SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)测定蛋白质分子量

实验七SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）测定蛋白质分

子量

实验数据：

标准蛋白质条带第一条第二条第三条第四条第五条

溴酚蓝前沿距离/cm 4.70

距离/cm 0.50 0.95 1.60 2.10 3.95 相对迁移率mr 0.11 0.20 0.34 0.45 0.84 分子量Mr 97400 66200 43000 31000 14400

LgMr 4.99 4.82 4.63 4.49 4.16

样品 1 2 3

溴酚蓝前沿/cm 4.90 4.80 4.60

样品迁移距离/cm 4.20 1.20 1.70

相对迁移率mr 0.86 0.25 0.37

标准曲线：

y=5.05-1.10x

结果：

样品 1 2 3

Mr 12706 59566 43954

mr 4.104 4.775 4.643

一. 实验目的和要求

1 学习SDS-PAGE测定蛋白质分子量的原理。

2 掌握垂直板电泳的操作方法。

3 运用SDS-PAGE测定蛋白质分子量及染色鉴定。

二 .实验原理

带电质点在电场中向带有异相电荷的电极移动，这种现象称为电泳。

区带电泳是在半固相或胶状介质上加一个点或一薄层样品溶液，然后加电场，分子在支持介质上或支持介质中迁移。支持介质的作用主要是为了防止机械干扰和由于温度变化以及大分子溶液的高密度而产生的对流。

区带电泳使用不同的支持介质，早期有滤纸、玻璃珠、淀粉粒、纤维素粉、海砂、海绵、聚氯乙烯树脂；以后有淀粉凝胶、琼脂凝胶、醋酸纤维素膜，现在则多用聚丙烯酰胺（PAGE）和琼脂糖凝胶。

PAGE根据其有无浓缩效应，分为连续系统和不连续系统两大类，连续系统电泳体系中缓冲液pH值及凝胶浓度相同，带电颗粒在电场作用下，主要靠电荷和分子筛效应。不连续系统中由于缓冲液离子成分，pH，凝胶浓度及电位梯度的不连续性，带电颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应，分子筛效应，还具有浓缩效应，因而其分离条带清晰度及分辨率均较前者佳。

SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS（十二烷基磺酸钠）， SDS能断裂分子内和分子间氢键，破坏蛋白质的二级和三级结构，强还原剂能使半胱氨酸之间的二硫键断裂，蛋白质在一定浓度的含有强还原剂的SDS溶液中，与SDS分子按比例结合，形成带负电荷的SDS-蛋白质复合物，这种复合物由于结合大量的SDS，使蛋白质丧失了原有的电荷状态形成仅保持原有分子大小为特征的负离子团块，从而降低或消除了各种蛋白质分子之间天然的电荷差异，由于SDS与蛋白质的结合是按重量成比例的，因此在进行电泳时，蛋白质分子的迁移速度取决于分子大小。当分子量在15KD到200KD之间时，蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系，符合下式：logMW=K-bX，式中：MW为分子量，X为迁移率，k、b均为常数，若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量对数作图，可获得一条标准曲线，未知蛋白质在相同条件下进行电泳，根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。

SDS电泳的成功关键之一是电泳过程中，待别是样品制备过程中蛋白质与SDS的结合程度。影响它们结合的因素主要有三个：

1) 溶液中SDS单体的浓度，当单体浓度大于1mmol/L时大多数蛋白质与SDS结合的重量比为1:1.4，如果单休浓度降到0.5 mmol/L以下时，两者的结合比仅为1: 0.4这样就不能消除蛋白质原有的电荷差别，为保证蛋白质与SDS的充分结合，它们的重量比应该为1:4或1:3

2) 样品缓冲液的离子强度。SDS电泳的样品缓冲液离子强度较低，通常是10～

100mmol/L

3) 二硫键是否完全被还原

三. 实验试剂和器材

1.材料：

低分子量标准蛋白试剂盒:

低分子量标准蛋白：兔磷酸化酶

B MW=97,400

牛血清白蛋白 MW=66,200

兔肌动蛋白 MW=43,000

牛碳酸酐酶 MW=31,000

胰蛋白酶抑制剂 MW=20,100

鸡蛋清溶菌酶 MW=14,400

开封后溶于200µl蒸馏水，置-20℃保存，使用前室温融化，沸水浴中加热3-5分钟后上样。

样品1：称3mg样品1，加2 ml蒸馏水溶解。

2.实验试剂

(1) 30%丙烯酰胺（Acr）：称Acr30g，甲叉双丙烯酰胺

（Bis）0.8g，加蒸馏水至100ml，过滤后置棕色瓶中，

4℃贮存可用1-2月。

（2）10%SDS（十二烷基磺酸钠）

（3）1.5mol/L pH8.8 Tris-HCl缓冲液：称取Tris18.2g，

加入50ml水，用1mol/L盐酸调pH8.8，最后用蒸馏

水定容至100ml。

（4）1.0mol/LpH6.8Tris-HCl缓冲液：称取Tris12.1g，加

入50ml水，用1mol/L盐酸调pH6.8，最后用蒸馏水

定容至100ml。

（5）0.05mol/LpH8.0Tris-HCl缓冲液：称取Tris0.6g，加

入50ml水，用1mol/L盐酸调pH8.0，最后用蒸馏水定

容至100ml。

（7）10%过硫酸铵(AP)

（8）TEMED（四甲基乙二胺）

（9）样品溶解液：SDS（100mg）+巯基乙醇（0.1ml）+

溴酚蓝（2mg）+甘油（2g） +0.05mol/L pH8.0Tris-

HCl（2ml），最后定容至10ml。

（10）固定液：取50%甲醇454ml，冰乙酸46ml混匀。

（11）染色液：称取考马斯亮蓝R250 0.125g，加上述固定液

250ml，过滤后备用。

（12）脱色液：冰乙酸75ml，甲醇50ml，加蒸馏水定容至1000ml。

（13）电极缓冲液（内含0.1%SDS，0.05mol/LTris- 0.384mol/L甘氨酸缓冲液

pH8.3）：称Tris6.0g，甘氨酸28.8g，加入SDS1g，加蒸馏水使其溶解后定容至1000ml。

3. 实验器材

垂直板电泳装置

直流稳压电源

移液管