转染细胞的稳定筛选实验标准操作规程
siRNA细胞转染实验操作指南
siRNA细胞转染实验操作指南siRNA产品的最佳工作浓度、转染后检测时间因不同的细胞类型和研究目的而异。
一般推荐的siRNA工作浓度为50nM，检测时间为转染后24~72h。
可以通过设置时间梯度和浓度梯度进行组合实验来选择最优的siRNA工作浓度和检测时间。
由于siRNA过量会对细胞产生毒性，实验建议的siRNA 工作浓度优化的范围为5~100nM。
下面以Lipofectamine 2000转染24孔板的293T细胞为例，选取50nM的siRNA工作浓度，介绍siRNA转染细胞的操作步骤。
若使用其他的转染试剂，请参照对应的产品说明书进行操作。
1.在转染前一天，按1×105~5×105个/孔的量将细胞接种于不含抗生素的完全培养基中，使次日转染时细胞融合度30-50%为宜。
接种时尽量保证每孔细胞的接种数量一致，使细胞均匀地平铺在生长表面。
注意:降低转染时的细胞密度可延长转染和收样的时间间隔，避免细胞过度生长对实验结果造成影响。
可根据细胞特性和实验目的等，调整接种时的细胞密度。
2.每个待转染的细胞样品（每个培养孔），按以下体系配置转染所需的siRNA-Lipofectamine 2000复合物:（1）配制稀释液A:取25pmol siRNA于50ul Opti-MEM无血清培养基中稀释，轻轻混匀。
（*siRNA的用量计算参照表1）（2）配制稀释液B:使用前先将Lipofectamine 2000轻轻混匀，取出1ul于50ul Opti-MEM无血清培养基中稀释，轻轻混匀，室温下孵育5分钟。
注意孵育时间不能超过25min。
（3）孵育完成后，将稀释液A与B轻轻混匀得到siRNA-Lipofectamine 2000复合物，在室温下孵育20分钟。
此时溶液可能会浑浊，属于正常现象。
表1 不同细胞培养板siRNA 转染用量参考表3.将孵育好的siRNA-Lipofectamine 2000复合物分别加到对应的细胞孔中，轻轻混匀。
稳定细胞株筛选流程
稳定细胞株筛选流程稳定细胞株筛选的流程主要包括以下几个步骤：1.构建表达载体：首先，需要构建表达目的基因的质粒载体。
该载体通常含有启动子、目的基因和选择标记基因等元件。
启动子可以控制基因的转录水平，目的基因可以是感兴趣的基因或报告基因，选择标记基因则用于筛选稳定细胞株。
2.细胞转染：将构建好的表达载体导入目标细胞中。
转染可以采用多种方法，如化学法、电穿孔法和病毒转染法等。
转染后，目标细胞中的外源基因片段将被导入细胞质。
3.选择压力：为了筛选稳定细胞株，需要加入选择压力。
选择压力可以是抗生素、毒素或药物等，只有在压力下能够存活的细胞才能继续生长和繁殖。
4.单克隆细胞筛选：经过选择压力后，细胞群体中可能存在不同的细胞克隆。
为了获得单克隆稳定细胞株，需要进行单克隆细胞筛选。
常用的方法有稀释分选法、限稀稀释法和流式细胞术等。
5.鉴定稳定细胞株：筛选出的单克隆细胞株需要进行进一步的鉴定。
可以通过PCR、Western blot、荧光显微镜观察等方法验证目的基因的稳定表达。
总结起来，稳定细胞株筛选的流程包括构建表达载体、细胞转染、选择压力、单克隆细胞筛选和鉴定稳定细胞株等步骤。
这个流程能够筛选出稳定地表达目的基因的细胞株，为基因功能研究和药物开发提供可靠的实验模型。
在实际操作中，稳定细胞株筛选的流程可能会因实验目的和细胞类型的不同而有所调整。
但总体而言，以上步骤是筛选稳定细胞株的基本流程。
通过稳定细胞株的筛选，可以获得稳定表达目的基因的细胞株，从而开展进一步的实验和研究。
稳定细胞株的筛选是基因功能研究和药物开发中必不可少的一步。
通过稳定细胞株的筛选，可以实现对目的基因的稳定表达，为研究基因功能和开发新药物提供有力支持。
因此，掌握稳定细胞株筛选的流程和方法对于科研人员和药物开发人员具有重要意义。
稳定转染细胞株（系）详细构建流程
稳定转染细胞株（系）详细构建流程细胞的稳定转染稳定转染的是将外源基因整合到细胞自身的基因组上，使外源基因成为细胞基因组的一部分而得以复制。
对细胞进行稳定转染最终可筛选得到稳定细胞株，稳定细胞株在重组蛋白/抗体生产、基因编辑、功能研究等方面起着重要的作用。
本文主要介绍了细胞稳定转染的原理、如何进行稳转株筛选得到高表达的细胞株，同时还介绍了细胞稳转的影响因素及稳定转染的应用。
稳定转染实验流程从实验流程的角度看，稳定转染是建立在瞬时转染的基础上的：先对哺乳动物细胞进行转染，再对得到的细胞池进行筛选最终得到稳定细胞系。
在建立稳定转染细胞系时，我们需要使用选择标记来区分瞬时转染和稳定转染，通常质粒中带有选择标记，选择标记会与目的基因共表达，由此可以筛选出阳性克隆（外源基因已稳定整合至细胞的基因组上），同时剔除未稳定整合的细胞。
