973课题结题报告

973课题结题报告
课题名称：大豆重要新基因的发掘与有效利用研究
课题编号：TG1998010206
负责人：喻德跃
承担单位：南京农业大学、中国农科院品资所、吉林省农科院协作单位：中国科学院遗传发育所
2003年10月15日
一、计划任务完成情况
（一）计划任务
本课题的任务：
发掘大豆抗花叶病毒、抗食叶性害虫、产量有关性状、育性恢复系等新基因，明确遗传规律，并进行标记和定位。

具体指标如下：
１、抗大豆花叶病（ＳＭＶ）基因方面：
（1）标记到2－3个抗性基因, 纳入遗传图谱;
（2）育成抗性品系１－２个,作为育种新种质。

２、抗食叶性害虫基因方面：
（1）标记到１－２个抗性主基因,纳入遗传图谱;
（2）育成抗性品系１－２个,作为育种新种质。

3、产量有关性状基因方面：
（1）标记到3－4个产量有关性状的基因位点,纳入遗传图谱;
（2）育成具2-4种特异性状的优良共同遗传背景家系(类似近等基因系),用于聚合重组。

4、质核互作雄性不育恢复基因方面
筛选与恢复基因紧密连锁的分子标记〈10cM，对恢复基因进行定位。

5、发表SCI引用论文五篇以上。

（二）完成情况
本课题鉴定出一批新的基因资源，包括：抗SMV（133份）、感SMV（122份）、抗食叶性害虫（9份）、感食叶性抗虫（10份）、产量性状（8份）、恢复系（10份），建立了重组近交家系群体（RIL）8个。

定位了9个新基因，获得分子标记
10个，培育一批有育种价值的中间材料。

共计发表论文25篇，其中SCI收录6篇，国际特邀报告5篇,专著1部,培养研究生11人。

总体上超额完成了任务目标。

（三）主要进展
1、资源鉴定与群体培育
（1）抗大豆花叶病毒（SMV）方面
鉴于国内大豆SMV株系鉴别寄主体系的混乱，在已经使用过的25个鉴别寄主中选拔出8个代表性寄主组成一套新的鉴别体系。

在长江中下游地区广泛采集病样（近300个样），以寄主鉴定为主、结合SMV的组织印迹检测技术和RT-PCR 检测技术，发现自20世纪80年代至今，SMV群体已经产生根本改变，尚未发现原先鉴定过的株系。

根据新鉴别体系的鉴定结果，确定了10个新株系（SC-1至SC-10），其中SC-8为强毒性株系群。

发现：SMV株系群组成复杂，同一株系群在不同地区的流行存在差异，同时不同株系群在同一地区的分布也有所不同。

综合1998-2002年的分析结果，认为：在株系组成上，黄淮地区以SC-3和SC-7为主。

长江中下游地区以SC-9为主。

测定了106份大豆品种（品系）对SC-7 、SC-8、SC-9三个株系群的抗性反应，筛选出17份对三个株系均表现高抗的材料；18份能兼抗三个株系中的两个株系的材料。

构建了抗X感杂交组合衍生的RIL群体：科丰1号X南农1138-2，F7：12，206个家系（见表1）。

用东北3号株系（SMV3）对355份大豆种质资源进行了SMV抗性鉴定（包括“七五”初鉴抗SMV材料40份，“八五”初鉴抗SMV材料91份，各地推广品种
100份，农科院品资所新育成的品系35份，美国引进材料42份，韩国引进材料36份，泰国2份，日本1份）。

共筛选出116份高抗资源，117份中抗材料，122份高感资源。

（2）抗食叶性害虫基因方面
综合1993-2002年的田间鉴定结果，获得一批高抗食叶性害虫和高感食叶性害虫的大豆种质。

高抗（HR）的品种9份：黄皮小青豆、日本、Larmar、PI227687、矮杆黄、York、阜阳170、SP26、早16号，抗（R）的品种15份，表现中间（M）的品种17份，感（S）的品种7份，高感（HS）的品种10份：大浦大粒黄、中豆19、南农86-4、南农86-4、江宁中老鼠豆、监利牛毛黄、花柒黄毛豆、沔阳白毛豆、吴江青豆、PI229358。

