人类胚胎干细胞基础培训教材完整版
最新3.3胚胎干细胞ppt课件
干细胞应用前景非常广阔，比如可用于细胞治疗、基 因治疗、药物筛检和毒性的检测、生物体发育机制研究 等。其中最吸引人的应用，是将干细胞分化成某一特定 的细胞、组织，甚至器官，通过移植，使之再建起受损 的组织，甚至器官。比如，将干细胞在体外分化为胰岛 素细胞，注入病人胰脏中，通过增殖，构成病人新的胰 岛组织，它就可以替代病人受损的胰岛组织，使依赖注 射胰岛素维持生命的病人得到根治。人们预言，干细胞 有可能用于治疗人类几乎所有的组织坏死性或退化性疾 病，它将是人类医疗史上的一次革命。
的发生. (二)临床表现 1,有1—6个月的服药史 2,部位全口牙龈,以上下前牙区较重 3,增生呈实质性,分叶状,可覆盖大部分或全部牙冠
(三)别诊断 1,遗传性牙龈纤维瘤病: 2,增生性龈炎 (四)治疗 1,停止服用引起牙龈增生的药物是对药物性
牙龈增生的最根本的治疗. 2,去除局部刺激因素 3,局部药物治疗 4,手术治疗 5,口腔卫生宣教
随着组织工程技术的发 展，通过ES细胞体外诱导分化，还 可以培育出人造组织器官，解决目 前临床上存在的供体器官不足和器 官移植后免疫排斥的问题。
（3）ES细胞也是研究体外细胞分化 的理想材料。
ES细胞在饲养层细胞上， 或在添加抑制因子的培养液中，能 够维持不分化的状态。
在培养液中加入分化诱导因 子,就可以诱导ES细胞向不同类型的 组织细胞分化.
分 – 能发育成完整个体 类 • 多能干细胞(成体干细胞)
– 能分化出动物体内的多种组织（造血干细胞）
• 专能干细胞
– 如成肌细胞、皮肤生发层细胞等 – 能分化出特定的（一种或两种）组织
.分别指什么, 分化程度, 潜能；核全能性；目前初始化
.应用
.
.分类
干细胞可以通过以下四个途径获得： (1)从体外培养的胚胎获得； (2)从早期流产的胎儿中获得； (3)从克隆的胚胎中获得； (4)从成体中获得。
干细胞基础培训PPT课件
干细胞的生物学表现
远合性 干细胞向远位组织或器官内的迁移及嵌合于其内 分化性 分化性包括神经系统损伤区域内局部的微环境影响干细胞移植后的分化;骨髓和脐血 间充质干细胞向神经样细胞的分化 低抗原性 干细胞是未分化的原始细胞，不表达成熟的细胞抗原，具有低免疫源性
干细胞的分类-功能
1、全功能干细胞(totipotent stem cell,TSC) 由卵和精细胞的融合产生受精卵。而受精卵在形成 胚胎过程中分裂至64个细胞左右的任一细胞皆是全 能干细胞。具有发展成独立个体的能力也可以发育 成为身体内200多种细胞类型中的任何一种。 2、多功能干细胞（pluripotent stem cell） 无法发育成一个个体，但具有可以发育成多种组织 的能力的细胞 。 3、专功能干细胞（unipotent stem cell） 只能产生一种细胞类型；但是具有自更新属性。
造血干细胞
定义：造血干细胞是所有血细胞的原始细胞。 所有的血细胞都是由造血干细胞定向分化、增 殖而成 来源：主要存在于骨髓、外周血、脐带血中 特点： 造血干细胞是体内各种血细胞的唯一来源 形态不一致 造血干细胞的移植是治疗血液系统疾病、先天 性遗传疾病以及多发性转移性肿瘤疾病的最有 效方法。
间充质干细胞
干细胞，医学的第二次革命！
人类干细胞的分离、培养和应用研究可能是人 类生命科学研究上划时的进步，它几乎涉及所 有的生命科学和生物医药学领域。 临床疾病治疗 人造器官移植 生物制药 医疗美容
疾病
1 干细胞治疗心力衰竭 2 干细胞治疗肝硬化 3 干细胞治疗糖尿病 4 干细胞治疗小儿脑瘫 5 干细胞治疗中风后遗症 6 干细胞治疗系统性红斑狼疮
病理条件下才显出一定的自我更新潜能
增殖能力较弱，故不能完全取代胚胎干细胞
高考复习课件：胚胎分割及胚胎干细胞课件 PPT课件 人教课标版
.切什么时期
问题探讨
• 分割什么时期的胚胎? • 用什么来分割? • 分割的具体操作?
