point

饲养层细胞需在ES/iPS细胞传代前两至三天准备。

饲养层细胞的密度最适宜是80－90％, 太密或是太稀疏都容易使干细胞分化。

请在铺被前先做预实验估算细胞的复苏存活率，以一个T25培养瓶计算，若存活

率为90%，则铺入的细胞量应为万。

▲Note: 饲养层细胞铺了10天之后推荐不再使用。

培养容器的类型基质胶体积

24-well

35mm

Flask

105 cells/ml）

4.ES/iPS细胞的复苏

材料和仪器

人类ES/iPS细胞（SiDSH -01, SiDSH -03），货号HIPS-01/03

人类胚胎干细胞完全培养基，货号HESM-01-500

CO2培养箱，Thermo，货号HERA Cell 240

Thermo-Fisher Finnpipette F3移液器和灭过菌的枪头

电动移液器，Thermo Scientific Finnpipette C1，货号4580800

T25透气培养皿，NUNC，货号156367

5ml移液管，NUNC，货号159625

15ml离心管，NUNC，货号366036

解冻人ES/iPS细胞，从液氮中取出冰冻的人类ES/iPS细胞冻存管，立即投入37℃水浴中快速的旋转以迅速解冻（控制在1min之内）。

▲Note: 水不要淹没瓶盖

当只有一片冰晶存在时，从水中取出冻存管。用消毒酒精棉将冻存管外壁擦拭一遍，以去除水缸中的微生物。

将细胞转移到一个预装有2ml人类胚胎干细胞完全培养基的15ml离心管中，混匀。200×g（1000rpm）, 离心5 分钟。

吸弃上清液。用4ml的人类胚胎干细胞完全培养基重悬细胞沉淀。

转移悬浮液到一个预铺有饲养层细胞的T25瓶中，补加人类胚胎干细胞完全培养基至总体积为5ml。

将瓶放入37℃的CO2培养箱中，观察细胞每天的生长情况。

Point

复苏的第二天无需更换培养液，从第三天起每天更换新鲜的人类胚胎干细胞完全培养基。

复苏后第5天左右可以看见微小的克隆出现，之后逐渐长大。

复苏后第10-12天传代，具体情况视ES细胞生长情况而定。

5.ES/iPS细胞的传代

材料和仪器

人类胚胎干细胞培养液（含bFGF 货号 HESM-01-500 ；不含 bFGF 货号 HESM-02-500）

Ⅳ型胶原酶（货号 M-001）

已经包被好饲养层细胞的培养瓶/板

Thermo-Fisher Finnpipette F3移液器和灭过菌的枪头

T25透气培养皿，NUNC，货号156367

5ml移液管，NUNC，货号159625

15ml离心管，NUNC，货号366036

电动吸引器

Point

当出现以下情况之一即可以进行细胞传代：

1． MEF滋养层细胞生长超过两周。

2．克隆太大，或太密集。

3．当培养的ES克隆中出现越来越多的分化。

人的ES细胞传代（以T25培养瓶为例）

从培养瓶中吸出旧的人胚胎干细胞培养液

立即加入3-4ml的Ⅳ型胶原酶到瓶中，温柔的摇晃培养瓶使之覆盖到所有的细胞。▲Note: Ⅳ型胶原酶需在37度预热。

将T25瓶重新放回37度培养箱中，放置约20min－30min。

消化期间可以处理预铺了饲养层细胞准备用来传代的新的培养瓶，处理如下：吸弃里面的成纤维细胞完全培养基，加入1ml人类胚胎干细胞培养液（不含bFGF）洗涤feeder（只要将瓶底盖过），吸弃，然后加入4-5ml新的人类胚胎干细胞完全培养基，以备传代。

待克隆消化下来后，取出培养瓶，将瓶中液体连同脱落的克隆转移到15ml离心管里。加入2ml的人类胚胎干细胞培养液（不含bFGF），混匀。

待干细胞团块沉降下来后，吸弃上清液。

加入2ml新鲜的人类胚胎干细胞培养液（不含bFGF）洗涤细胞（即吹打重悬），待细胞沉降下来后，吸弃上清。

加入2ml新鲜的人类胚胎干细胞完全培养基重悬细胞，并用移液枪吹打克隆到适合

大小，然后根据自己需要按比例传代。

Point：

在消化过程中，最好每隔10min拿出来观察一下，看是否已经开始消化。随着克隆的消化，克隆边缘部分卷起，当克隆大部分卷起，直至轻轻晃细胞就会脱落时，表明消化充分。注意：消化时间约为20－30min，根据经验，这一时间段可以将未分化的干细胞克隆消化下来，而分化的克隆就不会消化下来，所以，消化时间不宜过长，这样可以剔除分化的克隆。而如果消化不充分，会导致传代后的细胞结块。所以，要掌握好时间。

