四种蛋白质测定方法的比较研究
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DOI:10．3969/J.ISSN．1671-6027．2012．03.023
蛋白质在生物体内占有特殊的地位，是构成生物体细胞 组织的重要成分，它和核酸是构成原生质的主要成分，是生 命现象的物质基础。作为生命的物质基础之一，蛋白质在催 化生命体内各种反应进行、调节代谢、抵御外来物质入侵及 控制遗传信息等方面都起着至关重要的作用。蛋白质的分离 与定性、定量分析是生物化学和其他生物学科、食品检验、临 床检验、疾病诊断、生物药物分离提纯和质量检验中最重要 的工作。
参考文献 [1] 张爱武.食品中蛋白质测定方法的研究进展[J].农产品加
工学刊,2008,(1):80-81. [2] 瞿鹏,等.蛋白质测定的研究进展[J].商丘师范学院学报,
2002,18(2):107-110. [3] 叶应妩，等.全国临床检验操作规程[M].南京：东南大学出
版社,2006:337. [4] 吴耀生，等. 新编生物化学实验[M].北京：人民卫生出版
表 3 Folin-酚试剂法
曲线。 取待测蛋白质溶液 1 mL，加入蒸馏水 3 mL，摇匀，按上
述方法在 595 nm 波长处测定光吸收值，并从标准曲线上查 出待测蛋白质的浓度。
表 5 四种测定血清蛋白质方法的结果（单位:g/L）
A750 值。以 A750 为纵坐标，蛋白质浓度为横坐标，绘制标准 曲线。
取普通试管 2 支，各加入待测溶液 1.0 mL，在分别加入 试剂甲 5.0 mL，混匀后放置 10 min，在各加入试剂乙 0.5 mL，迅速混匀，室温放置 30 min，于 750 nm 波长下测定吸 光度，并记录结果。
表 4 考马斯亮蓝 G-250 法
2.4 考马斯亮蓝 G- 250 法 按表 4 分别向每只试管加入各试剂，摇匀。选用光程为
双缩脲法对不同蛋白质产生的颜色反应深浅相近,不受 温度影响。试剂单一，方法简便，可快速测定蛋白质含量，但 灵敏度稍低。紫外吸收法是采用 280 nm 的光吸收法，该法简 便、灵敏、快速,消耗样品量少，低浓度盐类不干扰测定，不足 之处是测定与标准蛋白质中酪氨酸和色氨酸含量差异较大 的蛋白质，有一定的误差。Folin- 酚试剂法配制试剂繁琐耗 时，干扰物质多，操作要求严格，该法由于两步呈色反应可以 叠加，其灵敏度特别高，比双缩脲法高 100 倍，肽键显色效果 增强减少了因蛋白质种类引起的偏差，所以适于微量蛋白质 的测定。考马斯亮蓝 G- 250 与蛋白质结合反应十分迅速而稳 定，2min 左右即可达到平衡，其结合物室温下 1h 内保持稳 定。考马斯亮蓝 G- 250 法是目前灵敏度最高的蛋白质测定方 法，最低蛋白质检测量可达 1.0μg 这是因为蛋白质与染料结 合后产生的颜色变化很大，该种方法操作简便，使用的试剂 少，显色剂容易配制，且干扰物质少，如糖、缓冲液还原剂和 络合剂等均不影响显色。这四种测定血清蛋白质含量的方 法，灵敏度高低不同，可以满足不同类型蛋白质的检测。每种 测定法都有其优缺点，因此，在选择方法时应考虑：（1）实验 对测定所要求的灵敏度和精确度；（2）测定所要花费的时间； （3）蛋白质的性质；（4）溶液中存在的干扰物质等因素。虽然 双缩脲法的灵敏度稍低，但反应干扰因素少且操作方法简便 快捷，适用于临床生产应用中的大批量血清样本的测定。因 此双缩脲试剂法作为首选方法可以广泛应用于兽医临床血 清蛋白质的测定。