.讨论,
.时期
.时期\要求
.工具
.镜\刀\针
.分割后做什么 具体操作过程
.注入空透明带
.半裸胚直接到受体
.半裸胚直接移植, 均等, 为什么只能2份
.还存在什么问题
阅读
• 课本P79倒数第一段 • 归纳存在什么问题
•
15、所有的辉煌和伟大，一定伴随着挫折和跌倒；所有的风光背后，一定都是一串串揉和着泪水和汗水的脚印。
.
.性别鉴定
.
.性别鉴定2
.
.还可以胚胎嵌合体
三.胚胎干细胞
1.概念:简称ES或EK细胞,是由早期胚胎或原始性腺 中分离出来的一类细胞.
2.特点:
1)形态:体积小.细胞核大,核仁明显.
2)功能:具有发育的全能性.可分化为成年动物体内任 何一种组织细胞.体外培养可增殖不分化.
3）在体外培养的条件下，ES细胞可以增殖而不发生 分化。对它可以进行冷冻保存，也可以进行遗传改 造。
胚胎干细胞: 内细胞团细胞 原始性腺细胞
.加图，归纳
.特点
形态、功能
• 形态：
– 体积小、细胞核大、核仁明显
• 功能：
– 可以分化成任何一种组织 – 体外培养，只增殖不分化
.为什么要移植，练习册P56 11
.全能细胞
全能细胞
.
多能、专能.
.
.分类
• 全能细胞
– 桑椹胚及以前 – 能发育成完整个体
•
20、没有收拾残局的能力，就别放纵善变的情绪。
•
1、想要体面生活，又觉得打拼辛苦；想要健康身体，又无法坚持运动。人最失败的，莫过于对自己不负责任，连答应自己的事都办不到，又何必抱怨这个世界都和你作对？人生的道理很简单，你想要什么，就去付出足够的努力。
胚胎干细胞(自己做的ppt)
养，以模拟体内环境。
培养器皿
02
选择适合胚胎干细胞贴壁生长的培养器皿，如培养瓶、培养板
等，并进行预处理以提高细胞贴壁率。
优化策略
03
根据细胞生长情况，调整培养基成分、培养密度、换液时间等，
以优化培养条件，提高细胞质量和数量。
细胞传代与冻存方法
传代时机
当胚胎干细胞生长至一定密度时，需要进行传代以避免细胞过度生长和分化。
02 胚胎干细胞的研究历程
早期研究阶段
起源与发现
胚胎干细胞的研究起源于20世纪 80年代，最初是从早期胚胎中提
取并培养出来的。
初步应用
早期胚胎干细胞研究主要集中在细 胞分化、胚胎发育等基础研究领域， 同时也探索了其在再生医学中的潜 在应用。
伦理争议
由于胚胎干细胞研究涉及人类胚胎 的使用和破坏，因此在其早期阶段 就引发了广泛的伦理争议。
再生医学
胚胎干细胞在再生医学领域具有广阔的应用 前景，可以用于构建人工组织或器官，替代 受损的组织或器官，实现人体损伤的修复和 再生。
药物筛选
利用胚胎干细胞分化得到的特定细胞 类型，可以进行药物筛选和毒性测试， 提高药物研发效率和安全性。
科学研究
胚胎干细胞是研究胚胎发育和细胞分 化的重要模型，有助于揭示生命起源 和细胞分化的奥秘。
特点
具有发育的全能性，能分化出成体动物的所有组织和器官， 包括生殖细胞；具有在体外培养无限增殖、自我更新和多向 分化的特性；无论在体外还是体内环境，ESCs都能被诱导分 化为机体几乎所有的细胞类型。
胚胎干细胞的来源
早期胚胎
核移植技术
通过体外受精或其他辅助生殖技术得 到的早期胚胎是获取胚胎干细胞的主 要来源。
