分子生物学

最大的细胞
在动物领域中，体积最大的细胞是鸵鸟的卵细胞（一般0.07m）；长度最长的是巨型乌贼的神经细胞（12m）；
在植物领域中，最长的单核细胞应该为苎麻的韧皮纤维细胞（0.5m），体积最大的细胞应该为蕨藻的核胞体（3m）。

综上所述，动植物领域中，
体积最大的单核细胞应该为鸵鸟的卵细胞；
体积最大的细胞应该为蕨藻的核胞体；
最长的应该是巨型乌贼的神经细胞。

起始甲硫氨酸与延伸甲硫氨酸的识别
蛋白质合成的启动：
起始于甲硫氨酸的参与，一个特殊的起始tRNA对所有蛋白质合成中起始氨基酸——甲硫氨酸的掺入负责，即tRNAiMet，细胞中只有两种tRNA可以携带甲硫氨酸，把另外一种携带甲硫氨酸掺入到蛋白质内部的tRNA写作tRNAMet。

但是只有一种甲硫氨酰-tRNA合成酶参与了这两种甲硫氨酰-tRNA的合成。

对这两种甲硫氨酰-tRNA的识别是由参与蛋白质合成的起始和延伸因子决定的，起始因子识别tRNAiMet，延伸因子识别tRNAMet。

原核细胞中AUG的识别
细菌的mRNA通常含有一段富含嘌呤碱基的序列，现被称作SD序列，它们通常在起始AUG 序列上游10个碱基左右的位置，能与细菌16S核糖体RNA 3’端的7个嘧啶碱基进行碱基互补性的识别，以帮助从起始AUG处开始翻译。

原核细胞中，有一种特异的甲酰化酶，能够使得tRNAiMet中的氨基发生甲酰化，这样可使得参与起始的tRNAiMet不参与肽链的延伸过程。

甲酰甲硫氨酸，起始AA-tRNA为fMet-tRNAfMet
真核细胞中AUG的识别
在真核生物的mRNA中，最靠近5’端的AUG序列通常是起始密码。

核糖体小亚基首先结合在mRNA的5’端，然后向3’端移动，直到AUG序列被tRNAiMet上的反密码子识别。

这种识别为类似GCCGCCpurCCAUGG这样序列所加强。

起始AA-tRNA为Met-tRNAMet
蛋白质合成的过程
(一)氨基酸的活化
(二)翻译的起始
原核生物（细菌）为例：
所需成分：
30S小亚基、50S大亚基、模板mRNA、
fMet-tRNAfMet、GTP、Mg2+
翻译起始因子：IF-1、IF-2、IF-3、
(三)肽链的延伸
肽链延伸由许多循环组成，每加一个氨基酸就是一个循环，每个循环包括：AA-tRNA与核糖体结合、肽键的生成和移位。

延伸因子(elongation factor, EF) ：
原核生物：EF-T (EF-Tu, EF-Ts), EF-G
真核生物：EF-1 、EF-2
肽链的终止
(五)蛋白质前体的加工
两个半胱氨酸-SH -- -SH 二硫键
特定氨基酸的修饰
磷酸化、糖基化、甲基化、乙基化、羟基化和羧基化
切除新生肽链中非功能片段
概念
Motif(基序)
定义：在许多蛋白质中，有两个或三个具有二级结构的肽段在空间上相互接近，形成一个特殊的空间构象，称为基序。

他们是二级结构有序的组合体。

它们可直接作为三级结构的“建筑块”或结构域的组成单位，是蛋白质发挥特定功能的基础。

分类：
螺旋/转角/螺旋（Helix-turn-helix,HTH）基序
锌指(Zinc finger)基序
亮氨酸拉链(Leucine-Zipper)基序
螺旋-环-螺旋(Helix-loop-Helix，HLHt)基序
（这几种都是反式作用因子与顺式作用元件相互作用时的特征结构）
Domain（结构域）
指在较大的蛋白质分子中形成的某些在空间上可以辨别的结构，往往是球状压缩区或纤维状压缩区。

