β-内酰胺酶的检测方法

外源性β-内酰胺酶是我国不允许在食品中使用的化学物质。违法使用的目的，是为了掩盖违规使用大环内脂类等抗生素治疗奶牛疾病的行为。但是，内源性β-内酰胺酶的产生机理也是科学研究基本确认的事实。近几十年来，国际国内畜牧业养殖奶牛过程中无限制使用大环内脂类抗生素治疗动物、家禽等食用动物各种炎症、败血症、水肿病等病症，造成革兰氏阳性细菌对抗生素耐药，细菌对β-内酰胺类抗生素产生耐药性一般通过4种途径。（1）产生β-内酰胺酶使β-内酰胺类抗生素开环失活，这是产生耐药的主要原因。目前发现的β-内酰胺酶已超过300种，它通过与β-内酰胺环上的羰基共价结合，水解酰胺键从而使β-内酰胺类抗生素开环而失活。（2）改变抗生素与青霉素结合蛋白（penicillin binding proteins，PBPs）的亲和力。当β-内酰胺类抗生素与PBP结合后，PBP就会失去酶活性，使细菌细胞壁的形成部位破损而引起溶菌，反之，则成为耐药菌。PBP基因的变异，使β-内酰胺类抗生素无法与之结合或结合能力降低，这是形成耐药的根本原因。（3）细胞膜和细胞壁的结构发生改变，使药物难以进入细菌内。如生物膜的形成。（4）细菌体内的能力依赖性主动转运机制，将已进入细菌内的抗生素泵出体外，也可导致耐药性。由于细菌耐药产生的内源性β-内酰胺酶有300多种，同外源性β-内酰胺酶的分别鉴定检测技术尚未见报道。而目前各检测机构正在研究的乳制品中β-内酰胺酶的检测方法无论是化学仪器分析高效液相色谱法还是微生物法，其检测原理都是：测出的β-内酰胺酶无法判定是人为添加的或是耐药细菌产生的。奶制品中检出的β-内酰胺酶有可能是非法添加的，也有可能是细菌产生的。耐药性产生的机理很复杂，细菌耐药基因的转移、共生菌协同以及基因交叉耐受，等影响都要考虑。另外，根据现有的国际食源性抗生素耐药微生物的风险管理原则，建议加强畜牧业奶业生产全过程，而终产品的β-内酰胺酶检测始终是一个辅助手段，凭检测结果很难处理。化学家们要尽快建立内源性和外源性β-内酰胺酶的分离鉴定技术，当然这种技术要求是非常高的 1.常规方法(1).微生物法：[原理] 以一种对青霉素高度敏感的细菌-枯草芽孢杆菌作为指示剂，试验时如果被测细菌株产生青霉素酶，破坏了青霉素，则此高度敏感菌株即可生长，否则，指示剂则被抑制。[方法] 以枯草芽孢杆菌为指示菌，用棉拭子将枯草芽孢杆菌接种于琼脂培养基上，或倾注方法将枯草芽孢杆菌混于琼脂平板内。然后将被测菌与产青霉素酶阳性及阴性对照菌株，按下图接种划线，在琼脂培养基中央放置一含青霉素G（1单位）纸片。放置35℃培养24小时后观察结果。[结果判断] 如被检菌产生青霉素酶，则沿着被测菌处的枯草芽孢杆菌抑菌环出现凹痕(2).碘量法[3] [原理] β-内酰胺酶能裂解青霉素的β-内酰胺环形成青霉噻唑酸，它与淀粉竞争游离碘，破坏了碘和淀粉的兰色复合物，使兰色变为无色。[方法] ①将0.25克青霉素溶于41.7mlPH6.0的磷酸盐缓冲液中，使其浓度成6000ug/ml。取0.1ml

于一小试管中。②将培养18-24小时的细菌在含青霉素试管内制成浓厚菌悬液（109/ ml）。③在37℃水浴中放置30分钟，不时摇动，使酶能破坏青霉素。④加入1%可溶性淀粉溶液0.5 ml，摇匀。⑤加入碘液0.02 ml。⑥在37℃水浴中放置10分钟，观察结果。[结果] 在10分钟内能使兰色完全消退的菌株为β-内酰胺酶阳性，不消退者为阴性。[注意事项] ①由于青霉素很容易分解，因而用于实验的青霉素应新鲜配制。②淀粉也新鲜配制，在100 ml蒸馏水中加入1克可溶性淀粉，放到开水中水浴直到淀粉溶解。③实验应按照步骤操作，如果碘加得过早，酶反应就会停止，产生假阴性结果。④每次试验最好用阳性和阴性对照。（3）.纸片酸度定量法[3] [原理] β-内酰胺酶能破坏青霉素中的β-内酰胺环，形成青霉噻唑酸，使PH降低，指示剂溴甲酚紫颜色由紫变黄。[方法] ①将一小片Whatman滤纸放于空平皿中。②让滤纸吸足青霉素溶液（0.05M磷酸缓冲液，PH8.0+0.2%溴甲酚紫+5%无缓冲剂的结晶青霉素）。③用接种环把10-20个菌落涂到滤纸上，④盖好平皿后，将滤纸片在37℃孵育30分钟，观察结果。[结果] 产β-内酰胺酶的菌株使滤纸颜色由兰色变黄色，一般在10分钟内即能看到。（4）.产色头胞菌素法[4] [原理] 产色头胞菌素如头胞硝噻吩（nitrocefin）的β-内酰胺环能被β-内酰胺酶所破坏，使其颜色由浅黄色变为粉红色，以此来测定细菌的产酶情况。[方法] 将头胞硝噻吩（nitrocefin）纸片置于干净的平皿内，用无菌的牙签或接种环挑取细菌菌落涂于纸片上，观察纸片有无颜色变化。[结果] 纸片涂抹处如颜色由浅黄色变成粉红色，表示该菌产生β-内酰胺酶，如颜色不变，表示细菌不产生β-内酰胺酶。检测β-内酰胺酶方法中，生物学方法是古老的方法，由于特异性差、灵敏度低，现在基本上很少被采用，头胞硝噻吩（nitrocefin）主要检测淋病奈瑟氏菌、流感嗜血杆菌、莫拉氏菌（布拉汉氏菌）、葡萄球菌，结果可靠。纸片酸度定量法一般用于检测淋病奈瑟氏菌、流感嗜血杆菌和葡萄球菌。碘量法常用于检测淋病奈瑟氏菌，但莫拉氏菌（布拉汉氏菌）只能用头胞硝噻吩（nitrocefin）法。对于淋病奈瑟氏菌、流感嗜血杆菌、莫拉氏菌（布拉汉氏菌）快速测定β-内酰胺酶比做药敏试验能更快地得到临床需要的结果。β-内酰胺酶试验还可验证葡萄球菌对纸片法青霉素的敏感试验结果是否可信。肠杆菌科、假单胞菌科及其它需氧革兰氏阴性杆菌不必测定β-内酰胺酶，因其结果常常不能预测这类细菌对临床常用来治疗β-内酰胺类抗生素药物的敏感性[5]。