法律法规限制
《第四节 干细胞工程》教案
《第四节干细胞工程》教案1 教学目标2 .1 知识目标简述胚胎分割、胚胎干细胞的理论基础；举例说出胚胎分割、胚胎干细胞的应用及发展前景。
2．2 能力目标通过讨论、进展追踪等活动，提高搜集资料、处理资料、撰写专题综述报告的能力。
2．3 情感、态度与价值观目标关注胚胎工程的研究进展和应用价值，认同胚胎工程在畜牧业、医疗等领域的应用价值。
2 教学重点简述胚胎分割的应用意义、胚胎干细胞的研究意义。
3 .教学难点简述胚胎分割的生理学基础，胚胎干细胞的概念和分离途径。
4 .课前准备教师准备： (1) 查阅书籍、网站、报刊等，搜集与胚胎分割与胚胎干细胞相关的知识以及其他教师的优秀案例； (2 ) 制作多媒体课件、展示前沿科技成果；(3 ) 选出适合学生阅读的资料制成学案并印发给学生。
学生准备：通过报刊、杂志、互联网或其他媒体搜集资料，并相互交流、了解胚胎工程的新进展。
5 教学过程设计6． 1 导入新课(情景创设——“黄牛的梦想” )教师：我们每个人都有很多美好的梦想，同学们你们知道黄牛的梦想吗?教师用多媒体展示：一头黄牛妈妈与一头奶牛牛犊。
学生：哈!原来黄牛的梦想是想生一头奶牛宝宝。
教师：同学们，我们能帮黄牛实现它的梦想吗?(教师引导学生回忆上节胚胎移植内容。
)学生：能! 通过胚胎移植技术。
教师：非常好! 让我们一起看大屏幕回顾胚胎移植的基本程序。
教师展示双胞胎姐妹照片。
教师：这对双胞胎姐妹非常漂亮，黄牛看了很羡慕人类有双胞胎，所以又有了新的梦想——“我黄牛要是像人一样能生一对双胞胎奶牛那该多好呀! ”你能帮黄牛实现这个梦想吗?教师：板书课题—一胚胎分割。
设计意图：用黄牛的梦想激起学生兴趣，并以黄牛梦想为主线，从知识回顾自然过渡到新课内容，让学生充分感受到现代生物技术是科学家从“异想天开”开始的，从而培养学生创新的思维能力。
6．2 探索新知6．2．1 胚胎分割的学习活动一：自主学习胚胎分割内容，并完成学案中的问题。
胚胎干细胞教程教案
细胞 committed stem cell
2020/4/18
Some stem cells have more developmental options than others
• 1 干细胞本身不是终末分化细胞 • 2 干细胞能无限增殖分裂 • 3 干细胞可连续分裂几代，也可在较长时间内
处于静止状态 • 4 干细胞分裂产生的子细胞只能在两种途径中
选择其一，或保持亲代特征仍作为干细胞，或 不可逆地向终末分化。
2020/4/18
干细胞的鉴别
• 利用慢细胞周期性和自我更新能力，采用标记 滞留细胞和细胞克隆来识别，但有局限性
2020/4/18
❖The different cell types of a multicellular organism contain the same DNA.
❖A cell can change the expression of its genes in response to external signals.
Where to get the stem cells?
