第2章 生物工业菌种与种子的扩大培养

菌悬液的制备
具体操作： 关键是制备一定浓度的分散均匀的单细胞或单孢子 悬液。 (1) 细胞的同步培养； (2) 过滤或离心、洗涤，并收集菌体； (3) 配制菌悬液
菌悬液的制备
具体操作： 注意点： (i) 用生理盐水或缓冲溶液配制； (ii) 应注意分散度 ； (iii) 最后制得的菌悬液，霉菌孢子或酵母菌 细胞的浓度大约为106~107个/ml，放线菌和 细菌的浓度大约为108个/ml。
3. 操作 诱变处理后细胞在液体培养基中培养几小时，使 细胞的遗传物质复制，繁殖几代，以得到纯的变 异细胞。这样，稳定的变异就会显现出来。一般 也就是过夜。
5. 注意点
(1) 为准确起见，照射前紫外灯应先预热20~30min， 然后再进行处理； (2) 不同的微生物对于紫外线的敏感程度不一样， 诱变剂量也不同。目前趋向采用低剂量、长时间 处理； (3)为了避免光复活现象，处理过程应在暗室的红 光下操作，处理完毕后，将盛菌悬液的器皿用黑 布包起来培养，然后再进行分离筛选。
实例：碱性纤维素酶产生菌的筛选 自然选育过程： 固体分离培养基采用CMC为唯一碳源， (d) 分离纯化： pH 10.5条件下涂布培养3-4天 (e)鉴定筛选：选择有凹陷圈的菌落，而且越大越 好，得到初筛菌种。 (f) 复筛： 通过生产性能测试，摸索条件，分 析产酶率，得到1-3株较好菌株
(g) 保藏及进一步育种
出发菌株的选择 诱变
菌悬液制备 中间培养
前培养
变异菌株分离筛选
出发菌株的选择
1、定义 工业上用来进行诱变或基因重组育种处理的起始 菌株称为出发菌株(parent strain)。 2. 满足要求
对诱变剂敏感性大、变异幅度广、产量高
出发菌株的选择
3. 出发菌株种类
出发菌株 从自然界中分离得到的 野生型菌株 自发突变经筛选得到的 高产菌株 （√） 已诱变过的菌株 特点 对诱变因素敏感，容易发生变异 与野生型菌株较相象，容易达到 较好的诱变效果 多次诱变可能效果迭加，积累更 多的提高，但难度大
诱变剂种类
诱变
2. 诱变机理 核酸物质吸收一定能量的紫外线后，它的某些电子 将被提升到较高的能量水平，从而引起分子激发而 造成突变。因此，紫外线的诱变作用是由于它引起 DNA分子结构变化而造成的。
诱变
2. 诱变机理 这种变化包括：DNA链的断裂，DNA分子内和分子 间的交联形成嘧啶二聚体。
诱变
一、工业微生物菌种的选育 4. 诱变育种 ②用合适的方法淘汰负效应变异株，选出极少数 性能优良的正变异株，培育优良高产菌株。 优势：方法简便、工作速度快、效果显著。 意义：
诱变育种不仅能提高菌种的生产性能，而且能改 进产品的质量、扩大品种和简化生产工艺等。
第二节 工业微生物菌种的选育与改良
一、工业微生物菌种的选育 4. 诱变育种 诱变育种的一般程序 ：
II. 定义 给混合菌种提供一些有利于所需菌株生长或不利于 其他菌型生长的条件，以促使目标菌株大量繁殖， 有利于分离，也叫富集培养。
http://life.cczu.edu.cn
增殖培养
III. 富集培养的方案
(i) 定向培养 采用特定的有利于目的微生物富集的条件进行 培养。 使用专一性底物、pH条件、培养时间以及培养 温度都是定向培养的方法。
2．酵母菌（yeast） 例：啤酒酵母 3．霉菌（mould） 例：曲霉、青霉
http://life.cczu.edu.cn
第一节 工业生产常用微生物及要求
一、 工业生产常用的微生物
工业上用的微生物主要有六类： 4．放线菌（actinomyeetes） 主要是生产各种抗生素。例：链霉菌生产链霉素； 小单孢菌生产庆大霉素。 5．担子菌（basidiomycetes） 也就是菇类。例：灵芝、香菇 6．藻类（alga） 一类自养性生物。例：螺旋藻、蓝绿藻 http://life.cczu.edu.cn
预处理
I. 目的 处理土样，为即将进行的培养做准备。
II. 操作方法
如果是水样，则不需要再制备悬液；如果是土样， 则将采集的土样按一定的比例溶解在去离子水中， 振荡搅匀，制成样品悬液。等待划线。 一般制成10-2菌悬液，也就是1g土样放入99ml去 离子水中。