按表 2 分别向每只试管加入各试剂，摇匀。选用光程为 表 2 紫外吸收测定法
1cm 的石英比色杯，在 280nm 波长处分别测定各管溶液的 A280 值。以 A280 为纵坐标，蛋白质浓度为横坐标，绘制标准 曲线。
表 1 双缩脲试剂法
作者简介：刘世清（1964~），安徽萧县人，硕士，主要从事奶牛 营养和管理研究工作
按表 1 分别向每只试管加入各试剂，摇匀。选用光程为 1cm 的石英比色杯，在 540nm 波长处分别测定各管溶液的
A540 值。以 A540 为纵坐标，蛋白质浓度为横坐标，绘制标准 曲线。
取待测蛋白质溶液 1.0mL，加入蒸馏水 3.0mL，摇匀，按 上述方法在 540nm 波长处测定吸光度值，并从标准曲线上查 出待测蛋白质的浓度。 2.2 紫外（UV）吸收测定法
畜牧兽医科技信息
2012 年第 3 期 39
试验研究
取待测蛋白质溶液 1.0 mL，加入蒸馏水 3.0 mL，摇匀，按上 述方法在 280nm 波长处测定吸光度值，并从标准曲线上查出 待测蛋白质的浓度。 2.3 Folin- 酚试剂法
按表 3 分别向每只试管加入各试剂摇匀，选用光程为 1 cm 的石英比色杯，在 750nm 波长处分别测定各管溶液的
1 cm 的石英比色杯，在 595nm 波长处分别测定各管溶液的 A595 值。以 A595 为纵坐标，蛋白质浓度为横坐标，绘制标准
表 5 可见，每两种方法之间两两比较后，P(t 双 - 紫)>0. 05,P( t 紫 - 酚)>0.05,P(t 酚 - 考)>0.05,P(t 双 - 考)>0.05,P(t 双 - 酚)>0.05,P (t 紫 - 考)>0.05,t 检验结果的 P 值均大于 0.05， 四种方法测得的血清中蛋白质含量之间均差异不显著。 3 结果与分析
试验研究
四种蛋白质测定方法的比较研究
刘世清，刘洪玉
（安徽省蚌埠市和平乳业有限公司，蚌埠 233000）
摘 要：目的 比较四种方法对血清蛋白质测定结果有无差异，以便为临床选择适宜血清蛋白质测定方法提供理论参考 依据。方法 用双缩脲试剂法、紫外吸收测定法、Folin- 酚试剂法、考马斯亮蓝法分别测定 20 头中国荷斯坦奶牛血清蛋白 质含量。结果 经 t 检验 P 值均大于 0.05，四种方法测得血清蛋白质含量之间均差异不显著。结论 双缩脲试剂法具有操 作方便、快速、准确的特点，建议作为兽医临床检验首选方法。 关键词：蛋白质；测定方法；比较
蛋白质的测定方法有很多种，本试验就常用于生产实际 的四种测定蛋白质方法进行比较与研究，以便获得一种在实 际生产中最为方便、经济实用的血清蛋白质测定方法。 1 试验动物与材料 1.1 试验动物
在蚌埠奶牛场选择体重 500～550kg，2～4 胎泌乳期和 产奶量相近的 20 头中国荷斯坦奶牛颈静脉采血，分离血清 后低温冷冻贮藏备用。 1.2 试验仪器与试剂
UV- 1240 型紫外可见分光光度计、岛津（苏州）有限公司 生产，FA- 1004 型电子分析天平、上海精科天平仪器厂生产， LDR4- 8.4C 低速冷冻离心机、北京医用离心机厂生产。
双 缩 脲 试 剂 ：1.5g 硫 酸 铜 和 6.0g 酒 石 酸 钾 钠 溶 于 500.0mL 蒸馏水中，边搅拌边加入 300.0mL 10.0％的 NaOH 溶液，用水稀释至 1000.0mL。 2 试验方法 2.1 双缩脲法
社，2002：35-39.