合成重组近交家系群体2个，包括：先进2号（感）X赶泰-2-2（抗）已推进到F7：9世代，含162个家系；和皖82-178（感）X 通山薄皮黄豆甲（抗）也推进到F7：9代，含159个家系（见表1）。

（3）产量性状基因方面
获得了与提高产量潜力有关的资源8份，包括百粒重高（>40ｇ）、主茎节数多（>30）、短叶柄(<10cM)、曲茎、顶生长花序等。

，175个家系）；
构建了RIL群体2个，包括：南农87-23 X NG94-156（F
7：8
波高（963069）X NG94-156（F7：8，156个家系）。

（见表1）
（4）恢复基因方面
获得利于大豆杂种优势应用的恢复系：10个。

阐明了细胞质不育的遗传模式：以栽培大豆不育系YA、保持系YB和含有
不育细胞质的原始母本167为基础材料，配制了二个单交组合，四个三交组合，根据后代的育性和分离比例判断遗传模式。

试验结果表明：S(Rfrf)基因型F1花粉为半不育，F2可育与半不育分离比例为1：1；母本为不育细胞质S 时，携带rf的雌配子有生活力，能传给后代，而携带rf的雄配子无生活力，不能传给后代。

母本为正常可育细胞质N时，携带rf的雌、雄配子均有生活力，可传给后代。

分离比例是单基因遗传模式。

因此该不育系属“单基因配子体不育”，即不育性由不育细胞质基因S和一对隐性基因rfrf控制，一个显性基因Rf的存在即可恢复育性。

明确了育性的稳定性：利用人工气候箱，设不同温度和光照长度处理，研究野生型大豆细胞质雄性不育系OA和保持系OB的育性稳定性。

鉴于试材原产于高温短日照的夏大豆区，本试验以14小时光照和昼夜温度30℃/20℃为对照处理，在14小时不变光照条件下，温度处理为35℃/25℃，30℃/20℃，25℃/15℃；在昼夜温度固定为30℃/20℃条件下，光照处理为15.5小时，14小时，12.5小时。

在上述所有处理中，不育系OA花粉败育率均保持在99%以上。

只有保持系在15.5小时光照时，花粉败育率上升到14.3%，这一结果表明，不育系OA在温度与光照大幅度变化的情况下，不育性极为稳定。

从细胞学方面明确了不育发生的时期：细胞学观察发现该不育系小孢子减数分裂正常，绒毡层亦无明显异常，不育发生的时期是在单核期以后。

表1 本课题培育的RIL 群体
2、新基因发掘与分子标记
抗大豆花叶病毒（SMV）基因方面通过对P1（科丰1号）、P2（南农1138-2）、
F
1和F
7：11
184个家系的田间抗性鉴定和遗传分析，发现科丰1号对SMV株
系群SC-7、SC-8、SC-9的抗性分别由一对显性基因控制，并将Rsc-7、Rsc-8、Rsc-9基因定位于N8D1b+W连锁群上，与已经定位的三个抗性基因（Rsa、Rn1、Rn3）位于同一连锁群，成簇排列。

此外，筛选到与抗性基因连锁的SCAR 标记和RAPD标记，距Rsa和Rsc的距离分别为16.1和9.7cM。

由于SC-7、SC-8、SC-9是新鉴定的SMV株系群，而鉴定的抗性基因位点与已经发现的SMV抗性位点位置不同，因而初步认为：Rsc-7、Rsc-8、Rsc-9 是新的抗SMV基因。

此外，选育出NJR25-8、NJR32-8、NJR-44-1等综合性状优良、抗性好的中
间材料。

利用高抗SMV3号株系的大豆品系95-5383与感病品种（品系）HB1，铁丰
21，Amsoy，Williams，和抗病品种PI486355配制杂交组合，对各组合的F
1、F
2
代接种SMV3号株系进行抗性鉴定，结果表明，95-5383与各感病品种的杂交组合F1代表现为感病，抗病为隐性，F2群体分离比例为1R：3（S+N），表明95-5383对SMV3号株系的抗性是受一对隐性基因控制。

