新基因功能研究的策略与方法
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2.抑制或沉默基因表达 RNA水平上干预蛋白质的翻译过程以减少蛋白产量来研究基因的功能
（1）反义RNA （2）RNA干扰技术
04.1动物基因敲除技术
构建基因敲除动物的基本原理
1.在ES细胞水平上进行基因敲除 （1）构建基因敲除载体，即含有两个筛选标志基因、待敲除基因同源臂序列的克隆载体 （2）一般使用新霉素抗性基因作为阳性筛选标志基因，HSV-tk作为阴性筛选基因 （3）发生同源重组的ES细胞能在含新霉素和单核苷酸类似物的培养基中存活 （4）非同源重组的ES细胞不能在含有单核苷酸类似物的培养基中存活 2.将进行了基因敲出的小鼠兄妹交配，有1/4概率获得两条等位基因被敲除的小鼠
右图所示： 将带有线粒体信号肽和DsRed基因的载体导入到Hela细胞 中，表达的DsRed蛋白发出红色荧光。
04 |功能的实验确认
功能失活策略
1.基因敲除 指通过DNA同源重组技术定向地将外源基因插入宿主细胞染色体DNA， 而使特定基因在生物体体内失活的过程。
动物基因敲除技术
研究的多是小鼠，因其遗传结构在许多方面与人类相似 。
在染色体标本上进行，则称为染色体原位杂交
04.3基因过表达技术
通常使用细胞转染技术使细胞模型中特定基因过表达 （1）瞬时转染 外源DNA/RNA不整合到宿主染色体中，在宿主细胞中产生高水平 的表达，多用于启动子和其他调控元件的分析 （2）稳定转染 外源DNA既可整合到宿主染色体中(概率很小，需反复筛选)，也可 作为游离体存在
实时荧光定量PCR技术检测转基因玉米
Mon 810玉米导入了经过 修饰的苏云金芽孢杆菌杀 虫毒蛋白 CryIA基因
染色体原位杂交
核酸原位杂交是利用碱基序列已知的带放射性或者 非放射性标记的核酸探针，依碱基互补配对原理， 通过放射自显影或非放射自显影在组织切片、细胞 等上对待测核酸进行定性、定位和相对定量的一种 分析方法。
基本步骤
04.2抑制或者沉默表达基因
Hale Waihona Puke Baidu反义RNA
反义RNA是指能与mRNA互补 配对的RNA分子，是相对DNA 而言的。
04.2抑制或者沉默表达基因
RNA干扰
RNA干扰是指由短双链RNA诱导同源mRNA的降解过程，从转录后水平抑制基因表达。 干扰过程的主要步骤：
（1）长双链RNA被特异性核酸酶切成21-23bp的短双链RNA，称为siRNA(small interfering RNA) （2）siRNA与细胞内的某些酶和蛋白质形成复合体RISC （3）RISC识别与siRNA有同源序列的mRNA，在特异位点切断mRNA
05 | 编码产物相互作用蛋白的研究
酵母双杂交系统的特点
1.在细胞内研究，能真实地反映蛋白间的相互作用 2.方法敏感性高
在其基础上研究出： 1.用于研究多蛋白质复合体之间相互作用的酵母三杂交系统 2.用于从大量突变体中筛选导致蛋白相互作用减弱的反向双杂交系统
功能失活策略
• 功能失活(loss-of-function)策略即通过观察某一 细胞或个体在新基因的功能被部分或全部失活后的 细胞生物学行为或个体表型遗传性状变化来鉴定基 因的功能
04 |功能的实验确认
功能获得策略常见方法
1.基因转导 2.转基因技术 3.过表达技术
动物转基因技术的原理与方法
04.2动物转基因技术的原理与方法
目的基因的制备
1、双链cDNA与载体连接构成重组子； 2、将重组子转入受体菌； 3、筛选和鉴定重组子克隆并进行扩增，获得大 量目的基因cDNA； 4、受体菌中获得重组子； 5、酶切鉴定获得的目的基因。
04.2动物转基因技术的原理与方法
转基因载体的构建
结构基因 调控序列（启动子、终止子）：根据研究目 的不同选择相应调控序列 报告基因（半乳糖苷酶、绿色荧光蛋白等）
04.2动物转基因技术的原理与方法
基因转移方法
显微注射法 胚胎干细胞法 反转录病毒法 精子载体法 电转移法 体细胞核移植法（克隆羊多莉） 受体介导法 磷酸钙共沉淀法 脂质体载体法 嵌合体动物法