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
40 2012 年第 3 期
畜牧兽医科技信息
蛋白质在生物体内占有特殊的地位，是构成生物体细胞 组织的重要成分，它和核酸是构成原生质的主要成分，是生 命现象的物质基础。作为生命的物质基础之一，蛋白质在催 化生命体内各种反应进行、调节代谢、抵御外来物质入侵及 控制遗传信息等方面都起着至关重要的作用。蛋白质的分离 与定性、定量分析是生物化学和其他生物学科、食品检验、临 床检验、疾病诊断、生物药物分离提纯和质量检验中最重要 的工作。
参考文献 [1] 张爱武.食品中蛋白质测定方法的研究进展[J].农产品加
工学刊,2008,(1):80-81. [2] 瞿鹏,等.蛋白质测定的研究进展[J].商丘师范学院学报,
2002,18(2):107-110. [3] 叶应妩，等.全国临床检验操作规程[M].南京：东南大学出
版社,2006:337. [4] 吴耀生，等. 新编生物化学实验[M].北京：人民卫生出版
表 3 Folin-酚试剂法
曲线。 取待测蛋白质溶液 1 mL，加入蒸馏水 3 mL，摇匀，按上
述方法在 595 nm 波长处测定光吸收值，并从标准曲线上查 出待测蛋白质的浓度。
表 5 四种测定血清蛋白质方法的结果（单位:g/L）
A750 值。以 A750 为纵坐标，蛋白质浓度为横坐标，绘制标准 曲线。
取普通试管 2 支，各加入待测溶液 1.0 mL，在分别加入 试剂甲 5.0 mL，混匀后放置 10 min，在各加入试剂乙 0.5 mL，迅速混匀，室温放置 30 min，于 750 nm 波长下测定吸 光度，并记录结果。
表 4 考马斯亮蓝 G-250 法
2.4 考马斯亮蓝 G- 250 法 按表 4 分别向每只试管加入各试剂，摇匀。选用光程为
双缩脲法对不同蛋白质产生的颜色反应深浅相近,不受 温度影响。试剂单一，方法简便，可快速测定蛋白质含量，但 灵敏度稍低。紫外吸收法是采用 280 nm 的光吸收法，该法简 便、灵敏、快速,消耗样品量少，低浓度盐类不干扰测定，不足 之处是测定与标准蛋白质中酪氨酸和色氨酸含量差异较大 的蛋白质，有一定的误差。Folin- 酚试剂法配制试剂繁琐耗 时，干扰物质多，操作要求严格，该法由于两步呈色反应可以 叠加，其灵敏度特别高，比双缩脲法高 100 倍，肽键显色效果 增强减少了因蛋白质种类引起的偏差，所以适于微量蛋白质 的测定。考马斯亮蓝 G- 250 与蛋白质结合反应十分迅速而稳 定，2min 左右即可达到平衡，其结合物室温下 1h 内保持稳 定。考马斯亮蓝 G- 250 法是目前灵敏度最高的蛋白质测定方 法，最低蛋白质检测量可达 1.0μg 这是因为蛋白质与染料结 合后产生的颜色变化很大，该种方法操作简便，使用的试剂 少，显色剂容易配制，且干扰物质少，如糖、缓冲液还原剂和 络合剂等均不影响显色。这四种测定血清蛋白质含量的方 法，灵敏度高低不同，可以满足不同类型蛋白质的检测。每种 测定法都有其优缺点，因此，在选择方法时应考虑：（1）实验 对测定所要求的灵敏度和精确度；（2）测定所要花费的时间； （3）蛋白质的性质；（4）溶液中存在的干扰物质等因素。虽然 双缩脲法的灵敏度稍低，但反应干扰因素少且操作方法简便 快捷，适用于临床生产应用中的大批量血清样本的测定。因 此双缩脲试剂法作为首选方法可以广泛应用于兽医临床血 清蛋白质的测定。
按表 2 分别向每只试管加入各试剂，摇匀。选用光程为 表 2 紫外吸收测定法