增殖培养
I. 目的 针对目标菌株可能较少、杂菌较多而进行。操作目 的是为了增加目标菌株的数量；如果目标菌株较多， 则没有必要，直接分离即可。
操作步骤： ①将样品不断的稀释，使其分散到最低限度 ②然后将稀释液涂布于培养基平板上进行培养 ③待长出独立的单个菌落，进行挑选分离。 优势：在培养基上分离的菌落单一均匀，获得纯种的 概率大。
I. 稀释分离法
单菌落
纯种分离
分离方法： 单菌落分离法
II. 划线分离法
操作步骤： ①首先倒培养基平板 ②然后用接种针（接种环）挑取样品，在 平板上有规则的划线。
在培养基中加入0.05%的Z-PAOx，每隔2-3天移去 一半培养物，补充新鲜培养基，不断分析样品。
产品鉴定及筛选
从两个角度出发：产物角度、形态角度 II. 从形态角度出发
也就是观察菌落的外观形态，它是微生物的一 个重要表征。 例：多糖产生菌在适当的培养基上生长时，产生 粘液性的菌落
第二节 工业微生物菌种的选育与改良
前培养
诱变处理前，可以在加入嘌呤、嘧啶等碱基或酵母 膏的培养基中培养20-30min。
前培养可以使变异率大幅提高。
诱变
1. 诱变剂
定义： 能够提高生物体突变频率的物质称为诱变剂。
物理诱变剂 紫外、X射线、γ射线、α 射线、β射线、等离子、 快中子、超声波等 化学诱变剂 甲基磺酸乙酯(EMS)、硫 酸二乙酯(DES)、亚硝基 胍(NTG)
第二节 工业微生物菌种的选育与改良
一、工业微生物菌种的选育 4. 诱变育种
定义： 通过诱变剂处理菌种，大大提高菌种的突变频 率，扩大变异幅度，从中选出具有优良特性的 变异菌株，称为诱变育种。 原理： 采用物理、化学等诱变因素使微生物DNA碱基 对排列发生变化，造成突变，从而使细胞功能 发生改变。
第二节 工业微生物菌种的选育与改良
第二节 工业微生物菌种的选育与改良
基因突变（菌种选育） （非定向筛选） 微生物筛选 自然选育 诱变育种 杂交 基因重组（菌种改良） 原生质体融合
（半定向筛选）
DNA重组
基因直接进化 （定向筛选）
点突变 易错PCR 同序法 DNA shuffling (体外同源重组)
第二节 工业微生物菌种的选育与改良
一、工业微生物菌种的选育 实例：碱性纤维素酶产生菌的筛选 产生菌：嗜碱芽孢杆菌
自然选育过程： (a) 采样： 造纸厂土样
1g土样溶于99ml去离子水中，振荡均匀， (b) 预处理： 过滤，得菌悬液 (c) 增殖培养： 经80℃，30分钟预处理
第二节 工业微生物菌种的选育与改良
一Leabharlann Baidu工业微生物菌种的选育
3. 诱变仪器 265nm的紫外光，对应于功率为15W的紫外灯 4. 诱变操作 (1) 将10ml菌悬液放在直径为9cm的培养皿中，液 层厚度约为2mm，启动磁力搅拌器； (2) 使用15W的紫外灯管，照射距离为30cm左右， 照射时间以几秒至数十分钟为宜，具芽孢的菌株 需处理10min左右。
诱变
第一节 工业生产常用微生物及要求
二、微生物工业对菌种的要求
具备四个条件： 1. 原料廉价、生长迅速、目的产物产量高； 2. 易于控制培养条件，酶活性高，发酵周期较短； 3. 抗杂菌和噬菌体的能力强；
4. 菌种遗传性能稳定，不易变异和退化，不生产任何 有害的生物活性物质和毒素，保证生产安全。
http://life.cczu.edu.cn
第二节 工业微生物菌种的选育与改良
一、工业微生物菌种的选育 3. 自然选育 自然选育又可以分为两种情况： 从自然界中分离获得菌株（重点） 从自发突变体中获得菌株
http://life.cczu.edu.cn
第二节 工业微生物菌种的选育与改良
一、工业微生物菌种的选育 从自然界中分离获得菌株 一般过程： 土样（水样）的采集 预处理 纯种分离
增殖培养
产品的鉴定及筛选
初步工艺 生产性能测试 复筛 条件摸索 较优菌株1-3株 某些必要试验和毒性试验等
保藏、进一步做生产试验或作为育种的出发菌株
土样（水样）的采集