04.2动物转基因技术的原理与方法
转基因动物的检测与鉴定
PCR：实验前应对PCR引物的特异性和敏感性进行检测 Southern blotting：PCR检测阳性后，确定外源基因整合方式 染色体原位杂交：确定转基因整合到染色体的具体位置 Western blotting、免疫组化：研究转基因的表达水平
05 | 编码产物相互作用蛋白的研究
酵母双杂交系统
1.以真核细胞转录激活因子的结构和活性特点为基础 2.转录因子由一个DNA结合结构域（BD）和一个转录激活结构域（AD）组成 3.酵母蛋白GAL4是一个典型的转录激活因子，能转录活化酵母半乳糖苷酶 4.研究者分别构建了含GAL4 BD和GAL4 AD的两个酵母融合蛋白表达载体 5.遗传学操作突变酵母编码色氨酸、亮氨酸和组氨酸基因和敲除GAL４蛋白抑制蛋白GAL８０的 基因，使酵母不能在缺乏这三种氨基酸的条件下生长
05 | 编码产物相互作用蛋白的研究
将靶蛋白X基因克隆在酵母BD表达载体上 将待筛选的蛋白Y基因克隆在酵母AD表达载体上 若X、Y蛋白有相互作用，则GAL4的BD和AD区结 合，发挥转录激活功能，就可进行 颜色筛选：β-半乳糖苷酶在X-gal存在下，呈蓝色 营养缺陷型筛选：能否在缺乏相应氨基酸的培养基 中生长？
04.2动物转基因技术的原理与方法
基因转移方法
显微注射法 胚胎干细胞法 反转录病毒法 精子载体法 电转移法 体细胞核移植法 受体介导法 磷酸钙共沉淀法 脂质体载体法 嵌合体动物法
04.2动物转基因技术的原理与方法
基因转移方法
显微注射法 胚胎干细胞法 反转录病毒法 精子载体法 电转移法 体细胞核移植法 受体介导法 磷酸钙共沉淀法 脂质体载体法 嵌合体动物法
新基因功能研究的策略与方法
Presenter:XXX
目录
CONTENTS
01 全长cDNA的克隆 02 生物信息学分析 03 表达谱分析 04 功能的实验确认 05 编码产物相互作用蛋白的研究
04 | 功能的实验确认
功能获得策略
• 功能获得(gain-of-function)策略即通过将新基因 直接导人某一细胞或个体中，通过观察细胞生物学 行为或个体表型遗传性状的变化来鉴定基因功能
（1）反义RNA （2）RNA干扰技术
04.1动物基因敲除技术
构建基因敲除动物的基本原理
1.在ES细胞水平上进行基因敲除 （1）构建基因敲除载体，即含有两个筛选标志基因、待敲除基因同源臂序列的克隆载体 （2）一般使用新霉素抗性基因作为阳性筛选标志基因，HSV-tk作为阴性筛选基因 （3）发生同源重组的ES细胞能在含新霉素和单核苷酸类似物的培养基中存活 （4）非同源重组的ES细胞不能在含有单核苷酸类似物的培养基中存活 2.将进行了基因敲出的小鼠兄妹交配，有1/4概率获得两条等位基因被敲除的小鼠
右图所示： 将带有线粒体信号肽和DsRed基因的载体导入到Hela细胞 中，表达的DsRed蛋白发出红色荧光。
04 |功能的实验确认
功能失活策略
1.基因敲除 指通过DNA同源重组技术定向地将外源基因插入宿主细胞染色体DNA， 而使特定基因在生物体体内失活的过程。
动物基因敲除技术
研究的多是小鼠，因其遗传结构在许多方面与人类相似 。
在染色体标本上进行，则称为染色体原位杂交
04.3基因过表达技术
通常使用细胞转染技术使细胞模型中特定基因过表达 （1）瞬时转染 外源DNA/RNA不整合到宿主染色体中，在宿主细胞中产生高水平 的表达，多用于启动子和其他调控元件的分析 （2）稳定转染 外源DNA既可整合到宿主染色体中(概率很小，需反复筛选)，也可 作为游离体存在
实时荧光定量PCR技术检测转基因玉米
Mon 810玉米导入了经过 修饰的苏云金芽孢杆菌杀 虫毒蛋白 CryIA基因
染色体原位杂交
核酸原位杂交是利用碱基序列已知的带放射性或者 非放射性标记的核酸探针，依碱基互补配对原理， 通过放射自显影或非放射自显影在组织切片、细胞 等上对待测核酸进行定性、定位和相对定量的一种 分析方法。
基本步骤
04.2抑制或者沉默表达基因
Hale Waihona Puke Baidu反义RNA