1cm 的石英比色杯，在 280nm 波长处分别测定各管溶液的 A280 值。以 A280 为纵坐标，蛋白质浓度为横坐标，绘制标准 曲线。
表 1 双缩脲试剂法
作者简介：刘世清（1964~），安徽萧县人，硕士，主要从事奶牛 营养和管理研究工作
按表 1 分别向每只试管加入各试剂，摇匀。选用光程为 1cm 的石英比色杯，在 540nm 波长处分别测定各管溶液的
A540 值。以 A540 为纵坐标，蛋白质浓度为横坐标，绘制标准 曲线。
取待测蛋白质溶液 1.0mL，加入蒸馏水 3.0mL，摇匀，按 上述方法在 540nm 波长处测定吸光度值，并从标准曲线上查 出待测蛋白质的浓度。 2.2 紫外（UV）吸收测定法
畜牧兽医科技信息
2012 年第 3 期 39
试验研究
取待测蛋白质溶液 1.0 mL，加入蒸馏水 3.0 mL，摇匀，按上 述方法在 280nm 波长处测定吸光度值，并从标准曲线上查出 待测蛋白质的浓度。 2.3 Folin- 酚试剂法
按表 3 分别向每只试管加入各试剂摇匀，选用光程为 1 cm 的石英比色杯，在 750nm 波长处分别测定各管溶液的
1 cm 的石英比色杯，在 595nm 波长处分别测定各管溶液的 A595 值。以 A595 为纵坐标，蛋白质浓度为横坐标，绘制标准
表 5 可见，每两种方法之间两两比较后，P(t 双 - 紫)>0. 05,P( t 紫 - 酚)>0.05,P(t 酚 - 考)>0.05,P(t 双 - 考)>0.05,P(t 双 - 酚)>0.05,P (t 紫 - 考)>0.05,t 检验结果的 P 值均大于 0.05， 四种方法测得的血清中蛋白质含量之间均差异不显著。 3 结果与分析
试验研究
四种蛋白质测定方法的比较研究
刘世清，刘洪玉
（安徽省蚌埠市和平乳业有限公司，蚌埠 233000）
摘 要：目的 比较四种方法对血清蛋白质测定结果有无差异，以便为临床选择适宜血清蛋白质测定方法提供理论参考 依据。方法 用双缩脲试剂法、紫外吸收测定法、Folin- 酚试剂法、考马斯亮蓝法分别测定 20 头中国荷斯坦奶牛血清蛋白 质含量。结果 经 t 检验 P 值均大于 0.05，四种方法测得血清蛋白质含量之间均差异不显著。结论 双缩脲试剂法具有操 作方便、快速、准确的特点，建议作为兽医临床检验首选方法。 关键词：蛋白质；测定方法；比较
蛋白质的测定方法有很多种，本试验就常用于生产实际 的四种测定蛋白质方法进行比较与研究，以便获得一种在实 际生产中最为方便、经济实用的血清蛋白质测定方法。 1 试验动物与材料 1.1 试验动物
在蚌埠奶牛场选择体重 500～550kg，2～4 胎泌乳期和 产奶量相近的 20 头中国荷斯坦奶牛颈静脉采血，分离血清 后低温冷冻贮藏备用。 1.2 试验仪器与试剂
UV- 1240 型紫外可见分光光度计、岛津（苏州）有限公司 生产，FA- 1004 型电子分析天平、上海精科天平仪器厂生产， LDR4- 8.4C 低速冷冻离心机、北京医用离心机厂生产。
双 缩 脲 试 剂 ：1.5g 硫 酸 铜 和 6.0g 酒 石 酸 钾 钠 溶 于 500.0mL 蒸馏水中，边搅拌边加入 300.0mL 10.0％的 NaOH 溶液，用水稀释至 1000.0mL。 2 试验方法 2.1 双缩脲法
社，2002：35-39.
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
40 2012 年第 3 期
畜牧兽医科技信息