离子选择性电极对尿液中钙_镁_草酸_柠檬酸和尿酸的测定(1)

＊国家自然科学基金资助项目(编号:20471024)、广东省重点攻关项目(编号:2001C31401)及广州市重点科技项目(2001-Z -123-01);　■通讯作者
离子选择性电极对尿液中钙、镁、草酸、柠檬酸和尿酸的测定＊
吴秀梅　欧阳建明■
　综述　白　钰　审校
暨南大学生物矿化和结石病防治研究所(广州510630)
泌尿系结石(简称尿石)的形成与尿液中钙、镁、草酸、枸橼酸及尿酸的浓度密切相关。

尿中钙、草酸和尿酸浓度上升,镁和柠檬酸浓度下降,均会促进尿石形成。

采用离子选择电极测定这些离子的浓度,检测范围在10-1～10-7mol /L 之间,检测快速、灵敏、设备简单,并能做到无损分析、原位测量和连续自动分析。

1　钙电极对尿钙的测定
尿液中的钙有两种存在方式:络合钙(如蛋白结合钙、有机酸结合钙)和离子钙,离子钙才具有生理活性。

在尿液中,离子钙的浓度是形成结石的重要因素,总钙并不能完全反映体内钙的生理状况,故离子钙更具有临床意义。

离子钙的测定受众多因素的影响,包括尿液pH 值、抑制剂和抗凝剂的种类与浓度、采样方式与样本保存以及温度等。

与血液中钙的测定稍有区别,尿液中离子钙的测定受蛋白质的干扰很小,而离子强度的影响占主要地位,因此,应用钙离子选择电极测定尿钙的浓度时需要进行离子强度校正。

在正常成年人的尿液中,男性的24h 总钙是(180.60±72.00)mg ,女性(159.00±68.70)mg ,而男女尿液中的离子钙分别为(72.33±38.24)和(63.26±31.69)mg ,均接近总钙的40%。

pH 影响尿液中离子钙的百分比。

在高钙尿的结石患者当中,总钙和离子钙的浓度及排泄量均明显高于正常人。

给结石患者服用柠檬酸盐之后,离子钙的排泄量和在总钙中的百分比均明显下降;服用米糠之后尿液中的离子钙也明显降低。

应用于钙离子选择电极中的活性物质主要有3种类型:大环抗生素、冠醚化合物及非离子型表面活性剂。

以非离子型表面活性剂为离子载体的PVC 膜钙离子选择性电极已有商品出售。

2　镁电极对尿镁的测定
镁离子选择性电极是在钙离子选择性电极的基础上发展起来的,因此,镁电极一般对钙离子也有不同程度的响应。

由于尿液中钙离子的浓度大于镁离子的浓度,因此,测量尿液中镁离子的浓度都必须扣除钙离子
的干扰。

Gupta 等[1]制作了以中性载体苯-15-冠-5为离子载体的P VC 膜电极,膜的工作范围在1.0×10-5～1.0×10-1mol /L 之间,斜率是(31.0±1.0)mV ,响应时间15s ,使用寿命4个月,pH 范围2.2～9.8。

Zhang 等制备了以中性载体ETH 5504为活性物质的镁离子选择性电极,可在10mmol /L NaCl ,100mmol /L KCl 和1mmol /L CaCl 2的背景溶液测定镁而没有干扰。

用电极法测定尿液中的镁和钙离子时,电位值漂移常常较大,其原因主要是亲脂性物质的干扰,对尿样进行超滤后发现,这些干扰物质的分子量低于1000,主要为磷脂、卟啉类和胆酸类等化合物,因此,对尿样进行预处理,除去这些亲脂性物质,电位值的漂移可减少许多。

尿液中镁/钙或镁/(草酸×钙)的比值可能比单个的镁浓度对推断尿石复发和成石倾向更具有参考价值。

正常人尿液中镁/钙比为0.893,而结石患者的镁/钙比明显减小,为0.448。

3　草酸电极对尿草酸的测定
尽管对钙的浓度与尿石形成的关系目前还存在争论[2],然而对于草酸的作用,结论却相当一致,即高草酸尿促进尿石形成。

高草酸还可以引起肾小管的损伤,这正是尿石形成的主要病理基础。

所以准确测定尿液中草酸的浓度比测定钙的浓度更为重要。

酶电极法测定尿液中草酸浓度由来已久,最近几年酶电极的改进主要集中在酶固定物的选择,以提高酶催化的效率。

Reddy 等[5]制作了一种草酸氧化酶电极,可以测定人尿中的草酸盐。

电极上的醋酸纤维素膜可以消除尿液中的干扰物质,对尿样进行稀释和酸化可以提高酶的活性并在低草酸浓度下优化电极的响应特性。

该电极在稀释尿样的草酸盐浓度2～200μmol /L (相当于未稀释尿样8～800μmol /L )范围内呈线性关系。

近年来以季铵盐为活性物质的PVC 膜电极、以邻菲
啉与过渡金属的络合物为活性物质的液膜电极和化学改良电极发展很快,大都适用于尿液中草酸的测定。

Ishikawa 等制作了以长链烷基季铵盐为活性物质
的草酸离子选择性电极,该电极的线性范围是10-4.
5
～10-1.5
mol /L ,电极斜率是-35～-42mV ,响应时间
小于60s 。