PI486355X95-5383的F2代有感病植株分离，95-5383的抗病基因与PI486355不在同一位点。

利用BSA法对95-5383⨯HB1的99株F2个体进行鉴定，筛选出与SMV抗病基因紧密连锁的共显性RAPD标记OPN11980/1070。

RAPD引物OPN11在95-5383和抗池扩增出OPN11980片段，在HB1和感池扩增出OPN111070片段，在F1同时扩增出OPN11980和OPN111070。

用该引物分析95-5383⨯HB1的F2个体，共显性的RAPD标记
OPN11
980/1070
与抗病基因的遗传距离为2.1cM。

从95-5383和HB1中分别回收OPN11980和OPN111070特异片段，序列分析结果表明OPN11980和OPN111070的实际长度分别为986bp和1084bp，同源性为93.4%，主要差别是在两个不同区段插入（缺失）54bp和35bp的碱基。

用克隆的RAPD 片段OPN11980作探针（SOPN11）对亲本基因组DNA进行Southern 杂交，结果表明OPN11980和OPN111070在大豆基因组中是以低拷贝形式存在。

根据克隆片段
OPN11
980和OPN11
1070
的序列设计合成了一对SCAR引物SCN11，SCN11在95-5383、
HB1和95-5383×HB1的F
2
群体扩增结果与RAPD引物OPN11完全吻合。

用RAPD引物OPN11和RFLP探针SOPN11分析科丰1⨯南农1138-2重组近交群体（南京农业大学/中国科学院遗传发育所联合构建），将OPN11和SOPN11定位于F连锁群的抗病基因簇上。

由于95-5383⨯PI486355的F2代接种后有感病植
株分离且抗病基因位于F连锁群上与Rsv1不等位，表明可能定位的是新的抗病基因。

此外，用OPN11分析了68份抗性资源，其中有25份扩增出OPN11980，表明这些品种可能携带与95-5383相同的抗性基因，而其它扩增出OPN11980/1070和的抗性品种可能携带不同于95-5383的抗性基因。

OPN11
1070
（2）抗食叶性害虫基因方面
阐明大豆对食叶性害虫的抗性属于两对主基因加多基因的遗传模型。

应用皖82-178 X通山薄皮黄豆甲衍生的RIL群体在田间对纵合虫种进行鉴定，发现大豆对食叶性害虫综合虫种的抗性由两对主基因加多基因控制。

两对中效应较大的一对加性效应为10.5-10.7 (叶面积损失率, %), 效应较小的一对加性效应为4.4-7.2 (叶面积损失率, %), 而且两对主基因的遗传率较高, 达81.1-94.1%,多基因的遗传率较低, 为0-12.2%。

同样，应用皖82-178 X通山薄皮黄豆甲衍生的RIL群体在室内对单一虫种斜纹夜蛾进行养虫试验，也发现大豆对该虫种的抗性由两对主基因加多基因控制，主基因的遗传率为51.4%。

抗虫基因（QTL）有关的分子标记及定位。

应用皖82-178（感）×通山薄皮黄豆甲（抗）衍生而成的重组自交系群体（140个家系）开展养虫试验，研究各家系对斜纹夜蛾发育的影响，发现各家系对斜纹夜蛾发育的影响差异很大。

采用178对SSR引物筛选亲本间的多态性，除无带的引物外，亲本间有多态的引物有52对，然后用这52对引物逐一筛选群体单株，对表型值（幼虫重、蛹重）与标记值作相关分析，找到与控制大豆抗虫QTL相连锁的SSR标记 Satt135、Satt363、Satt442，分别位于D2、H、C2连锁群上，其中Satt442可以解释8.7%的变异。

而这些标记与所发表的抗玉米穗螟（美国大豆的重要食叶性害虫）基因的标记在
遗传图谱上的位置不同，因而认为可能与新的抗食叶性害虫基因有关。

此外,选育出NJ89-30等优良抗虫品系。

（3）产量性状基因方面
遗传分析表明，曲茎亲本NG94-156的基因型可能是sb1sb1sb2sb2，直茎亲本NJ90L-2的基因型可能是Sb1Sb1sb2sb2或sb1sb1Sb2Sb2，NJ87-23、963069的基因型可能是Sb1Sb1Sb2Sb2。

