第三章 高效液相色谱
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高效液相色谱法
High Performance Liquid Chromatography
HPLC
高效液相色谱法
一、高效液相色谱法的特点 二、流程及主要部件 三、固定相和流动相 四、主要分离类型 五、影响分离的因素
HPLC定义
以液体作为流动相的色谱过程
高效液相色谱法的特点
高压 --- 150 ~ 350 x 105 Pa 高效 --- 3万塔板/米 高灵敏度 --- 10-9~ 10-11 g 高沸点、热不稳定有机及生化试样的高效分离分析方法
GC与HPLC比较
GC
HPLC
流动相 惰性气体（无亲和性，只 不同极性的液体（有一
起运载作用）
定亲和作用）
气体、沸点较低的化合物 分析对象
高沸点、不稳定的天 然产物、生物大分子、 高分子化合物
温度
较高
一般室温
高效液相色谱法的类型
（一）分配色谱 （二）吸附色谱 （三）离子交换色谱法 （四）排阻色谱法
分配色谱法
(Partition Chromatography)
分配色谱
液液分配色谱(LLPC)
液体固定相通过物理 吸附固定于载体表面
键合固定相分配色谱(LSPC)
有机分子通过化学反 应键合到载体表面
分配色谱–分离原理
不同组分在两相间分配系数不同
分配色谱固定相
固定相 --- 物理吸附 （担体 + 固定液）
全多孔型担体 薄壳型微珠担体
固定相 --- 化学键合
R --- 极性基团 疏水基团 离子交换基团
Si O O HCl
Si
O
Si OH
O
Cl Si(CH3)2R
Si OH
Si O Si(CH3)2R O Si O Si(CH3)2R
固定相的化学构造
非键合相表面
键合相表面
ODC
C18
C8
C1 Phenyl
-NH2
-CN
OH
OH
正相HPLC（normal phase HPLC）：
是由极性固定相和非极性（或弱极性）流动相所 组成的HPLC体系。其代表性的固定相是改性硅胶、氰 基柱等，代表性的流动相是正己烷。吸附色谱也属正 相HPLC。
反相HPLC（reversed phase HPLC）：
由非极性固定相和极性流动相所组成的液相色谱 体系，与正相HPLC体系正好相反。其代表性的固定相 是十八烷基键合硅胶(ODS柱），代表性的流动相是甲 醇和乙腈。是当今液相色谱的最主要分离模式。
ODS（Octa Decyltrichloro Silane)
正相分配色谱 反相分配色谱
固定相性质 键合基团
极性 极性基团
流动相性质
非极性
非极性 疏水基团
极性
出峰顺序 极性小先出 极性大先出
吸附色谱法
分离原理
溶质与流动相分子在吸附剂表面上 的吸附竞争
吸附色谱固定相
以固体吸附剂为固定相，如硅胶、 氧化铝等，较常使用的是5～10μm 的硅胶吸附剂。流动相可以是各种 不同极性的一元或多元溶剂。
离子交换色谱
分离原理
各种离子根据它们与树脂上的交换
基团的交换能力的不同而得到分离。
固定相
固定相为离子交换树脂， 流动相为无机酸或无机碱 的水溶液。
分离对象 离子或可离解的化合物
（无机离子、氨基酸、蛋白质等）
排阻色谱法
(凝胶色谱法)
分离原理 根据样品分子尺寸大小分离
大分子不能进入多孔中，不被保留，随 Vm流出 中分子部分进入多孔中，一般保留 小分子完全进入多孔中，长时间保留。
排阻色谱固定相
1. 软凝胶：铰链葡萄糖的多孔聚合物， 聚丙烯酰胺凝胶。（凝胶过滤色谱）
2. 半硬凝胶：聚苯乙烯珠（凝胶渗透色谱）
3. 高硬凝胶和玻璃：多孔玻璃或多孔硅球， 经化学键合处理，不随压力及溶剂改变 尺寸，（高效排阻色 谱）
应用
高分子化合物分子量及分子量分布 DNA碎片不同碱基支链分离。
高效液相色谱仪
流动液贮存提供脱气 输液泵 进样系统 分离系统 检测系统 控制与记录系统
日本岛津公司
美国Waters公司
流动相脱气方法
（1）真空泵抽滤系统 （2）低溶性惰性气体导入替换 （3）超声脱气 （4）在线脱气
输液系统
高压输液泵： 高压输液泵是液相色谱仪的关键部 件，其作用是将流动相以稳定的流 速或压力输送到色谱系统。 输液泵的稳定性直接关系到分析结 果的重复性和准确性。