但是季铵盐电极的缺点是选择性不好,对
·
714·Guangdong M edical Journal M a y .2005,Vol .26,No .5
DOI :10.13820/j .cn ki .gd yx .2005.05.083
尿液体系来说,不对尿样进行预处理无法消除干扰物质的影响。

Stefan等[3]制作了邻菲啉合铁(Ⅱ)离子和(2,2′-联喹啉)合铁(Ⅱ)离子为活性物质的草酸盐选择性膜电极,其响应浓度范围分别为100～0.01μmol/L和100～0.1μmol/L,检测限均为1nmol/L,pH范围分别是2.0～8.0和2.0～7.0,重现性良好,相对标准偏差小于1%,适合用作尿液中草酸盐浓度的测定。

以前的分析方法中需要对尿样进行预处理,即离心尿样来分离草酸盐,这样就带来了结果的不准确,使用该电极免除了上述过程,提高了结果的准确性。

另外直接利用生物组织作为活性物质的电极最近也有报道,如Mustafa等[4]将菠菜组织匀浆固化在一个高敏感性的溶氧探针聚四氟乙烯膜中,制作了一个新型的可测定尿液中草酸盐的离子选择性电极。

4　柠檬酸电极对尿柠檬酸的测定
尿液中柠檬酸的作用,主要是与钙离子等络合,降低尿钙饱和度,抑制钙盐结晶。

测定柠檬酸的含量,通常使用比色法,但比色法要求的条件荷刻、步骤多、费时。

而柠檬酸酶电极法线性范围较宽,反应也比较灵敏。

将柠檬酸裂解酶和草酸乙酸脱羧酶固定到CO
2
气敏电极上可以制备柠檬酸酶电极。

郭宗文等在单一酶电极的理论模型基础上,提出了复合酶电极的理论模型,与实验得出的回归方程基本吻合。

Dorsett等制作了以硫化银和柠檬酸银混合物为活性物质的柠檬酸盐选择性电极,可以选择性响应柠檬酸根离子,而对与柠檬酸类似的阴离子如醋酸根离子、乳酸根离子、酒石酸根离子等响应较小;当草酸根离子、琥珀酸根离子的浓度低于柠檬酸盐浓度时,亦不对柠檬酸的测定产生干扰。

为了简单、精确地测定混合物中柠檬酸盐,Cr istina 等[5]制作了具有管状结构的季铵盐离子交换聚合物膜的柠檬酸离子电极,并制作了加入不同极性溶剂为介质的柠檬酸选择性膜电极,三辛基苯的加入可以提高其选择性。

以三辛基苯为添加剂、二(2-乙烷己基)癸二酸酯为溶剂介质的选择性电极,其斜率达到61.9 mV,重现性±0.8%,但用此电极测定尿液中柠檬酸浓度时,必须消除尿中大分子和部分有机酸的干扰。

5　尿酸电极及尿液中尿酸的测定
近年来,随着生活水平的提高,珠三角地区的尿酸结石发病率呈明显上升趋势[6]。

与草酸钙结石相比,由于没有在尿液中发现抑制尿酸结石形成的有效的抑制因子,所以尿酸结石的防治难度更大。

测定尿液中尿酸的含量,可辅助诊断尿酸结石的发病情况。

测定尿酸的方法很多,常用的方法有磷钨酸还原法,酶法和高压液相色谱法。

前一种方法特异性差,测量误差大,后两种方法灵敏度高,但所需试剂和仪器价格昂贵,难以普及。

而尿酸酶电极克服了上述缺点。

Zhang等制作了基于固定尿酸酶的尿酸盐传感器,可以直接测定尿液中的尿酸,回收率在92.5%～97.9%,在100次测量中,标准尿酸盐溶液和尿液的相对标准偏差分别是2.37%和2.95%,且使用寿命超过2年,可以重复测定尿样1000次。

