目的基因的直接转化法和间接转化法

植物基因工程中目的基因的转化方法

张亚欢 20102170231 目的基因的直接转化法和间接转化法

摘要: 植物基因工程中目的基因的转化方法有间接转化法和直接转化法，主要阐述各种转化方法的原理、特点，以期为植物转基因方法的选择提供帮助.

关键词:植物基因工程; 转化方法; 间接转化法; 直接转化法

植物基因工程是通过导入外源基因对植物进行遗传转化，使植物获得抗虫、抗病、抗逆境、优质高产以及生产药物等诸多能力，从而使人们最大限度地利用植物资源。在植物基因工程中最为关键的是植物基因工程技术，该技术是以纯化的外源DNA导入植物细胞以期获得转基因植物的方法，其内容包括:目的基因的分离和鉴定；植物表达载体的构建；植物细胞的遗传转化；转化值物细胞的筛选；转基因植物的鉴定；外源基因表达的检测等[1]。自20 世纪90 年代以来，人们对外源基因导入植物细胞进行了大量的研究，先后采用了多种方法对目的基因进行遗传转化，迄今为止，已经建立了10 余种基因转化方法，这些方法可以分为两大类: 即间接转化法和直接转化法. 下面就这两类转化方法从其原理、特点作一简单介绍.

1 间接转化法

间接转化法是以生物体为媒介的植物转基因方法，有农杆菌介导法和病毒介导法.

1.1 农杆菌介导法

农杆菌介导法是以农杆菌为媒介对植物进行遗传转化的方法，该方法广泛地应用于愈伤组织、悬浮细胞、叶圆盘、茎切段、子叶切片、下胚轴切段、大田植株花茎的切段和薄层细胞等离体材料的转化，是目前双子叶植物常用的基因转移方法. 它是通过根癌农杆菌(Agrobacterim tumefaciens)的Ti 质粒(Tumer inducing plasmid) 和发根农杆菌(Agrobacterim rhizogenis )的Ri质粒(Root inducing Plasmid) 上的一段T一DNA区在农杆菌侵染植物形成肿瘤的过程中，T一DNA可以被转移到植物细胞并插入到染色体基因中[2]。由于T一DNA能够进行高频率的转移，而且Ti质粒和Ri质粒上可以插入到50kb 的外源基因，因此Ti 质粒和Ri质粒就成为植物基因转化的理想载体系统.

1.1.1 Ti 质粒载体系统

Ti 质粒是Lenent 等从根癌农杆菌中分离到的一种巨大质粒，可将外源基因置换T一DNA中的非必需序列使得外源基因整合到受体染色体上而获得稳定的表达，并能使植物细胞转化为肿瘤状态，大量合成冠瘿碱。冠瘿碱是根癌农杆菌的唯一碳源，有利于根癌农杆菌的繁殖和Ti质粒的转移，并进一步扩大侵染领域。

随着根癌农杆菌介导法基因转化技术的逐渐成熟与完善，它已成为常规育种的重要辅助手段，但在植物基因工程的实际操作中使用野生型的Ti 质粒直接作为基因克隆的载体仍然还有一些困难：①Ti质粒分子量很大，很难用常规的方法操作，另外在T一DNA 区段上不可能找到单一的DNA限制内切酶位点，不能插入外源DNA片段; ②野生型Ti 质粒对感染的植物具有毒性并能诱发冠瘿病，导入植物组织使其不能再生出健康的正常植株[3]，因此野生型的Ti 质粒必须经过

改造使之成为双元载体和共整合载体才能被利用。

1.1.2 Ri质粒载体系统

发根农杆菌的Ri 质粒与Ti 质粒有大致相同的结构. 当发根农杆菌侵染植物时,Ri质粒上的T一DNA可以转化并插入到植物细胞基因组中，其整合和表达的结果导致了大量毛状根的产生。经发根农杆菌侵染植物形成的毛状根离体培养都能够再生出可育植株( 因此从发展植物基因工程载体考虑，Ri 质粒是很有吸引力的[4])，而且许多植物的毛状根在离体培养条件下表现出次生代谢产物的合成能力，产物产量较正常植物及悬浮培养细胞的要高[5]。但由于目前对Ri 质粒的了解还不够充分，利用Ri 质粒载体系统还比较少，所以主要用在以研究次生代谢为目的的根组织培养工作和研究根瘤的形成上。

农杆菌的感染转化具有许多优点: ①操作简单不需要特殊仪器，培养周期短;

②技术较成熟，转化效率高; ③外源基因多以单拷贝或低拷贝插入受体细胞，稳定性好[6]; ④可利用不同的启动子控制目的基因在特定的器官进行特异表达; ⑤较少出现基因沉默现象; ⑥可将较大片段DNA完整地转移到植物基因组中等。不过由于T一DNA可以在植物染色体的任何区域内插入，就有可能导致有益基因的插入失活，因此，外源基因插入问题尚有待于基因转移技术的进一步完善[7]。

1.2 病毒介导法

病毒介导法是以病毒为媒介对植物进行遗传转化的载体系统。具体来说就是将外源基因插入到病毒基因组中，通过病毒对植物细胞的感染而将外源基因导入植物细胞的一种植物转基因方法，目前正在研究开发的植物病毒载体系统有三类: 单链RNA植物病毒载体系统、单链DNA植物病毒载体系统和双链DNA植物病毒载体系统。

1.2.1 单链RNA植物病毒载体系统

单链RNA植物病毒载体系统是以单链RNA为模板经反转录酶作用合成双链的cDNA，将其克隆到质粒或粘粒载体上，然后把外源基因插入到病毒的cDNA 部分，通过体外转录，使带有外源基因的病毒载体感染并进入植物寄主细胞. 1.2. 2 单链DNA植物病毒载体系统

单链DNA植物病毒，是由单链环状DNA分子组成，一般存在成对的两个病毒颗粒，因此又称为双粒病毒(gemini viruses)。其基因组比较小，分子大小约为2. 5一3.5 kb 。双粒病毒中成对的两个颗粒所包含的基因组可以不同，但只有当两种DNA混合时才具有感染性[8]。这种二连基因组(bipartite) 可以把外源基因插入其中一种DNA上而不影响另一种DNA基因组复制，然后通过这类病毒对植物细胞的感染而将外源基因导入其中，从而实现植物的遗传转化，这正是单链DNA 植物病毒载体系统转化植物的原理。

1.2.3 双链DNA植物病毒载体系统

双链DNA植物病毒载体系统，是将其病毒基因组中的一段对于病毒繁殖非必需的核昔酸序列去掉，插入外源DNA，这样在不影响病毒基因组正常包装的前提下用这种重组的病毒载体感染植物细胞从而实现外源基因的转移。

利用植物病毒介导法对植物基因进行遗传转化效率比较高，但它的安全性受到质疑，主要用于动物的基因转移[9]。

2 直接转化法

直接转化法(又称DNA直接导入法)，它指不依赖于生物体将裸露的DNA直接转移到植物细胞和原生质体中，导致细胞转化的技术，与间接转化法相比，直