最终通过有限稀释得到稳定转染的单克隆细胞株。
细胞复苏细胞复苏是将保存在液氮冰箱中的细胞株解冻并重新培养的过程，将哺乳动物细胞进行复苏用于后续的细胞转染。
细胞复苏的关键是快融，防止在解冻过程中，产生的水珠形成冰晶损伤细胞。
载体构建及细胞转染将目的基因构建至载体（载体需带有抗性），随后将构建好的质粒线性化。
接着进行细胞转染，用于转染细胞的方式有多种，包括病毒转染、脂质体转染、电转、基因枪法等，在瞬时转染与稳定转染实验流程一文中介绍了脂质体转染细胞的详细实验操作流程。
细胞池筛选转染结束后即可得到细胞池，想要得到稳定转染的单克隆细胞株需要对细胞池进行筛选：先利用抗性标记筛选稳定转染的阳性克隆，再用有限稀释法挑取单克隆株。
另外如果想要得到高表达的稳定细胞株，需要对细胞池进行压力筛选（GS筛选系统或DHFR筛选系统），最终得到表达能力高的稳转细胞株。
稳定转染实验影响因素外源基因整合几率：外源基因整合几率决定了稳转株筛选的简易程度；拷贝数：一般情况下低拷贝或者单拷贝可以降低人为因素的干扰；结合位点：不同的整合位点决定了外源片段在染色体中的稳定性，有些区域易发生重组或者丢失，从而使稳转株筛选后出现丢失的现象；整合位点转录活跃度：整合位点转录活跃度决定了稳转株中外源基因片段的表达质量；稳定转染的应用待解决的问题解决方案外源基因要整合到细胞染色体上基因敲除以及基因插入突变筛选等修饰基因组的研究细胞之间存在个体差异，同一类型细胞，不同个体细胞基因组存在差异，会对实验结果造成干扰单克隆稳转株筛选外源基因未整合到细胞会导致注射入动物体内后，外源基因片段很快丢失需要在动物体体内注射已经表达外源基因的细胞一些蛋白稳定性很强，瞬时RNA干扰作用周期短，无法去除已经表达的目的蛋白需要通过稳转株筛选，实现更好的基因干扰效果稳转株筛选很大程度上降低频繁转染或者病毒包装的成本，也很大程度上方便实验研究在某些细胞中长期研究基因的功能通过稳转株筛选，能使那些病毒载体也无法达到高转导效率的细胞高效表达外源片段获得外源片段的高效表达避免引入人为因素影响实验结果的精确性，稳转株筛选有助于筛选出拷贝数适量的细胞得到过表达的目的基因或干扰拷贝数应用场景瞬时转染表达和稳定转染表达最显著的区别就是在时间上。
稳转细胞系筛选注意事项
稳转细胞系筛选注意事项稳转细胞系筛选是细胞工程和生物医学研究中非常重要的一环。
以下是关于稳定细胞系筛选的50条注意事项，并对每一条进行详细描述：1. 选择合适的细胞系来源：在进行稳转细胞系筛选前，首先要选择合适的细胞系来源，以确保细胞系的稳定性和易转染性。
常用的细胞系来源包括HEK293、CHO、MDCK等。
2. 确定转染条件：在进行稳转细胞系筛选前，需要确定适合的转染条件，包括转染试剂种类、浓度、转染时间和细胞密度等。
3. 标定荧光素酶检测试剂盒：在进行稳转细胞系筛选时，需要使用荧光素酶检测试剂盒来检测稳定转染细胞系的活性。
4. 建立适当的质粒载体：选择适当的质粒载体对稳转细胞系的构建和筛选至关重要。
常用的载体包括pCDNA3.1、pcDNA3.1+、pEGFP-N1等。
5. 筛选适宜的筛选标记物：在进行稳转细胞系筛选前，需要选择适宜的筛选标记物，如抗生素、蛋白荧光标记等。
6. 确定稳定转染细胞系的稳定性：在进行稳定转染细胞系筛选时，需要对转染细胞系的稳定性进行验证，通常采用长期培养和连续传代的方式来确保转染细胞系的稳定性。
7. 选择适合的培养基和培养条件：在进行稳转细胞系筛选时，需要选择适合的培养基和培养条件以促进细胞系的稳定生长和表达。
8. 确定荧光素酶基因的稳定插入：在进行稳转细胞系筛选前，需要确保荧光素酶基因在细胞基因组中的稳定插入，通常采用PCR、Southern blotting等方法来验证。
9. 考虑基因组的稳定性：在进行稳转细胞系筛选前，需要考虑基因组的稳定性，并尽量避免对细胞基因组的不良影响。
10. 确定筛选标准：在进行稳转细胞系筛选前，需要确定筛选标准，如荧光素酶基因活性的阈值、抗生素的最佳浓度等。
11. 使用酶切鉴定：使用酶切鉴定来确保质粒载体的正确构建和稳定转染细胞系的正确筛选。
12. 建立稳定转染细胞系的储备：在进行稳转细胞系筛选后，需要建立稳定转染细胞系的储备，以备后续实验使用。
细胞sirna转染操作流程
细胞sirna转染操作流程细胞siRNA转染是一种常见的实验操作，用于沉默特定基因的表达。
下面我将从多个角度全面地介绍细胞siRNA转染的操作流程。
1. 实验准备：a. 准备所需的细胞培养基、细胞培养皿、siRNA转染试剂（如Lipofectamine™ RNAiMAX等）、siRNA、目的基因的控制siRNA、PBS等。
b. 在转染前，需要将细胞培养至适当的密度，确保细胞处于良好的生长状态。
2. siRNA转染操作流程：a. 将需要转染的细胞计数并分配至培养皿中，使得在转染时细胞密度达到合适的水平。