Miland等制备了基于固定尿酸酶和山葵过氧化酶的尿酸选择性传感器,线性响应范围为1.0×10-4mol/L,检测限是3.0×10-6mol/L,响应时间是37s,校正精度是2.2%,与分光光度法相比,效果良好。

Zen等制作了电化学阳极陶瓷修饰电极,用于测定高浓度维生素C(Vit C)存在下尿酸或者多巴胺的浓度,该电极可以克服由Vit C的氧化电位与尿酸的氧化电位重叠造成的干扰,在pH1.0的0.1mol/L柠檬酸盐缓冲液中,可得到0.5～10和10～100μmol/L的线性校正曲线,检测限是0.2μmol/L,该电极在测定人尿液中的尿酸时,可以不对尿样进行预处理。

Elena等[7]使用电化学阳极钻石膜电极测定了高浓度Vit C存在下尿酸的浓度,最低值可以测到5×10-8mol/L,小于20倍的Vit C不会干扰测定,并可直接用于尿液中尿酸的测定。

Wang等[8]制作了一种新型的通过电化学氧化法沉积在玻碳电极表面上的聚胺基吡啶修饰电极来测定尿酸,其使用寿命大于2年,可以测定1000倍的Vit C存在下的尿酸浓度,线性范围(5.0×10-9～8.0×10-6)mol/L,检测限1.0×10-9mol/L,使用此电极测定人尿液中的尿酸,可以不对尿样进行预处理。

6　展望
对于尿液中钙、镁离子浓度的电极法检测,冠醚类化合物及其衍生物具有较大的应用前景,特别是双冠醚和聚冠醚。

对于尿草酸、柠檬酸和尿酸的酶电极法测定,环糊精类化合物有可能成为好的载体。

一些含氮穴状配体环上的N原子质子化后,亦可成为阴离子受体。

上述这些化合物的亲脂烷基均分布在环的外侧,能溶解于合适的有机溶剂中,因此可用其作为离子载体研制成液膜离子交换体,制备出离子选择性电极。

同时,它们的空腔大小、构象及取代基均可以修饰,得到不同腔径的主体分子。

腔径不同,它们便可以选择不同的金属离子或阴离子结合。

参考文献
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(收稿日期:2004-09-29　编辑:庄晓文)
噬血细胞综合征4例临床病理分析
黄小让　王卓才　冯晓东　陈炳旭　赖日权　陈敬文　张　伟广州军区广州总医院普通内科(广州510010)
噬血细胞综合征(hemophagocytic s yndrome,HS)是由于多种病因引起的组织细胞增生活跃并吞噬各种血细胞,造成外周血细胞减少的一组临床症候。

HS掩盖原发病时,极易漏诊误诊。

本文报告4例HS,旨在提高广大医务工作者的认识。

1　临床资料
1.1　一般资料　1998～2003年间我院收治4例HS,其中男3例,女1例;年龄3～65岁,平均36岁;病程2～31周,平均16周。

均符合文献[1]诊断标准。

1.2　症状体征　4例均有持续发热,体温38.5～40.1℃,稽留热2例,弛张热1例,不规则热1例,畏寒、咳嗽2例,咯黏白痰、痰中带血1例。

2例皮肤出血形成瘀点、瘀斑;1例上消化道出血;2例有肝脾肿大,3例浅表淋巴结肿大(1.0～3.0)c m×
2.5cm×1.5cm,质稍硬,与皮下组织有粘连。

1.3　实验室检查　①血常规:三系减少2例,二系减少2例并随病情进展减低;正红细胞正色素性贫血4例;白细胞减低(中性粒细胞)3例,但1例马尔尼菲青霉感染患者不降反升,15.4～29.0×109/L;血小板减低3例;单核细胞增多3例高达21%。

②2例尿蛋白(+～++),尿红细胞3～7/HP。

③骨髓常规:4例中2例行骨髓涂片示增生活跃并见大量吞噬血细胞及血细胞成分的组织细胞,其中1例培养见马尔尼菲青霉菌生长。

④肝功能:谷丙转氨酶升高3例85～120U/L;谷草转氨酶升高2例85～160U/L;胆汁酸升高24～37μmol/L;白蛋白减低4例;⑤脂代谢: 4例都有甘油三酯升高;⑥乳酸脱氢酶有不同程度升高992～1796U/L;⑦肌酸激酶升高1例232U/L;⑧凝血功能:纤维蛋白原降低呈低凝血状态2例。