如果细胞不易沉降，则可以1000－1200rpm离心30sec－1min使细胞沉降。

传代比例通常为1：6或1：8。

传代后的注意事项：

1．传代后的第一天，不需更换新的培养液，从第二天起，每天换液。

2．传代周期为6－7days，但要视细胞状态而定，传代可以改善细胞状态。3．传代的前两至三天预铺feeder。

6.ES/iPS细胞的冻存

材料和仪器

人ES/iPS细胞（生长到可传代的状态，同上描述）

人胚胎干细胞培养基（货号： HESM-01-500）

Ⅳ胶原酶（货号M-001）

人胚胎干细胞冻存液（2x）（货号：HESFM-01）

15ml离心管，NUNC，货号366036

液氮罐，Thermo，货号CN50900

冰

镊子

Thermo F3移液器和灭过菌的枪头

2ml冻存管，NUNC，货号377267

冻存管架，NUNC，货号376589

Point：

人的胚胎干细胞可以在液氮中长期冻存。

为了得到人类胚胎干细胞的高存活率，在开始冻存步骤之前，准备好所有的材料和仪器。冻存管在使用之前应该在冰上预冷，且应该事先将必须的信息（如细胞的名称，传代次数，细胞数目，冻存日期等）标记在管子的标签上。

冻存步骤（以T25瓶为例）：

当细胞生长良好时，消化细胞（具体步骤同上述传代过程）。

将消化下的细胞洗涤两次。

用2ml新鲜的人胚胎干细胞培养基重悬细胞并吹打至传代大小。

待克隆沉降下来后，吸弃上清。

加入新鲜的人胚胎干细胞培养基重悬细胞

加入人胚胎干细胞冻存液（2x），快速混匀。

将上述细胞悬液转移至2ml冻存管中。

迅速将冻存管放入冻存盒中，-80℃冰箱过夜。

最后将冻存管转移至液氮罐中以便长期保存。

7.人类胚胎干细胞的无滋养层培养

材料与仪器

7.1人类胚胎干细胞条件培养基（CM）的收集

1.配制人类胚胎干细胞培养液。

2.培养瓶加入适量明胶（覆盖瓶底即可），放入5％CO

培养箱孵育30分钟左右。

2

3.吸掉明胶，将辐照过的饲养层细胞按照55,000 cells/cm2浓度铺板。

4.待细胞贴壁后，换人类胚胎干细胞培养液培养液（按照 ml/cm2)。

5.24小时左右开始收集培养液，之后每天收集，可持续收集7-10天。

6.CM可存放在-20℃冰箱中一个月。

7.2无饲养层人胚胎干细胞系的培养及传代

1.在培养瓶中加入适量matrigel（覆盖瓶底即可）放入培养箱孵育 1小时左右。

2.吸去 matrigel，将饲养层培养的人胚胎干细胞传代洗涤后，最后细胞转移到此培养瓶中，加CM培养。

培养箱消3.在人胚胎干细胞克隆生长5天左右传代。吸去培养液，加 dispase 5％CO

2

化至克隆大部分脱壁。

4.加适量培养液，用移液管轻轻吹打使克隆脱壁。

5.将细胞悬液转移到15ml离心管中，用移液管吹打几次使细胞克隆至适当大小。

6.吸取适量混匀的悬液至小离心管中，离心沉淀，用胰酶消化成单细胞，加培养液中和，细胞计数。

7.以1000rpm的速度离心5分钟。

8.吸去上清，加CM培养液重悬细胞。

将细胞接种到已铺好matrigel的培养瓶中，9.按照～90,000–170,000 cells/cm

2

培养箱培养。补加适量CM。轻轻晃动培养瓶，使克隆均匀分布在瓶底，放入5％CO

2

8.拟胚体的形成

材料与仪器

拟胚体（embryonic body,EB）来源于多能干细胞，且由多种分化的细胞类型组成。它可以模拟胚胎早期发育的过程，是一种很好的在体外研究早期发育中细胞和分子间作用的模型。

拟胚体的制备：将得到的iPS细胞系扩增培养后，按正常传代步骤消化下来，洗涤去除MEF细胞，将细胞吹打至小团块（比正常传代大小再小一些），然后悬浮培养在MEF培养液中。3天后换第一次液，之后每2-3天换液一次，直至收集。收集EB后用TRIZOL裂解，抽提RNA, 反转录，通过real-time PCR的方法（见real-time PCR 检测的具体protocol）检测各胚层marker的表达情况。

9.胚胎干细胞全能性的鉴定

胚胎干细胞全能性的鉴定主要包括以下几个方面：

碱性磷酸酶活性检测

干细胞表面marker的免疫染色检测

干性因子的去甲基化分析

干细胞内源基因的表达分析

端粒酶活性检测

核型检测

拟胚体形成

畸胎瘤形成实验

下面分述各种鉴定的方法以及详细的操作步骤：

碱性磷酸酶活性检测

材料

PBS buffer

4% Paraformaldehyde

Alkaline Phosphatase Detection Kit：Sidansai，货号AP-1kit

1 x Rinse Buffer . TBST: 20mM Tris-HCl, pH , 0.15M NaCl, % Tween-20) 碱性磷酸酶染色步骤：

a.Aspirate media and fix ES or iPS cells with a fixative . 4%

Paraformaldehyde in PBS) for 1-2 minutes. Note: Do not overfix.