b. 在一个离心管中混合适量的siRNA转染试剂和无血清培养基，轻轻振荡混合，并静置15分钟。
c. 将siRNA转染试剂混合物滴加到含有细胞的培养皿中，轻轻摇晃培养皿使转染试剂均匀分布。
d. 将细胞培养皿放回培养箱中，根据试剂的要求进行培养，通常在转染后的24-72小时内进行下一步实验。
3. 转染后处理：a. 根据实验需求，在转染后的适当时间点进行细胞的取样或者其他实验操作。
b. 如果需要进行长期实验或者观察，可以在转染后适当时间内更换培养基。
c. 对于不同的细胞系和siRNA转染试剂，最佳的转染条件可能会有所不同，因此需要根据实验要求进行优化。
总的来说，细胞siRNA转染是一个常用的实验技术，通过沉默特定基因的表达，可以帮助研究人员探索基因功能和细胞信号通路。
在进行操作时，需要严格按照试剂的说明书和实验要求进行操作，并且根据具体情况进行优化，以确保实验结果的准确性和可靠性。
希望这些信息能够帮助到你。
细胞转染与筛选
细胞转染与筛选方法总结细胞转染：对数期生长的U251细胞经含EDTA的0.25%胰酶消化后，细胞计数，接种于六孔板，每孔种植2×105个细胞，加2ml/孔完全培养基培养过夜，弃去培养基，PBS 洗3次，加入2ml/孔OPTI-MEM培养基。
将3μl FUGENE HD加入94μl空白OPTI-MEM培养基中，混匀，室温放置5min，加入PEGFP-N1或PEGFP-LRIG1质粒体2μg，混匀，室温放置10min，加入六孔板中。
六小时后，将细胞培养基换成DMEM完全培养基。
细胞筛选：转染后36h, 荧光显微镜下观察细胞转染情况，48h后加入G418，其终浓度为1000μg/ml。
放入细胞培养箱继续培养，每两天换液，重新加入G418。
待正常组细胞全部死亡（约15d）将G418浓度调整至500μg/ml，继续培养2周后，长出抗性克隆，挑取单个克隆，在96孔板中扩增，培养2周后，单个克隆已经长满整个孔，将细胞消化后转入6孔板，使用完全培养基继续培养，继而进行其他指标的检测。
细胞转染操作方法转染，是将外源性基因导入细胞内的一种专门技术。
随着基因与蛋白功能研究的深入，转染目前已成为实验室工作中经常涉及的基本方法。
转染大致可分为物理介导、化学介导和生物介导三类途径。
电穿孔法、显微注射和基因枪属于通过物理方法将基因导入细胞的范例；化学介导方法很多，如经典的磷酸钙共沉淀法、脂质体转染方法、和多种阳离子物质介导的技术；生物介导方法，有较为原始的原生质体转染，和现在比较多见的各种病毒介导的转染技术。
理想细胞转染方法，应该具有转染效率高、细胞毒性小等优点。
病毒介导的转染技术，是目前转染效率最高的方法，同时具有细胞毒性很低的优势。
但是，病毒转染方法的准备程序复杂，常常对细胞类型有很强的选择性，在一般实验室中很难普及。
其它物理和化学介导的转染方法，则各有其特点。
需要指出的一点，无论采用哪种转染技术，要获得最优的转染结果，可能都需要对转染条件进行优化。
稳定细胞转染流程(刘文)
HepG2DMEM配制：NaHCO3 3.7gHEPES 4.766gDMEM粉1包水1000 ml用HEPES调整PH值到7.3，加入双抗（青霉素，链霉素，每L培养液各10万单位），无菌过滤，4度保存。
0.25%胰酶的配制：1、称胰酶粉末0.25 g , 加100 µl高压灭菌的1×PBS 。
2、使用小过滤器无菌过滤灭菌，4度保存。
0.02% EDTA的配制：1、称EDTA粉末0.02 g , 加100 µl高压灭菌的1×PBS 。
2、使用小过滤器无菌过滤灭菌，4度保存。
复苏细胞1、准备好操纵台，吸管，5 ml玻璃离心管，40度干净温水，（用烧杯装干净蒸馏水于水中温热）。
2、于液氮冻存罐中取出细胞，立即置于温水中，并不停地摇动，让其速融。
3、5 ml玻璃离心管中加入4ml的完全培养液，再加入溶解的细胞液。
4、1000rpm，5min 。
弃上清，加入2 ml培养液，吹散细胞。
5、分装于两瓶中，然后每瓶补充培养液至5 ml。
培养箱中培养；每日观察细胞生长情况。
传代（附壁细胞）1、超净台消毒，试管消毒，注意切忌污染。
2、胎牛血清（FBS），培养液（DMEM：对附壁细胞）胎牛血清10 ml加入DMEM/1640（1：10）。
3、消化：A、细胞培养瓶加入0.02% EDTA 约1 ml，可以轻轻晃动让EDTA没过所有的细胞，作用20S后吸出。
B、加入0.25%胰酶约1 ml，轻轻晃动让胰酶没过所有的细胞。
作用约3 min（时间的长短依情况而定，使细胞变成单个即可）。
C、吸去胰酶，加入4ml完全培养液，吹打细胞培养瓶壁，让细胞脱落，并吹打成单个细胞悬液。
4、分成两瓶，每瓶补充培养液至5 ml。
5、CO2孵箱，37度培养。