I. 地点的确定 地点的确定要根据筛选的目的、微生物的分布情况 以及菌种的主要特征与外界环境关系等进行综合、 具体的分析来决定。 一般的话，可以从土壤中采样，种类是最多的。 II. 采样的操作方法 用小铲除去表层土壤，取离地面5-15cm处的土样， 放入预先消毒好的塑料袋中，扎好，记录采样时间、 地点、环境情况等，以备日后考查。
菌悬液的制备
方法： 同步培养法 在诱变育种中，处理材料一般采用生理状态一致的 单倍体、单核细胞，即菌悬液的细胞应尽可能达到 同步生长状态，称为同步培养。
菌悬液的制备
同步化方法：
菌种 培养方法
细菌
霉菌 放线菌
一般要求培养至生长旺盛的对数期，变异率较 高，重复性好 使用刚刚成熟的分生孢子（将其放在液体培 养基中短时间培养，使孢子孵化，处于活化 状态，并恰好未形成菌丝体，易于诱变。）
第二节 工业微生物菌种的选育与改良
一、工业微生物菌种的选育 2. 两者间的区别 (1) 选育过程 自然选育：被动选择，不对菌体做任何人工处理
诱变育种：主动选择，对菌体施加人工影响 (2) 选育效果 要达到相同的水平，诱变育种所需要的时间要比 自然选育的时间短很多； 对选育工艺而言，一般先对菌群做自然选育；然 后再做诱变育种，使其生产性能进一步提高。
增殖培养
III. 富集培养的方案 (iii) 随机分离 从产物入手，通过设计高产培养基和建立快速 灵敏专一的筛选方法，从随机分离的菌落中筛选 出所需的目的菌。 技术关键：产物合成条件的选择与控制及相应 筛选方法的确定。
纯种分离
分离方法： 单菌落分离法 具体的操作主要有稀释分离法和划线分离法两种。 I. 稀释分离法
一、工业微生物菌种的选育 1. 定义 (1) 自然选育 在生产过程中，不经过人工诱变处理，而根据菌 种的自发突变进行菌种筛选的过程，叫做自然选 育或者自然分离。
(2) 诱变育种 用各种物理、化学的因素人工诱发基因突变，从 而进行的筛选，称为诱变育种。
http://life.cczu.edu.cn
优势： 简单、快捷
注意点： 采用单菌落分离法要注意菌体的分散度。有不 同的菌体长在一起的话，有时会发生吻合现象， 形成异核菌落。
II. 划线分离法
斜线法 曲线法 方格法 放射法 四格法
产品鉴定及筛选
从两个角度出发：产物角度、形态角度 I. 从产物角度出发 也就是在培养时以产物的形成来有目的的设计 培养基。 例：醛肟水解酶的筛选
http://life.cczu.edu.cn
增殖培养
III. 富集培养的方案 (ii) 从菌种的分类学角度考虑
目标菌种
细菌 霉菌 放线菌
分离方法
培养基中添加浓度一般为50 μg/ml 的抗真菌剂(如 放线菌酮和制霉素)，可以抑制真菌的生长 分离培养基中加入一定的抗生素，如青霉素和 链霉素，抑制细菌生长 悬液中加入10%的酚数滴，就可以抑制霉菌和 细菌的生长
中间培养
1. 目的 对于刚经诱变剂处理过的菌株，有一个表现迟滞 的过程（生理延迟），需3代以上的繁殖才能将 突变性状表现出来。
2. 后果 若不经液体培养基的中间培养，直接在平皿上分 离就会出现不同变异菌体同时存在于一个菌落内 的可能，形成混杂菌落，以致造成筛选结果的不 稳定和将来的菌株退化。
中间培养
一、工业微生物菌种的选育
4. 诱变育种 正突变 对生产有利的突变称为正突变。 突变方向 负突变 造成菌株衰退及生产质量下降 的突变称为负突变。 菌株发生正突变的概率低。 诱变育种的关键： ①以合适的诱变剂处理大量而均匀分散的微生物细 胞悬浮液，使个别存活的个体中DNA碱基变异频 率大幅提高；
第二节 工业微生物菌种的选育与改良
第二章 生物工业菌种与种子的 扩大培养
http://life.cczu.edu.cn
本章内容
一、工业生产常用的微生物及要求 二、工业微生物菌种的选育与改良 三、工业微生物菌种的衰退、复壮和保藏 四、种子的扩大培养
http://life.cczu.edu.cn
第一节 工业生产常用微生物及要求
一、 工业生产常用的微生物 工业上用的微生物主要有六类： 1．细菌（bacteria） 例：枯草芽孢杆菌、乳杆菌