公交7622-4-1-4的短叶柄性状由一对隐性基因控制。

而株高、节间长度、叶形这3个性状的遗传在大多数群体中都符合2对主基因加多基因的遗传模型。

曲茎、短叶柄性状基因的分子标记与定位：用260个RAPD随机引物对三个组合的4个亲本（南农88-31、波高、南农87-23、NG94-156）进行了初步筛选，后用父、母本分别为NG94-156和波高的RIL后代家系（157个家系）进行筛选，发现其中有1个引物S-506扩增出的多态性条带有较好的重复性。

经过连锁分析，发现RAPD标记S-5061600与曲茎基因的遗传距离为6.94cM。

此外，应用181对SSR引物筛选波高和NG94-156，发现50对引物在亲本间表现多态性，经过RIL后代家系（157个家系）进行验证，发现Satt534和Satt063与曲茎性状基因连锁，遗传距离分别为15.55 cM和9.68 cM, 位于连锁群B2。

短叶柄基因连锁的分子标记:采用BSA法，从260个引物中筛选出6个能扩增出多态性条带的引物，经后代单株的验证，只有S-1扩增出的多态性条带有较好的重复性。

按极大似然法计算RAPD分子标记S-11900与短叶柄基因的遗传距离为14.36cM。

国内外还没有关于曲茎性状基因和短叶柄性状基因的分子标记的报道。

（4）恢复基因方面
用不育系与恢复系构建了F2分离群体，该群体中可育株与半不育株的比例为1：1；利用不育系、恢复系、保持系构建了三交群体，该三交群体中半不育与不育株的比例为1：1。

对所构建的三交和F2群体的带有可育、半不育、不育性状的Pool进行了大量的SSR检测，400多对SSR引物，发现SSR标记Satt414在不育池和可育池之间存在差异。

将进一步单株分析结果利用Joinmap软件进行作图，将恢复基因定位于J连锁群，与SSR标记Satt596、Satt414的距离分别为14.6与16.4cM。

为了找到更为紧密的标记，将J连锁群上的标记对亲本进行分析，发现两个亲本之间的多态性很低，为寻找紧密连锁的标记带来了一定困难。

为此，利用J连锁群上的标记对8个不育系和7恢复系进行了多态性分析，选出多态性高的不育系辽-82和恢复系CK-P配制了杂交组合，构建了F2分离群体。

取不育单株56个和半不育单株49个共105个单株进行SSR分析，用Joinmap 以Kosambi函数进行遗传作图，找到了与恢复基因紧密连锁的分子标记Satt547，其与恢复基因的遗传距离为7.5cM。

大豆恢复基因的分子标记在国内外未见报道。

（5）根系、农艺、品质等基因方面
根系与大豆耐旱、营养吸收等方面关系密切。

利用科丰1号X 南农1138-2 RIL群体及其遗传图谱，定位了与大豆根系形态有关的QTL。

发现有10个QTL 位点（位于4个连锁群）与相对根重有关，其中Rwr3位于标记STAS8-20T和STAS8-15T之间，可以解释11.1%的遗传变异；Rwr3位于标记STAS8-3T和
STAS8-6T之间，可以解释24.7%的遗传变异。

还发现，10个QTL与相对根总长有关，其中Rtlr1位于标记STAS8-20T和STAS8-15T之间，可以解释7.1%的遗传变异；Rtlr2位于标记STAS8-3T和STAS8-6T之间，可以解释22.9%的遗传变异。

这些QTL的效应正在进一步验证中。

利用同一个RIL群体，对开花日数、全生育期、株高、主茎节数、倒伏性、百粒重、产量、每节荚数等八个农艺性状以及蛋白质含量、油分含量、蛋白质油分总含量等三个品质性状进行了初步研究。

在遗传图谱的基础上，用复合区间作图法研究了上述性状的QTL位点。

11个性状共检测到54个QTLs，每个性状至少检测到3个QTL位点，全生育期和主茎节数甚至检测到13个位点。

所有性状都有主效QTL（r2>0.1），效应最大的QTL （lg1，倒伏性）可以解释63.4%的变异。

还检测到3个QTL与蛋白质含量有关（最多解释10.8%的变异），4个QTL与油份含量有关（最多解释13.9%的变异）。

在25个连锁群中，有14个连锁群上有QTL位点，其中N6-C2上的QTL最多，有17个。

有14个QTL位点可以影响多个不同的性状，其中开花日数的7个QTL都是这样的位点，这7个位点中，最多的可以影响6个性状，同一个位点对不同性状的影响是不同的。

以高产品种郑92116和低产品种商951099杂交组合的F2及F2:3家系为材料进行农艺性状的QTL分析。

该群体由125个单株组成，采用Mapmaker/EXP3.0软件对143个多态性SSR标记进行连锁图的绘制，其中26个标记与其它标记不连锁，其余117个标记构成28个连锁群，该图谱覆盖了大豆1893.7cM，标记间平均遗传距离为16.2cM。