细胞冻存：1、把细胞消化成细胞悬液，计数，离心（5 ml玻璃离心管），1000rpm，5min 。
2、配好冻存液。
3、冻存液成份（每1 ml）：DMSO（二甲亚枫）100 µl培养液600 µl血清（FBS）300 µl4、弃上清，依细胞数加入冻存液（冻存液细胞浓度要达到2~4×106/ml个），一般每个冻存管1~1.5ml。
稳定转染步骤
稳定转染细胞株的制备带质粒的大肠杆菌的激活和扩增（1）取-80℃冻存的带有质粒的大肠杆菌在室温解冻，或者放置37℃恒温水中约2min,待冰完全融解即可使用。
（2）LB培养基的制备按照如下配方配制胰蛋白胨(Tryptone) 10g/L酵母提取物(Yeast extract) 5g/L氯化钠(NaCl) 10g/L用NaOH调节该培养基的pH,使其达到7.4，高温高压灭菌后室温保存，使用时加入氨苄青霉素(浓度为0.1mg/ml)（3）LB固体培养基的制备到200mlLB液体培养基加入3g琼脂混匀后高温高压灭菌，待冷却至约55℃时在无菌条件下加入氨苄青霉素摇匀，分别倒入6-7个培养皿中，用封口膜封边，并倒置放于4℃保存。
（4）扩增用接种环按照四线法将解冻后的工程菌涂布接种到LB固体培养基上，待凉干后，用封口膜将培养皿封闭，然后倒置于37℃恒温箱中培养过夜(不能摇晃)，根据情况可适当延长培养时间。
观察培养基上的单克隆工程菌，待长出后，用接种环将一个单克隆工程菌转移接种到10mlLB液体培养基中，放入掁荡培养箱中37℃摇荡培养过夜，第二天观察，待LB液体培养基变浑浊后，4℃冰箱保存，以待进行下一步质粒的提取。
质粒的提取准备质粒提取盒和扩增的带质粒大肠杆菌培养液（1）取75ml扩增变浑浊的LB液体培养基置于试管中。
（2）5,000×g离心10分钟，弃去上清液，将试管倒置在滤纸上空干。
（3）取出质粒提取盒，用3ml细胞重悬浮液对试管中的细胞进行重悬浮。
（4）加入3ml细胞裂解液，轻轻摇晃试管混匀，室温下孵育3分钟，产生白色絮状沉淀，然后加入5ml中和液混匀（5）将Clearing Column(兰色)放入一新的50ml离心管，将上述试管中裂解后的液体倒入兰管，孵育2分钟，1500×g离心5分钟，效果不佳的话可再离心一次，离心液待用。
（6）将Binding Column(白色)放入一新的50ml离心管，取上述离心液倒入白管，1500×g离心3分钟，弃去离心液。
转染细胞的稳定筛选方法和实验步骤
转染细胞的稳定筛选1、药物筛选前的准备药筛前应确定药物筛选浓度,不同细胞系具有不同的药物敏感度，因此在筛选前应该用在药物浓度范围内设定浓度梯度来确定筛选稳定克隆的药物浓度。
药物浓度一般确定为能使未转染细胞在7天之内全部死亡，如G418一般需要7天，而puro一般时间很短，只需要3-4天即可.2、药物筛选注意事项（1）药筛的时间加药时间一般为转染后48h。
但由于慢病毒表达较慢，因此利用慢病毒感染将质粒转入细胞的方法，加药时间一般为72h空白对照加药筛选时，最好设置空白对照，即未转染细胞同时加药,待空白对照中细胞全部死亡，转染组中不具有抗药性的细胞基本药杀完,但还需继续加药。
（2)换液如果加药后,细胞死亡较多，需及时换液，以防死细胞释放有害物质导致具有抗药性的细胞死亡.另外，随着细胞的代谢,抗生素的活性会降低，因此,每隔3-5天应更换一次抗生素筛选培养液.3、克隆筛选注意事项若转染的质粒带有荧光标记，不管是以下哪种筛选克隆的方法，都应该选择带有荧光较强的细胞克隆，因为加药筛选时，可能会产生耐药性的细胞,因此最好选择带有荧光较强的细胞。
若是转染的质粒不带有荧光，那么只能盲挑.不管是带有或者不带有荧光标记，都应该挑出克隆后进行验证，验证存在不成功的概率。
因此，挑克隆时,应尽量多挑几个克隆，20个左右.4、稳定克隆筛选步骤（1）有限稀释法步骤a)将药筛后的细胞（一般长满六孔板即可，若细胞生长很快药筛时可以在10cm的dish中进行）用胰酶消化下来b)对消化后的细胞悬液进行计数(如果细胞数量过大,可先稀释后计数）c)计算后，用枪头吸取约200个细胞(其中有部分为死细胞)到10ml培养液中充分混匀，剩下的大部分细胞冻存保种d)然后将以上10ml细胞悬液加到96孔板中，每孔100ul,这样有的孔就可能只有一个细胞，过程中注意不时用枪头吹打混匀细胞悬液（一个96孔板得到的克隆可能较少，可以用同样的方法做2—3个96孔板)e)待细胞贴壁后，逐孔在显微镜下观察，没有细胞或者多余一个细胞的孔划叉，只有一个细胞的孔划勾,以做好标记，如果只有一个细胞的孔数量太少，可将一个孔内有两个细胞的孔也划勾,但这样克隆就可能不纯。
稳定细胞株筛选流程
稳定细胞株筛选流程稳定细胞株筛选是一种常用的实验方法，用于筛选出稳定表达目的基因的细胞株。
这种方法可以用于基因功能研究、药物筛选和生物制品生产等领域。
本文将介绍稳定细胞株筛选的流程。
