转染细胞的稳定筛选实验标准操作规程

转染细胞的稳定筛选实验标准操作规程（编号：019）

1、目的及适用范围

该SOP用来建立稳定表达目的蛋白的细胞系。

2、主要仪器及试剂

CO2细胞培养箱、生物安全柜、酶标仪、转膜仪、电泳仪、DMEM培养基、胎牛血清、0.025%胰酶、筛选药物（抗生素）

3、操作步骤

3.1 确定抗生素作用的最佳浓度：不同的细胞株对各种抗生素有不同的敏感性，因此在筛选前要做预试验，确定抗生素对所选择细胞的最低作用浓度。

3.1.1提前24h在96孔板或24孔板中接种细胞8孔，接种量以第二天长成25%单层为宜，置CO2细胞培养箱中37℃培养过夜。

3.1.2 将培养液换成含抗生素的培养基，抗生素浓度按梯度递增（如：0, 50, 100, 200, 400, 600, 800 和1000μg/mL），此梯度因抗生素而异。

3.1.3培养10-14d以绝大部分细胞死亡浓度为准,筛选稳定表达克隆时可比该浓度适当提高一个级别，维持时使用筛选浓度的一半。

3.2 转染按转染试剂说明书步骤进行。

3.3 转染48h后按1:10的比例将转染细胞传代到6孔板中，换成含预试验中确定的抗生素浓度的选择培养基。在6孔板内可见单个细胞，继续培养可见单个细胞分裂繁殖形成单个抗性集落，此时可用两种方法挑选单克隆。

3.3.1滤纸片法：用消毒的5×5mm滤纸片浸过胰酶,将滤纸片贴在单细胞集落上10-15s，取出粘附有细胞的滤纸片放于24孔板中继续加压培养。细胞在24孔板中长满后转入35mm培养皿中，长满后再转入10cm皿中扩大培养。

3.3.2有限稀释法：将细胞消化下来后做连续的10倍稀释（10-2～10-10），将每一稀释度的细胞滴加到96孔培养板中培养，7-10d后，选择单个克隆生长的孔再一次进行克隆。

3.4 ELISA或Western blot检测单克隆细胞中外源蛋白的表达情况由于不同克隆的表达水平存在差异因此可同时挑选多个克隆选择表达量最高的克隆传代并保种。

4、问题向导

目的蛋白没有得到表达可能原因：

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