(1) Embryonic stem cells
来自早期胚胎、原 始生殖细胞或畸胎 瘤组织等源于胚胎 的干细胞，属全能 干细胞totipotent， 每个细胞可以发育 成为完整的个体。
2020/4/18
(2) Adult stem cells
2020/4/18
Cell differentiation
About the concept of cell differentiation
干细胞培训专业课程ppt课件
成体干细胞
成体干细胞是在成体组织内具有自我更新能力并能分化产生一种或一种以上
子代组织细胞的未成熟细胞。 成年动物的许多组织和器官，比如表皮和造血系统，具有修复和再生的能力。 成体干细胞在其中起着关键的作用。 在特定条件下，成体干细胞或者产生新的干细胞，或者按一定的程序分化， 形成新的功能细胞，从而使组织和器官保持生长和衰退的动态平衡. 。
人类衰老之谜？
人一生的整个生命活动中，机体细胞时刻处于新生细胞替代衰老 退化细胞的过程中，当细胞更新速度小于细胞衰老速度时，产生更 新不足，机体就会出现衰老，表现为全身各系统功能下降，代谢缓 慢，外观衰老状态的出现。
.
“所有生物学的答案最终都要到细胞中去寻找， 因为所有的生物体都是，或曾经是一个细胞。”
干细胞的来源：胚胎干细胞、成体干细胞 干细胞来源：脐带和脐带血干细胞（属于成体干细胞）
区别： ※胚胎干细胞又称为万能细胞，来源少，取材存在伦理争议 且临床上有一定比例的“致瘤性”，存在一定风险；
※其他成体干细胞的活性稍差，但可针对性治疗重症疾病;
※脐带和脐带血干细胞为“零”岁细胞，细胞活性和稳定性高 ， .
零缺点。
针对皮肤： 使用表皮干细胞，分化成皮肤的成纤维细胞，使皮肤锁住水
分，保持弹性与水嫩；分化成巨噬细胞，改善皮肤基底层血液循 环，从而改善皮肤颜色；分泌大量生长因子，改善皮肤的颜色和 质地，包括皱纹、色素、斑点和毛孔等有持久而显著的改善。
针对全身机能：
使用多能干细胞，输注后随着随着血液循环到达人体的各个
影响，难以严格区分。
.
衰老是一种可以经过治疗而控制的 慢性、进行性、退化变质性疾病
.
潘迎紫
VS
（1945.6.5，66岁）
细胞工程胚胎干细胞培养2讲课文档
差别、诱导作用模式和微环境的未知因素等，而且可能与被诱导细胞本身的发育潜能和 对诱导剂的反应性等差别有关。
第二十八页，共55页。
ES细胞体外诱导分化途径可分为： -- 谱系分化（lineage differentiation），有利于认识组织
TRA-1-60、TRA-1-81: 肿瘤排斥抗原
AKP：碱性磷酸酶在小鼠及灵长类的ES细胞中活性较高，在已分化细胞中活 性明显降低；
Oct-4: 是生殖系专一性转录因子。作为和胚胎发育全能/多能性相 关的转录因子，Oct-4通过多种调控机制激活或抑制不同靶基因的转 录，在细胞的全能/多能性及未分化状态的调控和维持中发挥重要作 用。 端粒酶(telomerase):一类核糖核蛋白，与维持真核细胞染色体末端的 端粒长度和控制细胞寿命有关。人ES细胞的端粒酶活性高，而分化细胞 一般难以检测到；
人ES与EG细胞的形态学特征有所不同，与小鼠ES/EG也有所不同。 单层培养时，人体ES细胞呈扁平状群落，且细胞界限清楚。
第二十页，共55页。
（2）发育全能性和分化潜能鉴定
小鼠和包括人在内的灵长类动物全能或多能性胚胎性干 细胞，具有特有的表达标志以及在体内外的分化特点。
第二十一页，共55页。
小鼠与人类多能干细胞标记蛋白表达谱
第十七页，共55页。
无饲养层培养法：
