病毒学检验 第二章 鸡胚和动物接种技术

卵黄囊
主要营养的储藏场所，为胚胎提供营养
卵白
外于卵的锐端，为胚胎发育晚期提供营养
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病毒学检验
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病毒学检验
二、 鸡胚的孵育和检查
一、受精鸡卵的选择
没有受到病毒和细菌的污染如新城鸡瘟病毒、布氏杆菌 等；
培养立克次体和衣原体，不能来自食用抗生素的鸡群。
二、鸡胚的孵育
孵育的温度 38℃～39℃
按遗传学控制分类
近交系、封闭群、突变系、杂交群、转基因动物
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按微生物学控制分类
病毒学检验
1、普通动物
一级动物，指不携带主要人兽共患病病原和动 物烈性传染病病原的动物。
实验结果不稳定； 仅供教学示范及
作为预备试验。
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病毒学检验
2、清洁动物
二级动物，除不携带普通动物病原体外，要求 不携带对动物危害大 、对实验干扰大的病 原体。
鸡胚 来源客观，易于管理，带病 敏感病毒谱窄 培养 毒机会少；多途径接种
细胞 应用广泛，敏感病毒谱广 培养
设备技术要求条件高
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病毒学检验
第一节 鸡胚接种技术
概况
1911年Rous和Murphy首先应用 鸡胚培养研究肉瘤病毒(Rous肉瘤 )的繁殖。
1938年Goodpasture和Burnet等应 用鸡胚繁殖病毒、Cox应用卵黄 囊培养立克次氏体。
细菌与疾病的关系 细菌致弱用免疫
狂犬病免疫 虫媒传播疾病 蚊传播疟疾
年份
1628 1846
1878 1880 1885 1898 1898
发现人
哈维 玛登
科赫 巴斯德 巴斯德 史密斯等 罗斯
所用动物
蛙、蛇、鱼、蟹、其他 鸟类、其他
牛、羊、其他 鸟类
鸟类、家兔 牛 鸟类
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病毒学检验
医学科学的重大发现与动物实验的关系
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病毒学检验
收获尿囊液—每枚鸡胚收获尿囊液6～8ml
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4. 卵黄囊接种
病毒学检验
用于虫媒病毒、衣原体及立克次体等的分离和繁 殖。
卵黄囊接种示意图
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四、病毒的检测
病毒学检验
（一）无菌试验
目的：证实鸡胚收获物是否受到细菌的污染。 方法：
将鸡胚组织或收获的第一滴液体接种无菌肉汤； 37℃培养36h。
注意勿钻破壳膜。 再次消毒钻孔区后，用灭菌的小镊子除去长方形卵壳和外层壳膜，并滴
加灭菌液体石蜡一滴于下层壳膜上，使其透明，以便观察胚胎的位置。 将注射器刺向胚胎的腭下胸前，以针头拨动下颚及腿，当进入羊膜腔内
时，可看到鸡胚随针头的拨动而动，此时可注入O.1～0.2ml病毒液。 拔出针头，孔区消毒后用沾有碘酒通过火焰的小块胶布将卵壳的窗口封
用1mL注射器抽取接种物； 针头垂直刺入注射部位1-1.2cm即达尿囊腔内； 注入待接种的病毒液：接种量为0.1~0.2mL。
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5. 封孔
用熔好的石蜡或消毒胶布封闭注射孔。
病毒学检验
6. 孵育与观察
气室朝上于37℃温箱中孵育； 以后每天检卵1~2次。 弃去24h内的死亡鸡胚：
✓ 机械损伤、细菌或霉菌污染等引起。
住，于33～35℃孵育48～72h，要保持鸡胚钝端朝上。
解剖与收获
病毒学检验
收获前鸡胚须置4℃冰箱6h或过夜，但不能放置时间过长( 过长会引起散黄)。如急于收获亦可置-20℃冰箱lh左右。
预冷的目的是，将鸡胚冻死，使血液凝固，避免收获时流 出红细胞，并同尿囊液的病毒发生凝集，造成病毒滴度下 降。
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接种步骤与方法
定位
将胎盘部分及自然气室 部分用铅笔画出；
在与胚胎略近气室端的 绒毛尿囊膜发育较好的 卵壳上划一直径约1cm 的等边三角形
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卵窗
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取卵壳； 造人工气室； 接种； 消毒； 培养。
病毒学检验
绒毛尿囊膜接种示意图
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解剖与收获
病毒学检验
用2.5％的碘酒和75％的酒精分别消毒人工气室上的卵壳 ，去除窗孔上的胶布。
人工喂乳或保姆代养培育而成。
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病毒学检验
悉生动物饲养条件：无菌隔离器。 来源：人为将已知的微生物投给无菌动物，使其体内 带有已知菌，可分为单菌动物、双菌动物和多菌动物。 53
