宏基因组测序及分析

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微生物年龄与时间关系曲线
b:应用用随机森林 程序，拟合时间 与微生生物年龄之 间的关系
cd：营养不良儿儿
童的肠道菌群组 成不符合其真实 年龄
ef:即使通过饮 食食治疗也无无法 根本改变
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文文章推荐：宏基因组与PM2.5
2014年1月月23日日,清华大大学朱听课题组 利用用高高通量测序技术首首次在“种”的水水 平上鉴别出大大气气悬浮颗粒物中的微 生生物.
(A) CO /H 甲烷生生成代谢通路. (B）基因丰度. (C) 转录本表达差异. （D）转录本种类差异分析；RPM, reads per million. NS, no statistical significance in Wilcoxon rank-sum test; *, P < 0.05; **, P < 0.01; Error bars denote standard errors.
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研究思路
平均身身体质量指数（BMI），用用于衡量体重指标，运动员组被试的平均身身体质 量指数（BMI）是29.1
样本收集：
40名专业橄榄球运动员；此外还有23名是正常BMI组（BMI≤25），23名 则属于高高BMI组（BMI≥28）46个样本作为对照组。(肠道样本和血血液样本)
高高通量测序：
• EMP
4
• Earth Microbiome Project • 地球微生生物计划
宏基因组研究的分析流程
提取环境样本DNA
获取测序数据
生生物信息学分析
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提取环境样本DNA
宏基因组测序: • 浓度≥50ng/ul; • OD260/280:1.8-2.0; • DNA两次需要量:≥3ug
PowerSoil® DNA Isolation Kit
迪康金金诺NGS应用用交流会
宏基因组研究在肠道微生生物中的最新研究应用用
报告人人：樊玉玉才
2014.06
组织单位： 江苏省水水产动物营养重点实验室 南京迪康金金诺生生物技术有限公司
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大大纲
什么是宏基因组研究 宏基因组研究的分析流程
宏基因组研究的相关应用
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什么是宏基因组研究？
无无需培养，直接从环境样品中提取全部微生生物的DNA,结合高高通
背景：反刍动物排 放的CH4 是温室气气 体的重要来源之一一
羊羊排放的甲烷气气体 量存在差异性
应用宏基因组与宏 转录组测序发现两 18 组之间是否存在差
研究思路
样本收集：
4 highest, 4 lowest, and 2 intermediate CH4 yields two separate times (20 samples total)
2 2
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研究案例（三）
Gut：运动可能增加肠道菌群多样性
背景：研究表明，肠道菌群多样 性的减少与肥胖及其他健康问题 相关，而而肠道菌群多样性的增加 则有利于新陈代谢和免疫。 运动可能对肠道菌群的多样性产 生生有益影响。
Clarke, S.F., et al., Exercise and associated dietary extremes impact on gut microbial diversity. Gut, 2014.