活塞泵 注射泵 气动泵
进样系统
不使整个压力变 化的情况下将样品 注入色谱柱，通常 使用所谓六通阀
进样系统
不使整个压力变化的情况下将样品注入色谱柱， 通常使用所谓六通阀
色谱柱
色谱柱
泵 1
进 样
泵 2
色谱柱
色谱柱是实现分离的核心部件，要求柱效高、 柱容量大和性能稳定。柱性能与柱结构、填料 特性、填充质量和使用条件有关。
检测器
用来连续监测经色谱柱分离后的流出物 的组成和含量变化的装置。
紫外-可见检测器 荧光检测器 电化学检测器 蒸发光散射检测器 质谱检测器
紫外-可见检测器
❖ 单波长UV检测器，光源用Hg灯，加滤光 片 可 以 到 254 ， 280 ， 313 ， 334 ， 365 等 。 生化中用到很多。
❖ 多波长 光度计类似，光栅或棱镜分光
A＝lg（I0/It)= εb c
荧光检测器
许多有机化合物，特别是芳香族化合物、 被一定强度和波长的紫外光照射后，发射出较 激发光波长要长的荧光。但可以与发荧光物质 反应衍生化后检测。
特点： 有非常高的灵敏度和良好的选择性，灵 敏度要比紫外检测法高23个数量级，特别适合 于药物和生物化学样品的分析。
荧光检测器结构示意图
检测器
光源
滤光片
检测室
蒸发光散射检测器
蒸发光散射检测器适合于无紫外吸收、无 电活性和不发荧光的样品的检测。
电化学检测器 （以电导检测器为例）
电极 电极
电导仪
定性分析
标准样品法 谱库
HPLC-FTIR HPLC-MS
定量分析
峰面积∝浓度或质量
小结
四种色谱分离模式的分离机理及应用范围 反相色谱的概念 常用的固定相和流动相 紫外可见检测器
高效液相色谱应用实例
对有机酸具有高选择性和高灵敏度
柱后pH调节电导检测
有机酸分析系统流程图
1
9 2
10
6
3
8 4
7 5
1、2 泵 3 进样器 4 柱温箱 5 电导检测器 6 数据处理机 7 混合室 8 柱子 9 流动相 10 缓冲液
分析条件
分离条件 色谱柱：Shim-pack SCR-102H(8mmI.D．
×300mmL.) 1个或2个分析柱连接 保护柱 SCR-102H (6mmI.D.×50mmL.)
High Performance Liquid Chromatography
HPLC
高效液相色谱法
一、高效液相色谱法的特点 二、流程及主要部件 三、固定相和流动相 四、主要分离类型 五、影响分离的因素
HPLC定义
以液体作为流动相的色谱过程
高效液相色谱法的特点
高压 --- 150 ~ 350 x 105 Pa 高效 --- 3万塔板/米 高灵敏度 --- 10-9~ 10-11 g 高沸点、热不稳定有机及生化试样的高效分离分析方法
GC与HPLC比较
GC
HPLC
流动相 惰性气体（无亲和性，只 不同极性的液体（有一
起运载作用）
定亲和作用）
气体、沸点较低的化合物 分析对象
高沸点、不稳定的天 然产物、生物大分子、 高分子化合物
温度
较高
一般室温
高效液相色谱法的类型
（一）分配色谱 （二）吸附色谱 （三）离子交换色谱法 （四）排阻色谱法
分配色谱法
(Partition Chromatography)
分配色谱
液液分配色谱(LLPC)
液体固定相通过物理 吸附固定于载体表面
键合固定相分配色谱(LSPC)
有机分子通过化学反 应键合到载体表面
分配色谱–分离原理
不同组分在两相间分配系数不同
分配色谱固定相
固定相 --- 物理吸附 （担体 + 固定液）
全多孔型担体 薄壳型微珠担体
固定相 --- 化学键合
R --- 极性基团 疏水基团 离子交换基团
Si O O HCl
Si
O
Si OH
O
Cl Si(CH3)2R
Si OH
Si O Si(CH3)2R O Si O Si(CH3)2R
固定相的化学构造
非键合相表面
键合相表面
ODC
C18
C8
C1 Phenyl
-NH2
-CN
OH
OH
正相HPLC（normal phase HPLC）：
是由极性固定相和非极性（或弱极性）流动相所 组成的HPLC体系。其代表性的固定相是改性硅胶、氰 基柱等，代表性的流动相是正己烷。吸附色谱也属正 相HPLC。
反相HPLC（reversed phase HPLC）：
