条件治病菌之(粪)肠球菌研究观察

条件致病菌肠球菌

摘要：肠球菌不像大多数的乳酸菌一样，它不被认为是“安全可靠”（GRAS）。对于肠球菌的安全评价仍存有争议。虽然肠球菌被认为是“积极“或在奶酪技术中有用，但它的隔离种群已经作为对人类的条件致病菌出现。因此，这些细菌对发酵乳制品是否有益处于似是而非的地位，以为它存在有潜在的危险。本篇综述是概述了肠球菌的积极的和消极的两种特性，并举例说明这个菌的具有争议的特性。根据食品安全评价准则，我们提出对于每个潜在的技术应变逐个进行评估，并且建议肠球菌在发酵食品中使用前进行个别研究。

1.简介

肠球菌最初列为D群链球菌，这种分类可以追溯到由兰斯菲尔德建立的计划。1984年，肠球菌给予了新的位置被列为肠球菌属，在经过DNA-DNA和DNA-RNA杂交的研究后证明它与链球菌属有较远的关系(Schleifer and Kilpper-Balz, 1984)。到目前为止32种已被提议列入肠球菌属（2005年10月26号)。肠球菌种适宜在6.5％氯化钠，40％胆汁盐且pH值在9.6，并可以在60°C的环境下生存30分钟。大多数品种也可以在10℃至45℃之间生长(Moellering,1992;Flahautet al.,1996)。粪肠球菌和屎肠球菌都是人类消化道微生物自然存在的菌种，在胃肠道中因为个体差异其含量差异变化很大（在每克消化系统内容物中含有102和108）。肠球菌通常从食品、植物、水和土壤中分离，可能由于它的来源是粪便使得他们的天性在恶劣环境中比较耐受(Giraffa,2002)。在牛奶和奶酪制品中通常会找到粪肠球菌、屎肠球菌和少量的坚忍肠球菌，偶然也会发现小肠肠球菌和铅黄肠球菌。不同于其他乳酸菌，肠球菌不能被认为是“一般认为安全”（GRAS），并且它在水中检测是作为粪便污染物的指标的(Godfree et al.,1997)。一般认为对于肠球菌的安全评价程序是一个模棱两可的状况。一方面，肠球菌在作为奶酪技术中作为发酵培养物被认为是由积极作用的(Giraffa,2003)；另一方面，它们被认为是新兴的人类病原体(Moellering,1992)。这篇综述主要是根据现有知识总结了肠球菌的积极和消极的性状，来强调这种菌属的争议性。食品安全准则着重强调了对抗生素耐药性和毒力的因素，这样使我们建议在发酵食品中使用肠球菌前应对这几项进行研究。

2．分类和鉴定

由于肠球菌的表型多样性，这使得肠球菌种的生理测试鉴定一直存在问题(Devriese et al.,1993;Park et al.,1999)。此外，物种鉴定的常规实验往往需要很长的培养时间(Facklam et al.,2002)。使用16S和23S rDNA基因的基因型鉴定方法更加的准确，虽然它们还不能区分所有肠球菌的物种（例如鹑鸡肠球菌和铅黄肠球菌有99.8%的16S rDNA的同源性）。这种方法已经成功的在应用：1）rRNA基因间隔区的特异PCR扩增技术(Naimi et al.,1997)，ddl和van基因(Satake et al.,1997;Kariyama et al.,2000)，ace 基因(Duh et al.,2001)，sodA 基因(Jackson et al.,2004)，2）转录调控基因Ef0027的扩增(Liu et al.,2005)，3）ddl 基因(Ozawa et al.,2000)，cpn60 基因(Goh et al.,2000)和atpA 基因(Naser et al.,2005)的测序，和4）利用5‘端引物（GTG）的细菌基因组重复序列PCR技术(Svec et al.,2005)。

有许多人试图区分从人分离的菌株和从食物分离的菌株,大部分主要关注的DNA指纹图谱。这些研究使用了多种分子分型方法，如扩增rDNA限制性分析（ARDRA）(Ulrich and Muller,1998)，脉冲场凝胶电泳（PFGE）的DNA宏观限制模式(Deschee-maeker et al.,1997;Gambarotto et al.,2001;Vancanneyt et al.,2002)，随机扩增多态性DNA（RAPD）- PCR检测(Cocconcelli et al.,1995;Descheemaeker et al.,1997;Andrighetto et al.,2001;Cosentino et al.,2004;Martin et al.,2005)和扩增片段长度多态性（AFLP）技术(Antonishyn et al.,2000;Willems et al.,2000;Vancanneyt et al.,2002)。脉冲场凝胶电泳（PFGE）已成功地用于表现临床和食品株之间的差异，以及从家禽和住院患者分离的菌株