第一步：构建表达载体稳定细胞株筛选的第一步是构建表达载体。
表达载体是一种质粒，可以将目的基因导入到细胞中。
常用的表达载体有pCDNA3.1、pEGFP-N1等。
在构建表达载体时，需要将目的基因克隆到载体中，并加入适当的启动子和选择标记。
第二步：转染细胞转染是将表达载体导入到细胞中的过程。
常用的转染方法有热激转染、电穿孔转染和化学转染等。
在转染时，需要选择适当的细胞系和转染剂，并优化转染条件，以提高转染效率。
第三步：筛选稳定细胞株转染后，需要筛选出稳定表达目的基因的细胞株。
常用的筛选方法有抗生素筛选和流式细胞术筛选等。
在抗生素筛选中，将选择标记加入到表达载体中，转染后加入相应的抗生素，只有表达目的基因的细胞才能存活下来。
在流式细胞术筛选中，将目的基因与荧光蛋白等标记融合，通过流式细胞术筛选出表达目的基因的细胞。
第四步：鉴定稳定细胞株筛选出稳定细胞株后，需要进行鉴定。
常用的鉴定方法有PCR、Western blot和免疫荧光等。
在PCR中，通过扩增目的基因的特定片段来鉴定细胞株是否表达目的基因。
在Western blot中，通过检测目的基因的蛋白质表达来鉴定细胞株。
在免疫荧光中，通过检测目的基因的荧光信号来鉴定细胞株。
稳定细胞株筛选是一种重要的实验方法，可以用于筛选出稳定表达目的基因的细胞株。
在筛选过程中，需要注意选择适当的表达载体、转染方法和筛选方法，并进行鉴定，以确保筛选出的细胞株稳定表达目的基因。
慢病毒转染实验流程
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1. 病毒液与靶细胞准备。
将慢病毒液从-80℃冰箱中取出，置于冰上融化。
PEI转染细胞方法的标准操作规程
PEI转染细胞方法的标准操作规程（编号：031）1、目的及适用范围该SOP用来规范利用PEI为转染试剂进行转染的操作。
2、主要仪器细胞培养箱、细胞培养皿、微量移液器3、试剂及配制方法3.1 PEI (2μg/μL)：采用生理盐水配成2μg/μL，60℃烘箱助溶，完全溶解并冷却后，调pH至7.0（不可回调），0.22μm微孔滤器过滤，分装于1.5mL离心管，储存与4℃备用。
3.2生理盐水：0.9g NaCl溶于100mL纯水中，灭菌后微孔滤器过滤分装于1.5mL离心管，储存于4℃备用。
4、操作步骤4.1 细胞铺于细胞培养皿中，培养过夜；4.2 在转染前1-2h，将细胞培养皿中换成预热的培养基；4.3 将要转染的质粒和转染试剂PEI分别用生理盐水稀释，室温处理5min。
质粒和转染试剂的质量比为1:6；一般质粒和PEI稀释后的每管体积为50μL，如转染的质粒量多，则可对应适当增加生理盐水的量；4.4 将处理好的两者混匀，室温放置15-30 min；4.5 将处理好的样品轻轻且均匀滴加到细胞中；4.6 转染后6-8 h换液；4.7 根据实验需要，在转染后的特定时间收集样品，进行分析。
5、注意事项5.1 细胞如何健康而茁壮成长转染前细胞最好经过1～2次传代，以保证细胞生长旺盛，容易转染。
注意，贴壁细胞生长到几乎汇片时就要赶快进行下一次传代，千万不要使细胞保持融合超过24h，一旦长满了，转染效率便会降低。
大多数已建立的细胞系都是非整倍体，细胞培养在实验室中保存数月和数年后会经历突变，总染色体重组或基因调控变化等而演化，这会导致和转染相关的细胞行为的变化。
如果随时间发生61。
细胞转染步骤
细胞转染步骤细胞转染及其筛选1.传代：细胞于10cm盘消化后接种于6cm盘向6cm盘中加入3ml培养基，“米”字形摇晃。
当细胞生长到50%-70%时，根据细胞的生长速度可进行转染2.配置转染体系：（6cm盘）2.4ug基因载体质粒；9ul转染试剂；200ul无血清培养基。
混匀后室温静置10-15min孵育。
3.将6cm盘中的旧培养基弃去，换新的培养基3ml。
4.将配置好的转染体系加入到6cm盘中，混匀6-18h内换液。
5.12小时，换液后进行显微镜拍照观察。
6.再过6h加入G418，进行筛选（始终在6cm盘中进行），使用G418浓度：600μg/mlG418的配置：取1gG418溶于1mlHEPES液中，加蒸馏水至10ml，过滤消毒4℃保存。
7.3-5天换液一次（换液不用PBS冲洗），此时仍要加G418，浓度不变，只到细胞呈单个细胞那种，当细胞死的过多时，可考虑药物浓度减半。
筛选出稳定表达的cell。
8.挑克隆：1制备细胞悬液，细胞计数，用培养基稀释细胞到1个/10ul，在96孔板中加入培养基150ul/孔，在加入细胞悬液10ul/孔，待其逐渐增多后转入24孔板、6孔板、6cm盘增殖。
2.伴随着细胞的生长，可能最后会变成细胞簇，故可以用黄枪头把细胞菌落挑出，放入24孔板里面。
9.单克隆鉴定：提取细胞RNA后，进行RT-PCR检测其表达量。