在结构上相对独立于蛋白分子的其他部位，有些结构域含有特殊的二级结构组合（motif）。

特点：
介于二级结构和三级结构之间的超二级结构具有部分生物学功能。

对于较小的蛋白质分子或亚基来说，结构域和它的三级结构往往是一个意思。

哺乳动物中，脂肪酸的合成需要七种不同的催化反应，这些反应则由一条多肽链的七个结构域来完成。

亚基
1）蛋白质的最小共价单位。

由一条多肽链或以共价键
连接在一起的几条多肽链组成。

(2)寡蛋白质的功能单位；大分子的亚结构，如细菌70S核
蛋白体中的30S或50S亚基。

基序，结构域，亚基之间的关系
基序是结构域的组成单位，有些结构域具有部分生物学功能，是介于二级结构与三级结构的超二级结构。

亚基是寡蛋白结构和功能的单位，一个亚基可能含有几个结构域。

我们姑且可以认为：基序，结构域，亚基之间的关系为包含关系，由低到高。

硒半胱氨酸和吡咯赖氨酸（21,22号氨基酸）
疏水作用
Define：
Substances characterized by a positive Gibbs energy of transfer from a nonpolar to a polar solvent are called hydrophobic.
However, when many solute molecules cluster together, fewer (albeit larger) cages are required and more solvent molecules are free to move. The net effect increase in entropy of the system. This increase in entropy of the solvent is large enough to render spontaneous the association of hydrophobic molecules in a polar solvent.
The increase in entropy that results from fewer structural demands on the solvent placed by the clustering of nonpolar molecules is the origin of the hydrophobic interaction, which tends to stabilize groupings of hydrophobic groups in micelles and biopolymers.
表观遗传调控----DNA 甲基化（methylation）
Genetics : The branch of biology that deals with heredity, especially the mechanisms of hereditary transmission and the variation of inherited characteristics among similar or related organisms.
Epigenetics is the study of heritable changes in phenotype (appearance) or gene expression caused by mechanisms other than changes in the underlying DNA sequence.
Genotype：identical Phenotype：different
表观遗传调控: 不涉及DNA序列改变，可随细胞分裂稳定保持的基
因表达调控方式。

甲基化在功能元件上的分布
1. CpG在重复片段以及基因的3’UTR区域能够发生甲基化。

2. CpG岛通常不被甲基化，repeat和intron高甲基化。

3. 哺乳动物中：26,000-45,000 CpG岛。

常分布在持家基因和一些组织表达特异性基因的启动子区域。

4. CpG岛：可以被HpaII酶(C|CGG)切成小片段，因此也叫HTF岛。

5. 人类基因组~45%的区域是转座子（transposable elements，简称TE）。

6. 转座子（TE）高度甲基化，细胞中90%的甲基化CpG位于转座子中。

7. 转座子的活性对机体非常有害，甲基化抑制转座子的活性。

甲基化主流检测方法
沉淀法（MeDIP、MBD）
BS处理（BS-seq、RRBS）
酶切处理(McrBC digestion、RLGS; HELP assay)
统计预测（Methylator ）
其他方法（MeDIP+BS、
MBD+BS）
甲基化调控机制
Blocking the promoters at which activating transcription factors
should bind –阻碍转录因子
Methylated DNA bind transcription suppressing factors leading gene silencing –结合抑制因子
Methylated DNA may be bound by proteins known as methyl-CpG-
binding domain proteins (MBDs). MBD proteins then recruit additional
proteins to the locus, such as histone deacetylases and other chromatin remodeling proteins that can modify histones, thereby forming compact, inactive chromatin, termed silent chromatin
–MBD招募组蛋白修饰
去甲基化的主要途径
细胞的凋亡、坏死与衰老
细胞凋亡（apoptosis）
细胞程序化死亡（programmed cell death, PCD）
涵义：主动的、受控的自然生理过程；“自杀”（“suicide”）
细胞死亡（cell death）
凋亡（apoptosis）：主动过程，不引起炎症等反应
坏死（necrosis）：被动过程，应激反应；引起炎症
细胞死亡并非与机体的死亡同步；细胞死亡是维持机体正常功能、组织和器官的机能、体积和形态所必需的。

细胞凋亡的功能和意义
胚胎发育、器官形成：e.g., 小鼠爪趾的形成（图）；
去除不需要的组织和结构：e.g., 蛙类蝌蚪尾部；
细胞数量的控制（cell number control）：e.g., 神经系统中的神经分布（innervation）、神经细胞／靶细胞之间数目的匹配，etc.；
成体组织的生长控制（growth control）：
平衡
division／apoptosis overgrowth／shrink
肿瘤形成
细胞凋亡的基本特征
（一）形态学特征
细胞坏死：剧烈破坏（“burs t”），内容物外泄，炎症；
细胞凋亡：有序地解体（“dismantle neatly”），相对完整，形成凋亡小体，被巨噬细胞吞噬，无炎症，细胞成分可被重利用（recycle）。

（二）生化特征
DNA 断裂：发生在核小体之间，产生180－220 bp 的倍数片段，电泳可见“DNA ladder”; tTG （tissue transglutaminase, 组织转谷氨酰胺酶）的积累和活化（凋亡小体的保持）；
凋亡特征性mRNA 和蛋白质的出现。

（三）诱导因子
物理：射线、温度等；
化学：ROS、钙离子载体、VK3、视黄酸、细胞毒素、DNA和蛋白质合成抑制剂，等等；
生物：内源性的细胞环境变化（激素、细胞因子、抗体等）、有关信号分子的变化（TNF-α, Fas/Apo-1, 等）。

