人类胚胎干细胞基础培训教材完整版

人类胚胎干细胞基础培

训教材

HEN system office room 【HEN16H-HENS2AHENS8Q8-HENH1688】

人类胚胎干细胞基础技术

高级培训班

2010-12

目录

1.绪论

本操作手册将为您详细介绍人胚胎干细胞/iPS细胞培养的基础知识、技术细节及相关的产品信息。目的是为了让您更好地培养您购买的细胞，请按照此手册进行培养操作直至获得可靠的冻存细胞。上海斯丹赛生物技术有限公司专业提供各类胚胎干细胞

/iPS细胞及成套产品服务，为您的干细胞研究提供一站式解决方案。

2.饲养层细胞的制备

材料与仪器

成纤维细胞完全培养基，货号EFM-01

胰酶，货号M-005-1

成纤维细胞冻存液（2x），货号EFFM-01

基质胶（Matrigel matrix），BD Pharmingen，货号356235

CF-1小鼠胚胎成纤维细胞（MEF），货号MEF-CF1-01

T25透气培养瓶，NUNC，货号156367

T75透气培养瓶，NUNC，货号156499

2 ml移液管，NUNC，货号159617

5ml移液管，NUNC，货号159625

10 ml移液管，NUNC，货号159633

15ml离心管，货号366036

50ml离心管，货号373660

冻存管，NUNC，货号377267

Thermo-Fisher Finnpipette F3移液器和灭过菌的枪头

生物安全柜，货号

CO2培养箱，Thermo，HERA cell 150i

电子计数器，millipore，货号PHCC00000

电动移液器，Thermo Scientific Finnpipette C1，货号4580800

低速离心机，Thermo Scientific CL10

液氮罐，Thermofisher，货号CN50900

2.1从胎鼠获得小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）

1. 拉断颈椎处死怀孕12-13天的CF-1小鼠，浸入70％的酒精中消毒。

2. 将小鼠放在超净台无菌的解剖盘中，在腹中线处做一横向切口。

3. 剪开的皮肤拉向切口的上下两侧，提起腹膜，将其剪开，充分暴露腹腔。

4. 找出子宫，一只手用无菌钝口镊子轻轻提起子宫，另一只手持无菌镊子小心分离子宫周围的结缔组织。当两侧子宫都与其相连的组织分离好后，用剪刀将左右两侧的子宫在输卵管与子宫角的衔接处剪下，小心剪下子宫的联体部分，置于无菌的60mm 培养皿中。

5. 用无菌的剪刀在子宫头与子宫尾分别剪去输卵管及子宫角部分。

6. 将子宫置于15ml离心管中，用10mlPBS洗三遍。

7. 用尖镊子撕开子宫壁和胎膜，取出胎鼠，放在新的培养皿中。

8. 用8mlPBS 将胎鼠洗三遍。

9. 用灭菌的眼科剪刀去除胎鼠的胚囊，释放胚胎，并胚胎计数。

10. 将胚胎移到干净的培养皿中，PBS洗三次。

11. 用镊子小心的去除胚胎的头和肝脏，PBS洗三次。

12. 将胚胎转移至新的培养皿中，用无菌剪刀将组织充分剪碎，加入％胰酶同时吹打几分钟使其消化均一并彻底酶解。

13. 用同样体积的MEF完全培养基中和胰酶。

14. 一个T75瓶加10ml MEF完全培养基，按照每2-3个胚胎一个T75瓶，将已消化的胚胎加入培养瓶中，放在5％CO2培养箱中培养，培养瓶注明细胞名称，代数及日期。

2.2MEF的传代

1. 将T75瓶中的MEF培养基吸出。

2. 加入大约3ml胰酶，于37℃的CO2培养箱中放置3-5分钟

3. 取出瓶子，轻轻晃动，可以看见白色的细胞层开始从瓶子的底壁掉落。确保瓶盖是拧紧的。用手掌根轻拍瓶侧3-5次。在灯下观察细胞是否已从瓶子上脱落。

4. 加入同等体积（3ml）的MEF培养基，混匀，吹打几次以形成单细胞悬浮液。

▲Note: 这一培养基是包含血清的，将会完全抑制胰酶的活性。

5. 补加42mlMEF培养基到瓶子中，使总体积达到50ml，混匀。

6. 将上述细胞悬浮液均分至5个新的T75瓶子中，每瓶10ml。

7. 放在5％CO2培养箱中培养，逐日观察。

2.3MEF的冻存

1. 吸去培养液，加％胰酶至完全覆盖瓶底（以T75为例）。

2. CO2培养箱中孵育3-5分钟，不时轻拍瓶壁，使细胞层脱落。

3. 加入同等体积的MEF培养液中和胰酶，吹打混匀。

4. 将其转移至15ml离心管，用电子计数器进行细胞计数后，以1000rpm的速度离心5分钟。

5. 移去上清，用少量新鲜的MEF培养液重悬细胞沉淀。

6. 缓慢加入等量的MEF细胞冻存液（2x）并混匀。

7. 分装上述细胞悬液于2ml冻存管中，每管。

8. 在冻存管上注明细胞名称，代数，数目，冻存时间。

9. 将冻存管放到冻存盒中，-80℃冰箱过夜。

10. 最后将冻存管转移至液氮罐中以便长期保存。

2.4MEF的失活

1. MEF传代到3－5代时，当细胞铺满培养瓶后（以T75为例），加3ml ％胰酶，放入37℃的CO2培养箱孵育3-5分钟。

2. 加入同等体积的MEF培养液中和胰酶，用移液枪吹打几次以形成单细胞悬浮液。

3. 将所有细胞悬液混合到一个50ml离心管中，补加适量新鲜的MEF培养液。

4. 取上述细胞悬液，转移至新的15ml离心管中，用培养液稀释，混匀。

5. 用电子计数器计数细胞。

6. 将原来的50ml离心管封口，使用gama射线辐照仪，50－80戈雷辐照。

7. 辐照完后，以1000rpm的速度离心5分钟。

8. 移去上清，用适量新鲜的MEF培养液重悬细胞。用于培养人胚胎干细胞的饲养层细胞标准浓度是～30,000 cells/cm2。按照此标准铺板。具体铺板步骤请见3饲养层细胞的准备。对于暂时不用的细胞，将其冻存，需要时复苏。具体冻存步骤请见 MEF 的冻存。