10.先做RT-PCR筛选一部分，在做western继续筛选一部分。
所需物品：1.转染试剂（Attractene Transfection Regent）；2.96孔板；3.24孔板；4.6孔板；5.6cm 盘；6.G4187. 1mlHEPES液-精品-。
细胞sirna转染操作流程
细胞sirna转染操作流程引言：细胞sirna转染是一种常用的实验技术，用于研究基因功能和基因调控机制。
本文将详细介绍细胞sirna转染的操作流程，以帮助读者全面了解该技术并正确进行实验。
一、实验前准备在进行细胞sirna转染实验之前，需要进行以下准备工作：1.1 细胞培养选择适当的细胞系并进行培养，确保细胞处于良好的状态。
培养细胞时，需注意细胞密度和培养基组分的合理调配，以保证细胞的健康生长。
1.2 设计sirna序列根据研究目的，设计合适的sirna序列，选择靶向特定基因的sirna。
确保sirna序列的特异性和有效性，以提高实验结果的可靠性。
1.3 转染试剂准备准备细胞转染试剂，如转染试剂A和转染试剂B，根据试剂说明书进行配制。
确保试剂的质量和浓度符合实验要求。
二、细胞sirna转染操作流程细胞sirna转染的操作流程包括以下步骤：2.1 细胞分装将培养好的细胞按照需求分装到培养皿或孔板中，使细胞达到适当的密度。
根据实验设计，将不同处理组的细胞分装到相应的培养皿或孔板中。
2.2 转染试剂配制根据转染试剂说明书的要求，将转染试剂A和转染试剂B按照比例配制好。
确保试剂配制的准确性和稳定性。
2.3 sirna转染将设计好的sirna溶解在适量的转染试剂中，形成sirna转染复合物。
将转染复合物加入到细胞培养皿或孔板中，轻轻摇晃培养皿或孔板，使转染复合物均匀分布。
2.4 培养细胞将转染后的细胞置于恒温培养箱中，以适当的温度和湿度进行培养。
根据实验要求，培养时间可根据需要延长或缩短。
2.5 细胞采集培养一定时间后，根据实验要求采集转染后的细胞。
采集细胞时，可选择细胞裂解液进行细胞裂解，以获得细胞内的目标蛋白或核酸。
2.6 目标分析采集到的细胞样品可用于进一步的目标分析。
根据实验需要，可以选择Western blot、PCR等技术进行目标蛋白或核酸的检测和定量。
三、实验结果分析根据实验结果，进行数据统计和分析。
稳转细胞系筛选注意事项
稳转细胞系筛选注意事项一、实验步骤1. 实验前准备：实验前要穿戴好防护服、手套、口罩等防护用品，确保实验室安全。
2. 细胞复苏：将冷冻保存的细胞从液氮中取出，迅速放入37℃水浴中，轻轻摇动冻存管，使其迅速融化。
然后打开冻存管，将细胞悬液转移至15ml离心管中，加入适量培养基，吹匀后离心。
3. 细胞计数：将离心后的细胞悬液加入血球计数板，在显微镜下观察并计数。
4. 细胞接种：将细胞悬液接种到培养皿中，放入培养箱中培养。
5. 药物处理：根据实验需要，向培养皿中加入不同浓度的药物，观察细胞的生长情况。
6. 细胞收获：当细胞生长到一定数量时，用胰酶消化并收集细胞。
7. 基因检测：将收集的细胞进行基因检测，验证稳转细胞系的筛选是否成功。
8. 数据分析：对实验数据进行统计分析，得出结论。
二、注意事项1. 实验操作过程中要严格遵守无菌操作规程，避免交叉污染。
2. 在处理细胞时要轻柔操作，避免对细胞造成损伤。
3. 在加入药物时要准确控制浓度和作用时间，避免对细胞造成毒性作用。
4. 在进行基因检测时要确保引物和探针的特异性，避免假阳性或假阴性结果。
5. 在数据分析时要考虑到实验的重复性和可重复性，避免误差和偏差。
6. 在实验过程中要保持实验室的清洁卫生，及时清理废弃物和垃圾。
7. 在实验结束后要及时记录实验数据和结果，并进行总结和归纳。
8. 在进行稳转细胞系筛选时要注意选择合适的筛选标记物，以确保筛选结果的准确性和可靠性。
9. 在进行基因检测时要注意选择合适的检测方法和技术，以确保检测结果的准确性和可靠性。
10. 在进行稳转细胞系筛选时要注意控制细胞的生长条件和环境因素，以确保细胞的生长和表型特征的稳定性。
G418筛选稳定转染步骤
1.G418的配制：方案一：300mgG418加入3ml PBS溶液，浓度为100mg/ml，完全溶解后，0.22um过滤，-20℃保存。
方案二：（1）配制1M HEPES：23.8g HEPES（缓冲能力更强）粉末溶于100ml ddH2O，10NNaOH（加量较多）调节pH至7.3，过滤除菌（较难过滤），4℃保存，终浓度为1mol/L。
（2）5g G418溶于10ml 1M HEPES（pH7.3），终浓度为500mg/ml，-20℃保存。
注：实验中采用方案二时效果较好。