（四）细胞凋亡的检测
形态学和组织化学检测：电镜（TEM、SEM）、DAPI 染色、Giemsa 染色，等等；
DNA 电泳：断裂DNA 片断，“DNA ladder”；
TUNEL（Terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick end labelling）法：一种对断裂DNA 缺口的末端标记和显示法；
细胞衰老
指细胞随着年龄的增加，机能和结构发生退行性变化，趋向死亡的不可逆的现象。

衰老和死亡是生命的基本现象，衰老过程发生在生物界的整体水平、种群水平、个体水平、细胞水平以及分子水平等不同的层次。

与细胞寿命相关的几个现象
细胞衰老与细胞分裂：衰老细胞分裂减缓，细胞周期延长（G1 期显著延长）；
细胞衰老与分化：细胞寿命（衰老）与分化程度呈反比，即：分化程度低的细胞寿命长（如干细胞），分化程度高的细胞易衰老和死亡（如功能细胞）；
克隆羊“多莉”的年龄和寿命：提前衰老；生理年龄：出生时；“细胞年龄”：核供体者，6 岁羊的乳腺细胞。

细胞衰老的结构和生化变化
衰老细胞的结构变化：
端粒与衰老：
端粒（telomere）：染色体末端TTAGGG 重复序列；
端粒酶（telomerase）：核糖核蛋白酶（RNA/蛋白质），
以RNA 为模板，反转录合成端粒序列，保持端粒的长度；
细胞衰老的“有丝分裂钟”学说：细胞分裂过程中，端粒不能被DNA 合成酶完全复制，因而随细胞分裂而变短，直至细胞停止分裂；端粒酶能复制端粒；生殖细胞中端粒酶活性高，体细胞中活性低。

RNA干扰
RNA干扰的简介
RNA干扰作用(RNA interference，RNAi）双链RNA (double．stranded RNA，dsRNA)引发的转录后基因沉默机制(post-transcriptional gene silencing, PTGS)。

通过反义RNA与正链RNA形成双链RNA特异性抑制靶基因的转录后表达的现象，存在于从低等的线虫到人类培养细胞等多种有机体。

RNAi----- RNA interference
siRNAs-----Small interfering RNAs (小干扰性RNA)
dsRNA------double strand RNA(双链RNA)
RISC------RNA-induced silencing complex(RNA诱导沉默复合物)
RdRP------- RNA-directed RNA polymerase (RNA指导RNA聚合酶)
Dicer------ RNAaseIII—related enzymes (RNAaseIII家族成员)
PTGS------Post-transcriptional gene silencing转录后基因沉默
RNAi作用机制
起始阶段
长dsRNA→siRNA 21-23nt
ATP, RNaseⅢ特异核酸酶(Dicer,果蝇)
3’端均有2～3个突出的核苷酸
效应阶段
RISC binding targeted RNA
siRNA→RISC (RNA—induced silencing complex) ATP
活化的RISC在单链siRNA引导下识别互补的mRNA，并在RISC中的核酸内切酶作用下从siRNA 引导链中心所对应的靶基因位置切割靶mRNA，最后可能再被核酸外切酶进一步降解，从而干扰基因表达。

扩增扩散阶段
模板：靶mRNA切割片段
引物：siRNA
产物：长链dsRNA
依次循环：
新合成的长链dsRNA同样可被Dicer切割、降解生成大量的次级siRNA。

次级siRNA 又可进入合成一切割的循环过程，进一步放大RNAi作用。

重要特征：
1.只对exon有效，对intron和promoter无效，尚未发现对染色体DNA有影响
2.RNAi具有很高的特异性
3.放大性
4.RNAi的效应可以穿过细胞界限，在不同细胞间长距离传递和维持
RNA干扰研究的一般流程
确定目的基因；根据相对应的核酸序列设计出siRNA的序列；获得siRNA；用siRNA转染细胞；分析RNA干扰的效果
RNAi应用
1、对抗由转座子和重复序列引起的不稳定性
2、对抗病毒等外源性物质的侵入
3、内源基因调控:探索基因功能和传染性疾病及恶性肿瘤的基因治疗
a.研究基因功能
由于RNAi能高效特异的阻断基因的表达，因而RNAi成为研究基因功能的很好的工具。

人们已经开始利用RNAi技术从基因组水平分析哺乳动物体内基因的功能，可以更迅速地鉴定出许多与疾病相关的基因。

b.基因治疗
RNAi可以特异性的抑制基因表达，所以可用于基因病、病毒感染、癌症的治疗。

c.信号转导
RNAi可用来研究细胞信号转导通路和细胞生长分化过程。

可以认为RNAi是一个以小分子RNA为中心的真核细胞基因表达调控系统，它可以在多个层面调节基因表达和细胞的增殖分化，通过对RNAi的研究将会使人们对生命现象的认识更加深入。