饲养层细胞的制备在一定程度上使ES/EG细胞培养显得较繁杂。近 来以添加LIF生长因子或某些特定细胞的条件培养液至含FCS的正常 培养液，借此替代饲养层细胞： （1）直接在ES细胞基础培养液中加入重组LIF （2）Buffalo大鼠肝细胞条件培养液(BRL-CM) （3）2～3周幼年大鼠心肌细胞条件培养液(RH-CM)
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
人类胚胎干细胞基础培训教材HEN system office room 【HEN16H-HENS2AHENS8Q8-HENH1688】人类胚胎干细胞基础技术高级培训班2010-12目录1.绪论本操作手册将为您详细介绍人胚胎干细胞/iPS细胞培养的基础知识、技术细节及相关的产品信息。
目的是为了让您更好地培养您购买的细胞，请按照此手册进行培养操作直至获得可靠的冻存细胞。
上海斯丹赛生物技术有限公司专业提供各类胚胎干细胞/iPS细胞及成套产品服务，为您的干细胞研究提供一站式解决方案。
2.饲养层细胞的制备材料与仪器成纤维细胞完全培养基，货号EFM-01胰酶，货号M-005-1成纤维细胞冻存液（2x），货号EFFM-01基质胶（Matrigel matrix），BD Pharmingen，货号356235CF-1小鼠胚胎成纤维细胞（MEF），货号MEF-CF1-01T25透气培养瓶，NUNC，货号156367T75透气培养瓶，NUNC，货号1564992 ml移液管，NUNC，货号1596175ml移液管，NUNC，货号15962510 ml移液管，NUNC，货号15963315ml离心管，货号36603650ml离心管，货号373660冻存管，NUNC，货号377267Thermo-Fisher Finnpipette F3移液器和灭过菌的枪头生物安全柜，货号CO2培养箱，Thermo，HERA cell 150i电子计数器，millipore，货号PHCC00000电动移液器，Thermo Scientific Finnpipette C1，货号4580800低速离心机，Thermo Scientific CL10液氮罐，Thermofisher，货号CN509002.1从胎鼠获得小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）1. 拉断颈椎处死怀孕12-13天的CF-1小鼠，浸入70％的酒精中消毒。
2. 将小鼠放在超净台无菌的解剖盘中，在腹中线处做一横向切口。
3. 剪开的皮肤拉向切口的上下两侧，提起腹膜，将其剪开，充分暴露腹腔。
4. 找出子宫，一只手用无菌钝口镊子轻轻提起子宫，另一只手持无菌镊子小心分离子宫周围的结缔组织。
当两侧子宫都与其相连的组织分离好后，用剪刀将左右两侧的子宫在输卵管与子宫角的衔接处剪下，小心剪下子宫的联体部分，置于无菌的60mm 培养皿中。
5. 用无菌的剪刀在子宫头与子宫尾分别剪去输卵管及子宫角部分。
6. 将子宫置于15ml离心管中，用10mlPBS洗三遍。
7. 用尖镊子撕开子宫壁和胎膜，取出胎鼠，放在新的培养皿中。
8. 用8mlPBS 将胎鼠洗三遍。
9. 用灭菌的眼科剪刀去除胎鼠的胚囊，释放胚胎，并胚胎计数。
10. 将胚胎移到干净的培养皿中，PBS洗三次。
11. 用镊子小心的去除胚胎的头和肝脏，PBS洗三次。
12. 将胚胎转移至新的培养皿中，用无菌剪刀将组织充分剪碎，加入％胰酶同时吹打几分钟使其消化均一并彻底酶解。
13. 用同样体积的MEF完全培养基中和胰酶。
14. 一个T75瓶加10ml MEF完全培养基，按照每2-3个胚胎一个T75瓶，将已消化的胚胎加入培养瓶中，放在5％CO2培养箱中培养，培养瓶注明细胞名称，代数及日期。