1.4　辅助检查　2例X线胸片呈间质性肺炎,2例CT扫描、MRI和B超检查示肝脾肿大,其中1例脾脏内多个低密度影及腹膜后淋巴结融合,考虑为淋巴瘤。

1例头颅CT和X线检查示枕下项部软组织影,颅骨破坏。

1.5　病理学检查　脾脏和脾门淋巴结
活检1例,镜下见大量幼稚毛细血管增
生及散在或灶性圆形1～2μm小孢子,
术后组织化学染色和血、骨髓培养诊断
为播散性马尔尼菲青霉病;余3例分别
行枕下、颈部、腹股沟肿大结节活检,镜
下见异性细胞呈弥漫排列,并有散在或
灶性吞噬细胞核碎片和中性粒细胞的
组织细胞,免疫标记2例为T细胞,1例
为B细胞非霍奇金淋巴瘤。

1.6　治疗与结果　4例中,1例播散性
马尔菲青霉病经月余抗真菌治疗,多次
血、骨髓培养阴性,患儿临床症状消失,
脾活检脾窦内仍见大量真菌孢子,继续
抗真菌治疗1个月,脾活检和血、骨髓
培养均阴性,患者目前健康状况良好;3
例淋巴瘤中,1例T细胞淋巴瘤病理诊
断第2天出现多系统功能紊乱,呼吸循
环衰竭死亡;另2例分别用C OP(环磷
酰胺,长春新碱和泼尼松)和C HOP(环
磷酰胺,长春地辛,吡喃阿霉素和阿塞
松)行2个和5个疗程化疗后,出现多
系统功能紊乱分别于3个月和6个月
死亡。

2　讨论
噬血细胞综合征通常表现发热、三
系或二系减少、体重减轻,网状内皮系
统增生,根据病因不同分为三类[1]:①
家族性HS,属常染色体隐性遗传,少
见,70%发生于1岁以内婴幼儿,家族
史常不明显。

病变主要累及网状内皮
系统,且病情较凶险,进展快。

临床症
状为不规则弛张热,体重减轻,肝脾肿
大和贫血;实验室检查可有血三系进行
性降低,凝血功能和肝功能异常。

治疗
目前尚未有效方法。

②感染相关性
HS,本征临床表现和实验室检查基本上
与家族性H S相似,肝功能异常较凝血
机制异常轻,可有全身感染中毒症状。

本病病原体有病毒、细菌、霉菌、寄生虫
等,治疗上依不同病原体使用有针对的
药物,预后一般较好[2],其中1例马尔
尼菲青霉病相样HS给予抗真菌治疗后
症状消失,随访至目前无复发。

③肿瘤
相关性HS,可能是肿瘤产生一些活化
因子,致组织细胞增生并吞噬细胞引发
的一组临床征候群。

本组中播散性马尔尼菲青霉病相
关性HS1例,病情发展快,恶病质较明
显,全身皮肤瘀斑,浅表淋巴肿大,本院
血骨髓培养第一次报告为丛孢子菌生
长,初次脾脏病理活检见明显增生毛细
血管,血管内皮肿胀并有单核上皮轻度
异型细胞,曾误诊为血管肉瘤,后经组
织化学染色并结合临床追询病史,患儿
曾随父母到东南亚疫源地旅游,且HS
与马尔尼菲青霉菌临床表现相重叠,易
于误诊漏诊,最后修正报告为播散性马
尔尼菲青霉病相关性HS。

与文献报道
不同的是患儿白细胞不降反升,可能是
该综合征特殊之处。

本例经月余抗真
菌治疗,临床症状消失,血、骨髓培养阴
性,脾脏活检脾窦内仍见真菌孢子,继
续抗真菌治疗月余和加强支持治疗,肝
脾大小恢复正常;提示足量持续抗真菌
治疗是极其重要的,血、骨髓培养阴性
不能作为停药的依据。

本组HS中另3例为恶性淋巴瘤,1
例病理诊断后第2天病终因多脏器衰
竭死亡;另外2例虽然采取了积极化疗
措施,但患者还是3～6个月后死亡。

这可能是淋巴瘤,特别是T细胞性淋巴
瘤,分泌多种细胞因子激活组织细胞,
加速病情发展,促使患者衰竭,预后更
差。

有报道病毒相关性HS可引起肾功
能改变,本组中马尔尼菲青霉病相关性
HS和1例T细胞性淋巴溜病相关性HS
病程中尿沉渣异常,可见此例患者也累
及肾脏。

参考文献
1　吴梓梁.噬血细胞综合片.中国小儿血
液,2000,5(5):219
2　Marom D,Offer I,Tamary H,et al.
Hemop hagoc ytic lymph oh istiocytos is associated
with visceral leish manias is.Ped iatr Hematol
On col,2001,18(1):65
(收稿日期:2004-11-04　编辑:庄晓文)
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·Guangdong M edical Journal　M a y.2005,Vol.26,No.5。