其中22个标记间的遗传距离超过30cM，位于17个连锁群。

在F2群体中检测到4个与株高有关的QTL，分布位于连锁群K，I，B1，L
上，解释变异频率分别为10.9％，1.7％，10.3％，34.6％；在连锁群I的同一区域，还检测到单株粒重、单株荚数、主茎节数的QTL各一个，解释的变异频率分别为10.2％，9.7％和14.8％；在连锁群B1上还检测到一个与生育期有关的QTL，解释变异频率12.4％。

（6）新基因发掘原理与方法研究方面
对植物数量性状的遗传体系进行了较深入的研究。

对数量性状ＱＴＬ检测从３个方面进行了拓展：a）分离世代的拓展，包括ＲＩＬ和ＤＨ群体，Ｂ１：２和Ｂ２：２群体；b）进行家系重复试验以减少试验误差提高遗传分析的精度；c）由１对主基因＋多基因拓展至２对主基因＋多基因。

ＩＥＣＭ算法的提出使以上拓展精度大为提高，并成一体系。

二、研究水平与创新性
本课题研究在大豆抗SMV基因、抗食叶性害虫基因、大豆雄性不育恢复基因方面以及新基因发掘原理与方法（植物数量性状遗传体系）等方面的研究水平在国内均具有领先地位。

与国际同类研究相比，在新基因的发掘方面具先进地位，但在相关基因的定位和标记的精度方面尚有一定的距离，需要进一步深入研究。

三、实施效果
大豆产量和抗性的提高是增加大豆产值、提高大豆竞争力的重要方面。

本课题发掘了一批与大豆产量、抗性紧密相关的种质，包括株型性状、恢复系、抗大豆花叶病毒、抗食叶性害虫等，构建了遗传研究群体RIL，对相关基因进行了初步标记和定位，同时培育了一批优良的中间材料，此外，还建立了一支水平较高的研究队伍，为高效开展大豆遗传育种准备了重要的理论、物质、和人才基础。

四、人才培养、合作交流、数据共享等方面的情况
人才培养：本课题实施期间培养硕士8人，博士3人。

1人入选“教育部跨世纪优秀人才培养计划”。

合作交流与数据共享：本课题研究开发的主基因+多基因的遗传模型不但在大豆遗传研究上得到广泛应用，还在小麦、玉米、棉花等作物的研究上得到应用，取得良好的效果。

如：Wang, Podlich, Cooper等响应本法研究了测验能力问题，发表于TAG。

30多位外单位研究者索要分析软件用于学位论文及博士后研究，内容涉及不结球白菜维生素C和可溶性糖含量，小麦赤霉酸不敏感性，云南稻种小白谷耐冷性指标性状，小麦品种纹枯病抗性，玉米雄穗性状、产量性状，花生种子抗黄曲霉侵染性状，棉花品质纤维性状等的主基因与多基因遗传分析。

此外，南京农业大学和中国科学院遗传发育所应用培育的RIL群体（科丰1号X南农1138-2，NJRIKY RIL）定位了五个与SMV抗性有关的基因，而中国农科院品资所应用该群体定位了东北株系SMV3的抗性基因，并找到与抗性基因紧密连锁的分子标记OPN11980/1070（2.1cM）。

再者，山西农业大学正在利用此群体研究与大豆抗旱性有关的QTL。

取得了较好的合作交流和数据共享效果。

五、经费使用情况
按照要求专款专用。

六、存在的主要问题
由于时间的限制，发掘的新基因及标记仅有部分在育种实践中得到应用，而且其应用效果还需要更长的时间才能进行评价。

此外，还有部分研究结果尚未来得及发表。

七、签字盖章
同意验收。

课题组长签字：承担单位签字盖章：。