Fixing cells longer than 2 minutes will result in the inactivation of alkaline phosphatase.

b.Aspirate fixative and rinse with PBS buffer.

c.Aspirate and rinse with 1 X Rinse Buffer. DO NOT allow wells to dry.

d.Prepare reagents for Alkaline Phosphatase staining (BufferA: BufferB:

BufferC=100:38:28)

e.Add enough stain solution to cover each well . for a well of a 24-well

plate). Incubate in dark at room temperature for 15 minutes.

f.Aspirate staining solution and rinse wells with 1 X Rinse Buffer. Cover

cells with 1 X PBS to prevent drying and then count the number of

colonies expressing AP (red stem cell colonies), versus the number of differentiated colonies (colorless).

干细胞表面marker的免疫染色检测

Stage-specific embryonic antigen-3(SSEA3)

Stage-specific embryonic antigen-4(SSEA4)

Tumor-related antigen-1-60(TRA-1-60)

Tumor-related antigen-1-81(TRA-1-81)

OCT4

SOX2

Nanog

表达于小鼠ES/iPS细胞中的标志物包括：

Stage specific embryonic antigen-1(SSEA-1)

OCT4

SOX2

Nanog

免疫染色步骤：

1. 首先把细胞固定在4％多聚甲醛（4％PFA）中，室温放置30min;

2. 在无水乙醇中浸泡两次，每次20min（或3次，10min/次）

注意：此步骤仅限于核蛋白，如Oct4，Nanog或Rex1等，不能用于膜蛋白如SSEA 和Tra等

3. 将上述溶液吸干，先用1X PBS洗涤一次，再用抗体稀释液（%BSA和%TritonX100溶

于PBS）洗涤两次；

4. （此步骤可不操作，进行此步骤是为了更好的封闭非特异反应）用封闭液（含

1%BSA+4% normal serum+%TritonX100的PBS溶液）封闭细胞；

5. 将一抗稀释在抗体稀释液中，加到样品上，室温2h或4度放置过夜；

6. 用PBT（%TritonX100）洗涤细胞3－5次；

7. 将二抗稀释在抗体稀释液中，并加到细胞样品上，室温放置1h;

注意：从步骤7开始，样品要注意避光！

8. 用PBT洗涤3次；

9. 将DAPI (1mg/ml in PBS)母液以1:1000 用PBS稀释, 室温放置5min;

OR: 将JASMIN（hochest）母液以1:1000用PBS稀释，室温放置5min;

10. 用PBS洗涤5min,两次；

11. 再用4％多聚甲醛室温固定30min；

12. 最后再用PBS洗涤两次，每次5min.

干性因子的去甲基化程度分析

Bisulphite Squencing 法分析甲基化状态

（一）Bisulphite 处理基因组DNA

1、将基因组DNA置于冰上，液体石蜡冰上预冷。

2、给每个样品准备6个Ep管，每管加300ul液体石蜡。

3、准备样品：

1）每个样品取210ng的DNA，稀释到21ul。

2）新配2M的NaOH（用超纯水配，1.6g NaOH/20ml水），每管样品中加4ul（使之终浓度为0.3M）NaOH。

3）50℃，15min。

4、准备2％低熔点argrose：0.02g/ml，用双蒸水配。100℃ 5min，之后置于50℃待用。

5、向3中的DNA液中加入50ul 2％低熔点argrose，混匀（保持50℃）。

6、吸取上述argose和DNA混合液，加10ul/管于第二步预冷的矿物油中。冰上至少30min，使beads坚硬。

7、向beads中加入500ul 2.5M Sodium metabisulphite （新配），摇匀，使beads 位于分层上。离心甩一下。

8、50℃避光反应4h～12h，不超过16h～18h（一般12h）。

附：Sodium metabisulphite的配制总体积：20ml

I. Hydroquinone 220mg

O 2ml

H

2

50℃避光溶解（黄红色）

II. Sodium bisulphate 7.6g

O 8ml

H

2

2M NaOH 5ml

50℃避光溶解，每隔10min晃一次，溶30min

I，II分别配好后，在暗处混合，混合后颜色变浅，降为室温即可使用。

终止反应，洗脱：