由非极性固定相和极性流动相所组成的液相色谱 体系，与正相HPLC体系正好相反。其代表性的固定相 是十八烷基键合硅胶(ODS柱），代表性的流动相是甲 醇和乙腈。是当今液相色谱的最主要分离模式。
ODS（Octa Decyltrichloro Silane)
正相分配色谱 反相分配色谱
固定相性质 键合基团
极性 极性基团
流动相性质
非极性
非极性 疏水基团
极性
出峰顺序 极性小先出 极性大先出
吸附色谱法
分离原理
溶质与流动相分子在吸附剂表面上 的吸附竞争
吸附色谱固定相
以固体吸附剂为固定相，如硅胶、 氧化铝等，较常使用的是5～10μm 的硅胶吸附剂。流动相可以是各种 不同极性的一元或多元溶剂。
离子交换色谱
分离原理
各种离子根据它们与树脂上的交换
基团的交换能力的不同而得到分离。
固定相
固定相为离子交换树脂， 流动相为无机酸或无机碱 的水溶液。
分离对象 离子或可离解的化合物
（无机离子、氨基酸、蛋白质等）
排阻色谱法
(凝胶色谱法)
分离原理 根据样品分子尺寸大小分离
大分子不能进入多孔中，不被保留，随 Vm流出 中分子部分进入多孔中，一般保留 小分子完全进入多孔中，长时间保留。
排阻色谱固定相
1. 软凝胶：铰链葡萄糖的多孔聚合物， 聚丙烯酰胺凝胶。（凝胶过滤色谱）
2. 半硬凝胶：聚苯乙烯珠（凝胶渗透色谱）
3. 高硬凝胶和玻璃：多孔玻璃或多孔硅球， 经化学键合处理，不随压力及溶剂改变 尺寸，（高效排阻色 谱）
应用
高分子化合物分子量及分子量分布 DNA碎片不同碱基支链分离。
高效液相色谱仪
流动液贮存提供脱气 输液泵 进样系统 分离系统 检测系统 控制与记录系统
日本岛津公司
美国Waters公司
流动相脱气方法
（1）真空泵抽滤系统 （2）低溶性惰性气体导入替换 （3）超声脱气 （4）在线脱气
输液系统
高压输液泵： 高压输液泵是液相色谱仪的关键部 件，其作用是将流动相以稳定的流 速或压力输送到色谱系统。 输液泵的稳定性直接关系到分析结 果的重复性和准确性。
活塞泵 注射泵 气动泵
进样系统
不使整个压力变 化的情况下将样品 注入色谱柱，通常 使用所谓六通阀
进样系统
不使整个压力变化的情况下将样品注入色谱柱， 通常使用所谓六通阀
色谱柱
色谱柱
泵 1
进 样
泵 2
色谱柱
色谱柱是实现分离的核心部件，要求柱效高、 柱容量大和性能稳定。柱性能与柱结构、填料 特性、填充质量和使用条件有关。
检测器
用来连续监测经色谱柱分离后的流出物 的组成和含量变化的装置。
紫外-可见检测器 荧光检测器 电化学检测器 蒸发光散射检测器 质谱检测器
紫外-可见检测器
❖ 单波长UV检测器，光源用Hg灯，加滤光 片 可 以 到 254 ， 280 ， 313 ， 334 ， 365 等 。 生化中用到很多。
❖ 多波长 光度计类似，光栅或棱镜分光
A＝lg（I0/It)= εb c
荧光检测器
许多有机化合物，特别是芳香族化合物、 被一定强度和波长的紫外光照射后，发射出较 激发光波长要长的荧光。但可以与发荧光物质 反应衍生化后检测。
特点： 有非常高的灵敏度和良好的选择性，灵 敏度要比紫外检测法高23个数量级，特别适合 于药物和生物化学样品的分析。
荧光检测器结构示意图
检测器
光源
滤光片
检测室
蒸发光散射检测器
蒸发光散射检测器适合于无紫外吸收、无 电活性和不发荧光的样品的检测。
电化学检测器 （以电导检测器为例）
电极 电极
电导仪
定性分析
标准样品法 谱库
HPLC-FTIR HPLC-MS
定量分析
峰面积∝浓度或质量
小结
四种色谱分离模式的分离机理及应用范围 反相色谱的概念 常用的固定相和流动相 紫外可见检测器
高效液相色谱应用实例
对有机酸具有高选择性和高灵敏度
柱后pH调节电导检测
有机酸分析系统流程图
1
9 2
10
6
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8 4
7 5
1、2 泵 3 进样器 4 柱温箱 5 电导检测器 6 数据处理机 7 混合室 8 柱子 9 流动相 10 缓冲液
分析条件
分离条件 色谱柱：Shim-pack SCR-102H(8mmI.D．
×300mmL.) 1个或2个分析柱连接 保护柱 SCR-102H (6mmI.D.×50mmL.)