2.2MEF的传代1. 将T75瓶中的MEF培养基吸出。
2. 加入大约3ml胰酶，于37℃的CO2培养箱中放置3-5分钟3. 取出瓶子，轻轻晃动，可以看见白色的细胞层开始从瓶子的底壁掉落。
确保瓶盖是拧紧的。
用手掌根轻拍瓶侧3-5次。
在灯下观察细胞是否已从瓶子上脱落。
4. 加入同等体积（3ml）的MEF培养基，混匀，吹打几次以形成单细胞悬浮液。
▲Note: 这一培养基是包含血清的，将会完全抑制胰酶的活性。
5. 补加42mlMEF培养基到瓶子中，使总体积达到50ml，混匀。
6. 将上述细胞悬浮液均分至5个新的T75瓶子中，每瓶10ml。
7. 放在5％CO2培养箱中培养，逐日观察。
2.3MEF的冻存1. 吸去培养液，加％胰酶至完全覆盖瓶底（以T75为例）。
2. CO2培养箱中孵育3-5分钟，不时轻拍瓶壁，使细胞层脱落。
3. 加入同等体积的MEF培养液中和胰酶，吹打混匀。
4. 将其转移至15ml离心管，用电子计数器进行细胞计数后，以1000rpm的速度离心5分钟。
5. 移去上清，用少量新鲜的MEF培养液重悬细胞沉淀。
6. 缓慢加入等量的MEF细胞冻存液（2x）并混匀。
7. 分装上述细胞悬液于2ml冻存管中，每管。
8. 在冻存管上注明细胞名称，代数，数目，冻存时间。
9. 将冻存管放到冻存盒中，-80℃冰箱过夜。
10. 最后将冻存管转移至液氮罐中以便长期保存。
2.4MEF的失活1. MEF传代到3－5代时，当细胞铺满培养瓶后（以T75为例），加3ml ％胰酶，放入37℃的CO2培养箱孵育3-5分钟。
2. 加入同等体积的MEF培养液中和胰酶，用移液枪吹打几次以形成单细胞悬浮液。
3. 将所有细胞悬液混合到一个50ml离心管中，补加适量新鲜的MEF培养液。
4. 取上述细胞悬液，转移至新的15ml离心管中，用培养液稀释，混匀。
5. 用电子计数器计数细胞。
6. 将原来的50ml离心管封口，使用gama射线辐照仪，50－80戈雷辐照。
7. 辐照完后，以1000rpm的速度离心5分钟。
8. 移去上清，用适量新鲜的MEF培养液重悬细胞。
用于培养人胚胎干细胞的饲养层细胞标准浓度是～30,000 cells/cm2。
按照此标准铺板。
具体铺板步骤请见3饲养层细胞的准备。
对于暂时不用的细胞，将其冻存，需要时复苏。
具体冻存步骤请见 MEF 的冻存。
3.饲养层细胞的准备材料和仪器CF-1小鼠胚胎成纤维细胞（MEF），货号MEF-CF1-01成纤维细胞完全培养基，货号EFM-01基质胶（Matrigel matrix），BD Pharmingen，货号356235CO2培养箱，Thermo，HERA cell 240Thermo-Fisher Finnpipette F3移液器和灭过菌的枪头T25透气培养瓶，NUNC，货号1563672 ml移液管，NUNC，货号1596175ml移液管，NUNC，货号15962510 ml移液管，NUNC，货号159633电动移液器，Thermo Scientific Finnpipette C1，货号4580800加入足量的基质胶均匀铺到瓶（或孔板或皿）底部，以能覆盖全部底部为准，譬如T25透气培养瓶以超过为宜。
37℃培养箱放置至少30min。
从培养箱中取出瓶（或孔板或皿），轻轻推送板子将未被基质胶覆盖的地方再次覆盖，然后立即吸弃基质胶。
加入适量成纤维细胞完全培养基（37℃预孵育超过10min），譬如T25透气培养瓶以加入4ml为宜。
从液氮中取出冻存的失活过的MEF细胞，立即投入37℃水浴中，迅速解冻（1min之内）。
根据预实验将相应数量的饲养层细胞加到之前已经准备好的瓶（或孔板或皿）中，混匀。