2.制备筛选培养基：用培养基将G418稀释为0 ug/ml、200 ug/ml、300 ug/ml、400 ug/ml、500 ug/ml、600 ug/ml、700 ug/ml、800 ug/ml、900ug/ml、1000ug/ml、1100ug/ml、1200ug/ml24孔板，每孔1ml培养基（含有G418的完全培养基），每个浓度4个重复，则每次换液需各个浓度培养基4ml，现用现配。
200ug/ml300ug/ml400ug/ml500ug/ml600ug/ml700ug/ml800ug/ml900ug/ml10 00ug/ml1100 ug/ml1200 ug/ml3ml完全培养基998.4997.6996..2994.4993.6992..2990.4G418(500mg/ml)1.6ul2.4ul3.2ul4.0ul4.8ul5.6ul6.4ul7.2ul8.0ul8.8ul9.6ul3.细胞培养：将冻存的细胞复苏培养，，传代3至4次使细胞达到良好的生长状态,铺24孔板（200/孔），12h换液，加筛选培养基培养。
4.确定G418最佳筛选浓度：将培养孔中培养基吸除，PBS洗涤一次，每孔加入不同浓度筛选培养基，隔天更换一次筛选培养基，培养10-14天，以最低细胞全部死亡浓度为基准。
注：实验中所确定的最佳筛选浓度为1200ug/ml。
细胞稳定转染方法
G418筛选稳定表达细胞系经验总结我做了稳定转染，从G418浓度确定到最后的单克隆化鉴定。
有自己的体会也有其他战友遇到的情况, 和大家分享. 没有总结好的地方，大家补充。
筛选之前确定G418浓度：1、由于每种细胞对G418的敏感性不同，而且不同的厂家生产的G418有效成分的比重不同，一般1g的粉剂中有效的G418含量大约为0.722g。
2、G418是新霉素的类似物，两者都是通过抑制核糖体的功能和蛋白质的合成而杀死细胞的。
但是新霉素对真核细胞无作用而G418对细菌和真核细胞都起作用。
neo就是编码3‘磷酸转移酶的基因，它表达的蛋白能够分解新霉素G418。
在进行转染时细胞膜受到影响，抗生素可能对细胞产生较大影响，加上G418有杀菌作用，所以有人主张转转染时不加其它抗生素。
3、汇合度对G418筛选结果的影响很大，一般筛选时汇合度不宜超过50%4，G418的活性不尽相同，所以在筛选之前，一定要确定G418的最佳筛选浓度。
具体如下：将细胞稀释到1000个细胞/ml，在100ug/ml~1mg/ml的G418浓度范围内进行筛选，选择出在10~14天内使细胞全部死亡的最低G418浓度来进行下一步的筛选试验。
一个具体试验：3x106个细胞电转后，分别接种1/4000，1/1000，1/300细胞到24孔板中，48h后加药筛选，此时1/300细胞孔内大约50%汇合度。
理论上1/4000孔内应有4%的汇合度。
筛选9天后，观察1/4000孔内有两三个克隆，按比例1/300孔内应该有几十个克隆，事实上，它们几乎全死光了，只有几个克隆。
加药时间和维持浓度1，由于基因转染到细胞内之后要一段时间才能表达出蛋白质。
所以筛选不能太早；但是也不能太晚，因为转染了外源基因的细胞代谢负荷较大，增值较慢，时间长了就会被没有外源基因转入的细胞所淹没，最终导致筛选不出阳性克隆，一般要在转染24小时之后才开始加G418筛选。
随着细胞的代谢G418的浓度和活性都会下降，所以每3~5天都要更换一次含有G418的筛选液。
稳转细胞系筛选注意事项
稳转细胞系筛选注意事项稳转细胞系筛选是细胞生物学实验中非常重要的一部分，它可以帮助科研人员筛选出稳定的细胞系来进行后续的实验和研究。
以下是关于稳转细胞系筛选的50条注意事项并进行详细描述：1. 确保选用合适的载体：在进行稳转细胞系筛选前，需要仔细选择合适的转染载体，选择适合自己实验的载体，并充分了解其特性和对细胞的影响。
2. 确认转染方法：选择合适的转染方法，例如化学转染、电穿孔法、病毒载体等，在考虑到细胞种类和转染效率的前提下选择最适合的转染方法。
3. 优化转染条件：转染条件包括细胞密度、转染试剂浓度、转染时间等，需要进行一系列的优化实验以确定最佳的转染条件。
4. 检测细胞的存活率：在转染后需要检测细胞的存活率，选择适当的存活率后进行后续实验。
5. 考虑细胞的生长特性：要充分考虑细胞的生长特性，如生长速度、凋亡率等，选择适合的转染时间点以及最佳的筛选时间点。
6. 确保对照组设计：在筛选实验中，需要设计合理的对照组，以便对转染细胞系进行正确的比较和分析。
7. 选择适当的标记方法：选择合适的标记方法可以帮助监测转染效率和稳定性，例如荧光标记或抗生素筛选标记。
8. 注意细胞系的特异性：不同细胞系对转染条件和稳定性可能存在差异，因此需要根据具体细胞系的特异性做出调整。
9. 确保细胞系的纯度：在进行稳转细胞系筛选前，需要确保细胞系的纯度，排除异质性对实验结果的影响。
10. 考虑稳转细胞的稳定性：在稳定性筛选时需要考虑不同时间点对细胞的影响，确定最佳的稳定时间点。