反义RNA是指能与mRNA互补 配对的RNA分子，是相对DNA 而言的。
04.2抑制或者沉默表达基因
RNA干扰
RNA干扰是指由短双链RNA诱导同源mRNA的降解过程，从转录后水平抑制基因表达。 干扰过程的主要步骤：
（1）长双链RNA被特异性核酸酶切成21-23bp的短双链RNA，称为siRNA(small interfering RNA) （2）siRNA与细胞内的某些酶和蛋白质形成复合体RISC （3）RISC识别与siRNA有同源序列的mRNA，在特异位点切断mRNA
05 | 编码产物相互作用蛋白的研究
酵母双杂交系统的特点
1.在细胞内研究，能真实地反映蛋白间的相互作用 2.方法敏感性高
在其基础上研究出： 1.用于研究多蛋白质复合体之间相互作用的酵母三杂交系统 2.用于从大量突变体中筛选导致蛋白相互作用减弱的反向双杂交系统
功能失活策略
• 功能失活(loss-of-function)策略即通过观察某一 细胞或个体在新基因的功能被部分或全部失活后的 细胞生物学行为或个体表型遗传性状变化来鉴定基 因的功能
04 |功能的实验确认
功能获得策略常见方法
1.基因转导 2.转基因技术 3.过表达技术
动物转基因技术的原理与方法
04.2动物转基因技术的原理与方法
目的基因的制备
1、双链cDNA与载体连接构成重组子； 2、将重组子转入受体菌； 3、筛选和鉴定重组子克隆并进行扩增，获得大 量目的基因cDNA； 4、受体菌中获得重组子； 5、酶切鉴定获得的目的基因。
04.2动物转基因技术的原理与方法
转基因载体的构建
结构基因 调控序列（启动子、终止子）：根据研究目 的不同选择相应调控序列 报告基因（半乳糖苷酶、绿色荧光蛋白等）
04.2动物转基因技术的原理与方法
基因转移方法
显微注射法 胚胎干细胞法 反转录病毒法 精子载体法 电转移法 体细胞核移植法（克隆羊多莉） 受体介导法 磷酸钙共沉淀法 脂质体载体法 嵌合体动物法
04.2动物转基因技术的原理与方法
转基因动物的检测与鉴定
PCR：实验前应对PCR引物的特异性和敏感性进行检测 Southern blotting：PCR检测阳性后，确定外源基因整合方式 染色体原位杂交：确定转基因整合到染色体的具体位置 Western blotting、免疫组化：研究转基因的表达水平
05 | 编码产物相互作用蛋白的研究
酵母双杂交系统
1.以真核细胞转录激活因子的结构和活性特点为基础 2.转录因子由一个DNA结合结构域（BD）和一个转录激活结构域（AD）组成 3.酵母蛋白GAL4是一个典型的转录激活因子，能转录活化酵母半乳糖苷酶 4.研究者分别构建了含GAL4 BD和GAL4 AD的两个酵母融合蛋白表达载体 5.遗传学操作突变酵母编码色氨酸、亮氨酸和组氨酸基因和敲除GAL４蛋白抑制蛋白GAL８０的 基因，使酵母不能在缺乏这三种氨基酸的条件下生长
05 | 编码产物相互作用蛋白的研究
将靶蛋白X基因克隆在酵母BD表达载体上 将待筛选的蛋白Y基因克隆在酵母AD表达载体上 若X、Y蛋白有相互作用，则GAL4的BD和AD区结 合，发挥转录激活功能，就可进行 颜色筛选：β-半乳糖苷酶在X-gal存在下，呈蓝色 营养缺陷型筛选：能否在缺乏相应氨基酸的培养基 中生长？
04.2动物转基因技术的原理与方法
基因转移方法
显微注射法 胚胎干细胞法 反转录病毒法 精子载体法 电转移法 体细胞核移植法 受体介导法 磷酸钙共沉淀法 脂质体载体法 嵌合体动物法
04.2动物转基因技术的原理与方法
基因转移方法
显微注射法 胚胎干细胞法 反转录病毒法 精子载体法 电转移法 体细胞核移植法 受体介导法 磷酸钙共沉淀法 脂质体载体法 嵌合体动物法
新基因功能研究的策略与方法
Presenter:XXX
目录
CONTENTS
01 全长cDNA的克隆 02 生物信息学分析 03 表达谱分析 04 功能的实验确认 05 编码产物相互作用蛋白的研究
04 | 功能的实验确认
功能获得策略
• 功能获得(gain-of-function)策略即通过将新基因 直接导人某一细胞或个体中，通过观察细胞生物学 行为或个体表型遗传性状的变化来鉴定基因功能