高高通量测序：
SSU rRNA gene sequencing：454 pyrosequencing
测序：Illumina HiSeq 2000
insert size of 250 bp、8kb 2 × 150 bp pair-end
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研究结果
应用宏基因组分析，没有发现物种差异性
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宏基因组 vs 宏转录组
PowerWater® DNA Isolation Kit
PowerFecal® DNA Isolation Kit
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生生物信息分析（一一）数据质控
对测序数据的客观评价
数据质量
GC含量
1) 去除接头污染和低质量数据 2) 去除宿主污染
7
生生物信息分析（二二）：物种组成(16S/18S/ITS)
1
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后续实验
选取233个候选基因，通过设计特定引物，然后使用用PCR扩增，其中158 of 233 (68%) 得到了扩增产物。 随后将扩增产物通过载体（选择90个候选基因）导入入大大肠杆菌，然后由 这些细菌产生生了90种蛋白白质酶，其中51 of 90 (57%)具有酶活性
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研究案例（二二）：宏基因组和宏转录组
996 243 589 22 47 1897
高高通量测序：
Illumina MiSeq platform V4-16S rRNA sequencing paired-end 162- or 250bp
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研究结果
1. 按照序列相似性97%来划分总共识别了 1,222 OTUs 2. 挑选出了24种差异性表达物种
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研究思路
瘘管奶牛牛
将柳枝稷样品置于牛牛的瘤胃中培 养72小小时，然后对附着在柳枝稷 样品上的所有微生生物进行行基因组 分析。
Illumina GAIIx ＋Illumina HiSeq2000 测序建库：200,300,3k,5k 双端测序：2*125、2*200、2*75
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研究结果
总共识别了27,755 与碳水水化合水水物绑定模块或具有催化功能的候选基因
454 Genome Sequencer FLX platform amplicon sequencing of the 16S rRNA gene V4
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研究结果：微生生物多样性比比较
Shannon index
Phylogenetic diversity
Simpson
Chao1 Observed species
量测序来研究样品中的微生生物组成及群落功能。
3
宏基因组研究热点
MetaHIT
• Metagenomics of Human Intestinal Tract • 人人类肠道宏基因组计划
• HMP
• Human Microbiome Project
• GOS
• 人人类微生生物组计划
• Global Ocean Sampling expedition • 全球海洋调查
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文文章推荐
2012年10月月4日日，宏基因组与2型糖尿病
2013年8月月29日日，宏基因组与肥胖
2014年6月月4日日的《新英格兰医学杂志》
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Thank you!
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Study Subjects Number of fecal samples
50 Healthy Children (Singletons, Twins and Mothers & Fathers Severe Acute Malnutrition Randomized Clinical Moderate Acute Malnutrition Cross-Sectional Concordant Healthy Malawian Twins and Triplets
研究发现其中大大部分为非非致 病性微生生物,并且有很多可能 来自自于土土壤;同时,他们发现了 致敏与致病物种,并且发现它 们的相对丰度与污染程度之 间呈正相关。
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文文章推荐：宏基因组与抗生生素
医院种各种细菌之间的抗性因子子可以互相传递。生生活在土土壤中 的天然细菌拥有大大量的抗生生素抗性基因，但它们很少分享这些 基因。土土壤中的抗生生素抗性基因与特定细菌种属捆绑在一一起
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1:物种丰度 2:样本聚类
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生生物信息分析（二二）：物种组成(16S/18S/ITS)
多样性曲线
PcoA分析
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生生物信息分析（三）基因功能分析
代谢通路分析
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生生物信息分析（三）基因功能分析
COG注释
CAzyme注释
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生生物信息分析（四）个性化分析
1) 筛选与样品分组显著相关因子子(基因、功能) 2) 基于筛选因子子对样品进行行主成分分析(PCA) 3) 基于筛选因子子对样品进行行聚类分析
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研究结果：蛋白白质摄入入量与菌群的关系
蛋白白质的贡献率在 运动员组中（22 ％）也远高高于在对 照组中的贡献率 （15-16％）
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研究案例（三）
——Nature：营养不良破坏你的微生生物组
人人类肠道菌群建立立于幼 儿儿时期，这些菌群对儿儿 童的健康有着重要的影 响。
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研究思路
样本收集：50名健康的孟加拉贫民区儿儿童（25 singletons, 11 twin pairs, 1 set of triplets),2岁前每两个月月采集一一次粪便
（组数≥ 2,每组样品数 ≥ 10)
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大大纲
什么是宏基因组研究 宏基因组研究的分析流程
宏基因组研究的相关应用
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研究案例（一一）
Science：牛牛胃中微生生物酶可用用于开发生生物燃料百度文库
背景：纤维素是自自然界中最丰富的碳水水 化合物资源。牛牛在反刍过程中涉及到纤 维素的分解，研究牛牛的消化机制，有利 于寻找应用用于生生产生生物燃料的酶。