11. 注意细胞毒性：在进行稳转细胞系筛选时，需要关注潜在的细胞毒性问题，以及对细胞生长的影响。
12. 考虑细胞系的应用：在筛选稳转细胞系时，需要充分考虑后续实验的应用，选择最适合的细胞系。
13. 确保实验精度：在进行实验过程中要确保实验的精度和可重复性，减少实验误差对结果的影响。
14. 定期观察细胞形态：转染后定期观察细胞形态的变化，以确保稳转细胞系的正常生长和状态。
细胞转染、药物筛选(试行)[2]
![细胞转染、药物筛选(试行)[2]](https://img.taocdn.com/s3/m/55526d7a31b765ce05081443.png)
细胞转染、药物筛选（试行）第一天细胞复苏1、从液氮罐取出一管细胞)，迅速置于37℃水浴锅中溶化。
2、和9ml FBS-DMEM（双抗）一起转移到14-ml的离心管中。
3、离心1000rpm 5min，负压吸去上清。
4、用FBS-DMEM（双抗）重悬细胞，铺到6孔板上（2ml液体）。
12hr后若死细胞很多需换液1、负压吸去培养基。
2、加入2ml新鲜的FBS-DMEM（双抗）。
第三天细胞传代1、负压吸去培养基，加入2ml PBS，吸去PBS，加入0.5ml Trypsin。
2、室温放置约30秒，吸走胰酶。
加入3毫升FBS-DMEM，吹打至单个细胞状态。
3、1：3传代，取2/3平分到2个6孔板的孔内。
1孔转染，1孔支原体检测（不含抗性的培养基中连续传3代，最后一次传代后需不换液3天后取细胞做支原体检测）。
4、37度，5%CO2培养。
第五天细胞传代1、负压吸去培养基，加入2ml PBS，吸去PBS，加入0.5ml Trypsin。
2、室温放置约30秒，吸走胰酶。
加入2毫升FBS-DMEM，吹打至单个细胞状态。
3、细胞计数，传代。
使细胞数达到6*105个/毫升，取2毫升/孔加到2个孔内。
（与支原体检测孔分开操作）4、37度，5%CO2培养。
第六天转染1、观察细胞，若状态良好，且细胞密度达到70-80%可以进行细胞转染。
2、转染前2个小时细胞换上1毫升新鲜的FBS-DMEM（含血清，不含抗生素）。
3、2个小时后取0.1毫升DMEM（不含药物，不含血清）加入1.5毫升EP管中。
4、从-20度中取出DNA（1ug/ul），待全部溶解后将DNA混匀，取4 ug DNA加入到0.1毫升DMEM中，混匀。
5、将已溶解的PEI（PEI一定要最后加入）吹打混匀，取12ul加入0.1毫升DMEM中，将PEI、DNA、DMEM三者轻轻吹打混匀。
室温放置15分钟。
6、将三者混合物分多点加入到2个小时前换液的细胞，成十字形摇晃培养基。
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转染细胞的稳定筛选实验标准操作规程（编号：019）
1、目的及适用范围
该SOP用来建立稳定表达目的蛋白的细胞系。
2、主要仪器及试剂
CO2细胞培养箱、生物安全柜、酶标仪、转膜仪、电泳仪、DMEM培养基、胎牛血清、0.025%胰酶、筛选药物（抗生素）
3、操作步骤
3.1 确定抗生素作用的最佳浓度：不同的细胞株对各种抗生素有不同的敏感性，因此在筛选前要做预试验，确定抗生素对所选择细胞的最低作用浓度。
3.1.1提前24h在96孔板或24孔板中接种细胞8孔，接种量以第二天长成25%单层为宜，置CO2细胞培养箱中37℃培养过夜。
3.1.2 将培养液换成含抗生素的培养基，抗生素浓度按梯度递增（如：0, 50, 100, 200, 400, 600, 800 和1000μg/mL），此梯度因抗生素而异。
3.1.3培养10-14d以绝大部分细胞死亡浓度为准,筛选稳定表达克隆时可比该浓度适当提高一个级别，维持时使用筛选浓度的一半。
3.2 转染按转染试剂说明书步骤进行。
3.3 转染48h后按1:10的比例将转染细胞传代到6孔板中，换成含预试验中确定的抗生素浓度的选择培养基。
在6孔板内可见单个细胞，继续培养可见单个细胞分裂繁殖形成单个抗性集落，此时可用两种方法挑选单克隆。
3.3.1滤纸片法：用消毒的5×5mm滤纸片浸过胰酶,将滤纸片贴在单细胞集落上10-15s，取出粘附有细胞的滤纸片放于24孔板中继续加压培养。
细胞在24孔板中长满后转入35mm培养皿中，长满后再转入10cm皿中扩大培养。
3.3.2有限稀释法：将细胞消化下来后做连续的10倍稀释（10-2～10-10），将每一稀释度的细胞滴加到96孔培养板中培养，7-10d后，选择单个克隆生长的孔再一次进行克隆。
3.4 ELISA或Western blot检测单克隆细胞中外源蛋白的表达情况由于不同克隆的表达水平存在差异因此可同时挑选多个克隆选择表达量最高的克隆传代并保种。
4、问题向导
目的蛋白没有得到表达可能原因：
40。