免疫胶体金标记手册

浙江大学电子显微镜室浙江大学生物技术研究所胶体金免疫标记技术培训班

技术资料

胡东维洪健徐颖

浙江大学

２001年10月

一、胶体金得制备

根据不同得制备方法,可以制备出直径１-500nm得胶体金粒子,但做为免疫标记探针,其直径应在3－3０nm范围内。

在氯化金(HAuＣl4)水溶液中加入还原剂使之还原并聚积形成胶体金粒子。使用不同种类、不同剂量得还原剂,可以控制所产生得粒子大小。即粒子大小取决于反应溶液中最初还原试剂与还原核得数量。还原剂浓度越高,核浓度也越高,氯化金得还原也就从更多得还原中心开始,因此产生得胶体金粒子数量越多,但体积也越小、粒子直径每增加一倍,数量减少为原来得1／8。

以柠檬酸钠与单宁酸做还原剂,能够制备大小相对一致、直径3～1６nm得胶体金。因此一般胶体金探针均使用该方法进行。但该方法制备得胶体金粒子直径范围较窄,而且残留得多聚单宁酸残基往往干扰某些蛋白与金粒子得结合。此时在溶液中添加0、１～0.2%得H2Ｏ２能够去除这些残基、双标记或制备5—10 ｎm得胶体金时建议使用该方法。

利用柠檬酸为还原剂,可以制备1２~150 nm直径得胶体金。但制备大体积得胶体金时,胶体金粒子得误差也同时增加、因此做单标记时,建议使用该方法制备１2—１6 ｎm直径得胶体金、

除了上述方法外,也可以用磷作为还原剂来制备5 ｎm得胶体金,它避免了单宁酸残基得问题,但所形成得金粒子体积变化较大。磷易燃且有毒,制备得残液需进一步处理,故该方法已经很少使用。

氯化金极易吸湿,故一般均以小剂量密封保存(０、５g或1ｇ),因此在配制氯化金溶液时一次配完,暂时不用得可以用1.５ml试管分装为1 ml保存(-20℃)。注意各种玻璃器皿一定要洗净并用双蒸水多次冲洗,有条件时可硅化处理(1%双氯硅烷/氯仿浸泡1小时,烘干)。配制各种试剂时均使用双蒸水,随后再用０.２２ m微孔滤膜过滤后使用。三角瓶可反复多次使用,不用时应密封保存,以防污染。

制备好得胶体金保存寿命较长,可4℃保存6个月以上或室温下保存1-２个月、当出现明显悬浮物或沉淀后表示已不可再用。但无论无何,在保存较长时间后应进行镜检,如出现大量胶体金粒子凝集,说明已经过期。

1、单宁酸/柠檬酸钠法制备3～１6nm胶体金

(1)取一250ml三角瓶,加入79 ml双蒸水与1 ml１%氯化金,预热至60~70℃。

(2)取一5０ml烧杯,加入4 ml １％柠檬酸钠,然后根据所制备金粒子体积大小加入

不同用量得单宁酸及等量得2５mM Ｋ２CO3。预热至6０～７0℃、K2CO３得作

用就是保持溶液得中性pH。因此如果单宁酸得量少于0.５ml时,对ｐH得影响不大,Ｋ2CO3可以省略、

(3)将上两种溶液迅速混合并充分混匀,加热至沸并保温1０分钟、自然冷却。

柠檬酸钠(ml) 单宁酸( l) 胶体金(nm)

4 500０ 3

4 2０00 4

4 5０0 6

4 120 ８

4 70 １0

４10 １6

2、白磷还原法制备5 ｎｍ胶体金

(1)取25０ml三角瓶一个,加7９ml双蒸水,1 mｌ1％氯化金,并用0、25 ＭK２C

Ｏ3将溶液调至中性(pH7。0)。

(2)取０、2 ｍｌ饱与磷/乙醚溶液加到1、5 ml试管中,再加0.8 ml乙醚,混匀。取0。

７ml加入溶液(１)中(磷有毒且易燃,操作请带手套,多余得磷溶液用CuSO4进行中与)、

(3)室温下轻轻摇匀15min,然后加热沸腾并保持5 mｉn,自然冷却、

3、柠檬酸三钠法制备12－30 nｍ胶体金(Frｅns, 1973)