推荐的饲养层细胞密度为3万cells/cm2。
Point饲养层细胞需在ES/iPS细胞传代前两至三天准备。
饲养层细胞的密度最适宜是80－90％, 太密或是太稀疏都容易使干细胞分化。
请在铺被前先做预实验估算细胞的复苏存活率，以一个T25培养瓶计算，若存活率为90%，则铺入的细胞量应为万。
▲Note: 饲养层细胞铺了10天之后推荐不再使用。
培养容器的类型基质胶体积24-well35mmFlask105 cells/ml）4.ES/iPS细胞的复苏材料和仪器人类ES/iPS细胞（SiDSH -01, SiDSH -03），货号HIPS-01/03人类胚胎干细胞完全培养基，货号HESM-01-500CO2培养箱，Thermo，货号HERA Cell 240Thermo-Fisher Finnpipette F3移液器和灭过菌的枪头电动移液器，Thermo Scientific Finnpipette C1，货号4580800T25透气培养皿，NUNC，货号1563675ml移液管，NUNC，货号15962515ml离心管，NUNC，货号366036解冻人ES/iPS细胞，从液氮中取出冰冻的人类ES/iPS细胞冻存管，立即投入37℃水浴中快速的旋转以迅速解冻（控制在1min之内）。
▲Note: 水不要淹没瓶盖当只有一片冰晶存在时，从水中取出冻存管。
用消毒酒精棉将冻存管外壁擦拭一遍，以去除水缸中的微生物。
将细胞转移到一个预装有2ml人类胚胎干细胞完全培养基的15ml离心管中，混匀。
200×g（1000rpm）, 离心5 分钟。
吸弃上清液。
用4ml的人类胚胎干细胞完全培养基重悬细胞沉淀。
转移悬浮液到一个预铺有饲养层细胞的T25瓶中，补加人类胚胎干细胞完全培养基至总体积为5ml。
将瓶放入37℃的CO2培养箱中，观察细胞每天的生长情况。
Point复苏的第二天无需更换培养液，从第三天起每天更换新鲜的人类胚胎干细胞完全培养基。
复苏后第5天左右可以看见微小的克隆出现，之后逐渐长大。
复苏后第10-12天传代，具体情况视ES细胞生长情况而定。
5.ES/iPS细胞的传代材料和仪器人类胚胎干细胞培养液（含bFGF 货号 HESM-01-500 ；不含 bFGF 货号 HESM-02-500）Ⅳ型胶原酶（货号 M-001）已经包被好饲养层细胞的培养瓶/板Thermo-Fisher Finnpipette F3移液器和灭过菌的枪头T25透气培养皿，NUNC，货号1563675ml移液管，NUNC，货号15962515ml离心管，NUNC，货号366036电动吸引器Point当出现以下情况之一即可以进行细胞传代：1． MEF滋养层细胞生长超过两周。
2．克隆太大，或太密集。
3．当培养的ES克隆中出现越来越多的分化。
人的ES细胞传代（以T25培养瓶为例）从培养瓶中吸出旧的人胚胎干细胞培养液立即加入3-4ml的Ⅳ型胶原酶到瓶中，温柔的摇晃培养瓶使之覆盖到所有的细胞。
▲Note: Ⅳ型胶原酶需在37度预热。
将T25瓶重新放回37度培养箱中，放置约20min－30min。
消化期间可以处理预铺了饲养层细胞准备用来传代的新的培养瓶，处理如下：吸弃里面的成纤维细胞完全培养基，加入1ml人类胚胎干细胞培养液（不含bFGF）洗涤feeder（只要将瓶底盖过），吸弃，然后加入4-5ml新的人类胚胎干细胞完全培养基，以备传代。
待克隆消化下来后，取出培养瓶，将瓶中液体连同脱落的克隆转移到15ml离心管里。
加入2ml的人类胚胎干细胞培养液（不含bFGF），混匀。
待干细胞团块沉降下来后，吸弃上清液。
加入2ml新鲜的人类胚胎干细胞培养液（不含bFGF）洗涤细胞（即吹打重悬），待细胞沉降下来后，吸弃上清。