分离 实验报告

溶菌酶的分离纯化

姓名：杨兴旭学号：060516211

一、实验目的

（1）利用D152大孔弱酸性阳离子交换树脂提取纯化溶菌酶

（2）进行溶菌酶活力和比活力的测定（比浊法）

（3）进行溶菌酶纯度检测（SDS-PAGE）

二、实验原理

溶菌酶（lysozyme，简称 LZM）是由英国弗莱明在1922年发现的，它是一种有效的抗菌剂，全称为1,4-β-N-溶菌酶，又称作粘肽N-乙酰基胞壁

酰水解酶或胞壁质酶。活性中心为天冬氨酸

52和谷氨酸

35

，是一种糖苷水解

酶，能催化水解粘多糖的N-乙酰氨基葡萄糖（NAG）与N-乙酰胞壁酸（NAM）间的β-1，4糖苷键，相对分子质量14700 Da，由129氨基酸残基构成，由于其中含有较多碱性氨基酸残基，所以其等电点高达10.8左右，最适温度

为50 ℃，其最适PH在6～7左右。在280 nm的消光系数[

%

1

c m

1

A]为13.0。

该酶活性可被一些金属离子Cu2+、Fe2+、Zn2+（10-5～10-3M）以及N-乙酰葡萄糖胺所抑制，能被Mg2+、Ca2+（10-5～10-3M）、NaCl所激活。

溶菌酶广泛存在于动植物及微生物体内，鸡蛋(含量约为2 %～4 %)和哺乳动物的乳汁是溶菌酶的主要来源，鸡蛋的蛋清中含有丰富的上述物质，本实验以鸡蛋蛋清为原料，对溶菌酶进行提取并分离纯化。

大多数从蛋清中提取分离得到的溶菌酶，是一种碱性球蛋白有 4 对二硫键维持酶构型，其分子由 18 种共 129个氨基酸残基组成，分子量为14000 Da左右。其纯品为白色、微黄色或黄色的晶体或无定型粉末，无嗅，易溶解于水，不溶于丙酮、乙醚等。等电点PI为 10.7~11.0。

溶菌酶非常稳定，在 pH 值为 1.2~11.3 内剧烈变化时，其结构几乎不变。在酸性条件下，热稳定性很好。pH 值在 4~7时，100 ℃处理 1 min，仍保留较好的活力。但在碱性条件下，尤其当pH升至9时，溶菌酶耐热性较差，易变性。

溶菌酶常温下在中性盐溶液中具有较高天然活性，在中性条件下溶菌酶带正电荷，因此在分离制备时，先采用等电点法粗分离，D152大孔弱酸性阳离子交换树脂提取纯化溶菌酶，分光光度法测定酶活性及比活力，最后用SDS-PAGE鉴定。

三、实验材料、试剂及仪器

鸡蛋若干、D152大孔弱酸性阳离子交换树脂色谱柱、烧杯(100 mL,250 mL，1000 mL)、锥形瓶(100 mL)、玻璃棒、漏斗、定性快速滤纸、纱布、量筒（100 mL,250 mL，1000 mL）、10 mL 离心管、1.5 mLEp管、高速离心机、冰箱、SDS-PAGE电泳设备、电炉、紫外分光光度计

固体氯化钠（NaCl）；固体硫酸铵(NH

4)

2

SO

4

；固体磷酸氢二钠（Na

2

HPO

4

·12H

2

O）；

固体磷酸二氢钠（NaH

2PO

4

·2H

2

O）；固体磷酸钠（Na

3

PO

4

）；乙醇；蒸馏水；

甲醇；考马斯亮蓝；三氯醋酸；丙酮；溶菌酶标准品；N-乙酰葡萄糖胺；

硫酸铜；硫酸亚铁；硫酸锌；氯化镁；氯化钙；氢氧化钠；盐酸SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳试剂；聚乙二醇-20000、两性电解质

试剂配制：

30%丙烯酰胺贮存液：准确称取29.2g丙稀酰胺、0.8 g N,N’-甲叉双丙稀酰胺，加少量蒸馏水溶解后定再容至100mL。过滤，放纵于4℃冰箱保存。

分离胶缓冲液（1.5 mol/L pH=8.8 Tris-HCl 缓冲液）：取18.2 g Tris，加少量蒸馏水溶解，用1 mol/L盐酸调节pH至8.8（约48 ml）后，定容至100 mL。

浓缩胶缓冲液（0.5 mol/L pH=6.8 Tris-HCl 缓冲液）：取6.0 g Tris，加少量蒸馏水溶解。用1 mol/L盐酸调节pH至6.8（约48 mL）后，定容至100 mL。

4%浓缩胶（10 mL）：0.5mol/L pH=6.8 Tris-HCl 2.5mL,胶贮液1.3 mL，10%SDS 100 ul，TEMED 10 ul，10% AP 100 ul，双蒸水6.1 mL。

12%分离胶（20 mL）：1.5 mol/L pH=8.8 Tris-HCl 5 mL,胶贮液8 mL，10 % SDS 200 ul，TEMED 8 ul，10 % AP 200 ul，双蒸水6.6 mL。

pH =8.3 Tris-Gly电泳缓冲液：Tris6 g、glycine 28.8 g、SDS 1 g，加

少量蒸馏水溶解，pH调至8.3，定容至1 L。

考马斯亮蓝染色液：1.25 g考马斯亮蓝R250、450 mL甲醇：水（1：1）50 mL冰醋酸。

脱色液：450 mL甲醇：水（1：1）、50 mL冰醋酸。

0.02 mol/L PBS(pH=8.0)：取5.3mL 0.2M NaH

2PO

4

溶液，94.7mL 0.2 M NaH

2

PO

4

溶液，加蒸馏水稀释至1000 mL，混匀

四、实验方法

溶菌酶提取纯化：D152大孔弱酸性阳离子交换树脂提取纯化

离子交换法是根据溶液中被分离物质的带电差异，而与离子交换剂之间结合力的大小差异，达到分离纯化目的的操作技术。由于该方法具有良好的生物相容性、简便、高效、且可自动化连续操作等优点，是溶菌酶生产的常用方法。溶菌酶为碱性蛋白质，等电点为 10.7～11.0，蛋清中其他主要蛋白质等电点均低于

6.0，因此根据与其他蛋白质等电点的差异，选用离子交换法进行溶菌酶的提取。

溶菌酶等电点为较高，在蛋清中带正电荷，因此应选用阳离子交换树脂进行吸附。

强酸性阳离子交换树脂的主要交换基团为-SO

3

H，由于强阳离子交换剂与酶作用较强，在洗脱过程中，溶菌酶难以洗脱，且易导致蛋白质的变性。

溶菌酶活力比活力测定：溶菌酶活力和比活力的测定（比浊法）

比活力测定：采用分光光度法。溶菌酶在 281nm 波长处有最大吸收峰，制备不同浓度的溶菌酶溶液，在 281nm 波长处测定吸光度，并绘制标准曲线，可求出标准曲线回归方程。

溶菌酶酶活力测定方法采用比浊法。溶菌酶能水解溶壁微球菌，使菌悬液在450nm波长处的吸光度下降。以此测定溶菌酶酶活力。

酶活力定义:在 25 ℃下，pH值6.2时，每分钟溶壁微球菌菌悬液OD

450

值下降0.001为一个活力单位（U）。

溶菌酶纯度检测：溶菌酶纯度检测（SDS-PAGE）

五、实验步骤

1、溶菌酶的粗提取