(1)取250mｌ三角瓶一个,加１0０ｍl双蒸水及１ml 1%氯化金,加热沸腾;

(2)取不同量得1%柠檬酸钠加入上述溶液中、混匀,再保持沸腾３０ｍｉｎ,溶液颜色

首先变黑,再逐渐变红,粒子体积较小时,溶液呈桔红色,而粒子体积较大时,则颜色偏向紫色。

柠檬酸钠(ml) 胶体金(nm)

5 12

4 16

3 24

2、8 30

注意:

(1)由于使用试剂质量及其它方面可能存在得误差,以及制备过程中得其它问题,胶体金粒子得大小

及一致性与理论值可能有偏差,因此,在制备完成后必须进行镜检、如出现粒子体积偏差太大,粒子凝聚,粒子边缘不清晰等问题,须重新制备。

(2)胶体金溶液最好保存在4℃冰箱中;也可保存在室温下,一般可保存１—2个月。但决不可保存在

0℃以下,否则金粒子发生凝聚。

二、蛋白-金复合体得制备

一般认为胶体金粒子表面为一层AuCｌ2,因此,粒子表面带有负电荷,这种负电荷粒子之间相互排斥,形成稳定悬浮得胶体金溶液。

金颗粒表面可以包被一层生物大分子(如蛋白)来稳定与保护这些粒子,以免受外来电解质得影响而相互凝聚在一起。胶体金粒子对蛋白得吸附作用取决于pH值,这就是因蛋白得净电荷取决于溶液得pH值,在ｐH=pI时为中性。由于在pＨ=pI时蛋白溶解度最小,因此这时它水化程度最小,最溶液吸附到疏水得金粒子表面、但在实际得胶体金探针制备中,一般胶体金调整为pＨ=PI+0.5,这样蛋白带正电,有利于结合更稳定、

胶体金探针所用蛋白必须要经过前处理,其目得在于(1)去除高浓度得盐分,高浓度得盐分往往干扰蛋白与胶体金得吸附结合,或导致胶体金粒子得凝聚,这一步往往采用低浓度缓冲液中进行。(2)使蛋白分子尽量分散为单体,冻干蛋白或高浓度蛋白溶液中蛋白分子往往凝聚为多聚体大分子,可同时与多个胶体金粒子结合,影响标记得灵敏度与定量分析。(3)使蛋白具有适当得分子量。蛋白分子量过小(30 ｋＤ),形成得蛋白复合体往往就是不稳定,可短时间内失活。而分子量过大时,被认为影响探针得灵敏度,特别就是已知蛋白得结构与活性中心得情况下,去除对活性武影响得结构部分就是提高标记灵敏度,延长探针寿命(防止凝集)得有效办法、把分子量过小得蛋白与其它蛋白(如ＢSA,牛血清蛋白等)结合后,能制备出稳定性更佳得探针。

当蛋白前处理完成后,接着要确定胶体金与蛋白结合得最佳pH值。对于理化性质不确定得蛋白这一步尤为重要。过量得蛋白与不同pH值得胶体金结合后,只有某一特定pH值能够形成结合最稳定得探针。在高浓度电解质(如NaCl)作用下不会凝聚。不同蛋白得适宜pH范围得宽窄大不相同。一般选择最小适宜pH值为最佳ｐH值。但有些探针得实际情况并不完全如此,最稳定发探针并不完全代表活性最好。这要靠实验验证。

在确定最佳pH值后,最后要确定最小蛋白量,即能够形成稳定探针得蛋白得最小量。如果在制备探针时加入太多得蛋白,不仅造成浪费,而且更为严重得就是容易造成探针凝聚,并严重影响标记活性。因为探针溶液中得游离蛋白容易抢先与标记位点结合,起到“封闭”(Bl ｏｃkｉng)作用,而胶体金探针标记不上。在标记位点希少、被标记物含量较少得情况下要特别注意。

这里需要特别指出得就是,使用不同直径得胶体金与同一蛋白结合时,除了蛋白量完全不同外,往往最佳pH也有一定变化。

因此,在探针制备每一环节应随时监测探针对分布情况、负染结合及活性。

1、抗血清得前处理

一般抗血清中IｇG得含量为１0－２5％,而绝大部分为其它蛋白。用抗血清直接制备探针其标记活性与特异性均不理想、因此需去除其中多数杂蛋白、但处理环节不宜太繁,