的差异(van den Braak et al.,1998;Lemcke and Bulte,2000)。虽然电泳是区分肠球菌属菌株的黄金标准方法，但是它比较昂贵且耗时和比较复杂。最近，有两种方法被证明比PFGE更有辨识力，一种是基于管家基因的核苷酸序列的多位点序列分型（MLST），另有一种是基于可变数目串联重复序列的多位变量分析（MLVA）(Homan et al.,2002, Top et al., 2004, Titze-de-Almeida et al., 2004)。例如，411株屎肠球菌的种群结构（来自于不同大洲和生态位），通过这种方法分析表明，大多数源自医院的万古霉素抗药性肠球菌被叫做C17复合体都是单一无性系(Willems et al., 2005)。MLSA是屎肠球菌株的流行病学分析的一种极好的方法，它与MLVA都能很好的替代PFGE。尽管肠球菌的分子分型方法在很大范围内都有效，并且MLST的流行病学分析方法都是很有效的方法，但它们仍然难以明确区分食品株系和临床株系。

3. 肠球菌在乳制品中的作用

奶酪中肠球菌的使用备受争议。在南欧国家中肠球菌对于奶酪风味的影响是必要的因素（表1），但在北欧大多数国家中对这持否定的态度。这些不同的观点可能仅仅是由于文化差异。一些研究表明，乳品株肠球菌对于传统奶酪成熟具有积极的作用(Franz et al., 1999; Giraffa, 2003;FoulquieMoreno et al., 2006)。肠球菌污染牛奶要么是直接来自于动物粪便，要么是间接的来自污染的水源，挤奶设备或者是散装的储存罐(Giraffa, 2003)。在地中海式奶酪凝乳中肠球菌的范围从104到106CFU/g，而在完全成熟的奶酪菌落数达到105到107CFU/g(Macedo et al., 1995; Bouton et al., 1998; Centeno et al., 1999)。在牛奶制品中经常课分离出粪肠球菌和屎肠球菌(Franz et al., 1999; Gelsomino et al., 2001)。坚忍肠球菌也经常在奶制品中分离出来(Suzzi et al., 2000; Andrighetto et al., 2001; Cosentino et al., 2004)，但往往被低估，它过去可能是一种错误的鉴别。肠球菌对于奶酪的成熟和香气的形成都有很大的帮助，例如切达干酪、羊乳酪、Water-buffalo、Mozarella、Cebreiro、Venaco和Hispanico都是由于他们蛋白水解和酯水解和他们通过柠檬酸盐的新陈代谢产生的双乙酰产品(Centeno et al.,1999; Tsakalidou et al., 1993; Centeno et al., 1999)。除了他们的工艺性能，许多的肠球菌株（主要是粪肠球菌和屎肠球菌）生产的细菌素能够抑制李斯特菌、金黄色葡萄球菌、肉毒梭菌、产气荚膜梭菌和霍乱弧菌(Giraffa et al., 1994; Maisnier-Patin et al., 1996;Nunez et al., 1997; Simonetta et al., 1997; Ennahar et al., 2001;Laukova and Czikkova, 2001; Sarantinopoulos et al., 2002b;Leroy et al., 2003)。由于他们在奶酪成熟、风味形成和细菌素的生产的作用，表明了这个具有理想的技术和代谢特点的肠球菌可以用做各种奶酪的发酵剂培养物(Villani and Coppola, 1994; Giraffa, 1995; Centeno et al., 1999; Sarantinopoulos et al., 2002a)。对于肠球菌在奶酪的消极作用可能是由于它们能够生产生物胺。在生产奶酪和发酵香肠时产生的生物胺中一些肠球菌株被定义为有害的(Gardin et al., 2001; Connil et al., 2002;Giraffa, 2002)。

鉴于其共生的状态，肠球菌也被用来作为人或家畜的益生菌(Tannock and Cook,2002)。益生菌发酵乳商业上称为Gaio，这里面包含有是肠球菌菌株，在丹麦已经商业化(Tamime, 2002)。肠球菌SF68已被用来治疗腹泻，并可以替代抗生素的治疗(Bellomo et al., 1980)。另一种肠球菌的益生菌的使用是CausidoR培养，它包括嗜热链球菌和粪肠球菌两种菌株。然而，作为一种益生菌肠球菌或作为奶酪的起始发酵的使用仍存在争议，这是因为它的耐药性和毒力基因对人类仍有风险(Franz et al., 2003)。2004年，加拿大禁止了益生菌肠球菌的使用。

4.肠球菌和人类的健康

4.1肠球菌为条件致病菌

虽然肠球菌已经使用了几个世纪，并没有明确地把它作为剧毒的有机体。他们现在已经成为全球院内感染的重要原因(Murray and Weinstock, 1999)。在美国肠球菌是引起医院血液感染的第三大最常见原因(Wisplinghoff et al., 2004)，在欧洲排第四。肠球菌的感染主要是粪肠球菌和屎肠球菌引起的，其中临床菌株分别高达80%和20%(Huycke et al., 1998; Reynolds et al.,