按遗传学控制分类
病毒学检验
1、近交系(inbred strain)
概念：又叫纯系，经过连续20代以上全同胞或 亲子交配培育的动物品系。
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病毒学检验
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病毒学检验
三、鸡胚的接种途径及方法
一、实验材料与器械
受精鸡卵 孵卵箱 检卵灯、照明灯、卵杯、卵盘、鸡胚开孔器 其它器材
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二、接种途径与方法
病毒学检验
羊膜腔接种：主要用于临床材料（如患者咽漱液等
）分离流感病毒。
绒毛尿囊膜接种：常用于牛痘病毒、天花病毒、单
纯疱疹病毒的分离；病毒滴定、中和试验。
病毒通过胚胎机体后被排泄入尿囊腔，因此当羊水过少时 ，可用同胚少量尿囊液冲洗羊膜腔并吸取该洗液。
2、绒毛尿囊膜接种
病毒学检验
牛痘病毒、天花病毒、单纯疱疹病毒的分离，可 在膜上可形成斑点状或痘疱状病灶。
病毒滴定，感染性病毒颗粒的数目可以通过产生 的斑和痘的数目来计算。
抗体滴定，即在有抗体存在的情况下，痘疱形成 受到抑制。
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病毒学检验
登革病毒对新生乳鼠的致病作用
1-3日龄乳鼠接种病毒6日后，小鼠陆续 出现体弱、弓背、行动迟缓等症状。
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病毒学检验
一、实验动物的种类和基本操作方法
（一）实验动物的种类
按微生物控制分类
普通动物（CV）、清洁动物（CL） 、无特定病原 体动物（SPF） 、无菌动物（GF）和悉生动物（ GN）
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常用封闭群的啮齿类的实验动物
昆明（KM）小鼠、NIH小鼠、LACA小鼠、 ICR小鼠、Wistar大鼠、SD大鼠、Hartley豚鼠、 大耳白兔和青紫蓝兔等。
C57BL/6
B6
STS
S
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C57BL C3H/He系
病毒学检验
BALB/c系
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病毒学检验
2、封闭群(closed colony)
概念：也称远交群，在不从其外部引入新个体 的条件下，以非近亲交配方式至少连续繁殖4 代以上生产的一个实验动物种群。
特点
群体遗传特异性相对稳定； 个体间具有杂合性，存在一定差异。
尿囊腔接种：广泛应用于流感病毒、流行性腮腺炎
病毒、新城鸡瘟病毒的适应和传代。
卵黄囊接种：主要用于虫媒病毒、衣原体、立克次
体等分离和繁殖；抗流感病毒药物实验。
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1、羊膜腔接种
分离流感病毒，收获羊水和尿囊液。
病毒学检验
羊膜腔接种示意图
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接种步骤与方法
病毒学检验
将10~12日龄的鸡胚在检卵灯上照视，标记气室及胚胎的位置。 消毒气室部位的蛋壳，在气室顶端钻出一约10mm×6mm的长方形裂痕，
结果判定
肉汤清亮透明，说明没有污染； 肉汤混浊，或有菌落出现，说明鸡胚被细菌污染。
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（二）检测方法
病毒学检验
直接观察法
绒毛尿囊膜上形成损害或痘疱：如痘类病毒和疱疹病毒。 引起鸡胚死亡：如新城疫病毒、流行性乙型脑炎病毒。 造成鸡胚特殊损害和胚胎生长迟缓，如马流感病毒。
实验检测法
血凝和血凝抑制试验：流感病毒 补体结合试验：腮腺炎病毒 其他：PCR等
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解剖与收获
病毒学检验
① 收集24h后死亡鸡胚，置4℃冰箱过夜，以免收获时流血;
② 取出冷却的鸡胚，消毒气室端卵壳表面；
③ 用镊子击破气室部卵壳并去除壳膜，撕破绒毛尿囊膜； ④ 以眼科镊镊住绒毛尿囊膜，用吸管吸取尿囊
液，置无菌容器中保存备用。一般能尿囊液 6-10mL。 ⑤ 取出鸡胚胎，于平皿内观察胚胎有无病理变 化，如出血、蜷缩、侏儒胚等。
特点
基因型相同，表现型一致； 对外来刺激反应一致； 实验结果重复性好，可比性强。
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病毒学检验
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常用近交系小鼠名称缩写
病毒学检验
品系名 缩 写
品系名
缩写
AKR
AK C57BL/10 B10
BALB/c
C
C57BR
BR
CBA
CB
DBA/1
D1
C3H
C3
DBA/2
D2
C57L
L
HRS/J
HR
熟悉
鸡胚孵育与检查、鸡胚接种所需实验材料与器械 实验动物编号和分组、接种后的观察等问题
了解
鸡胚的解剖与生理； 鸡胚和实验动物接种技术在病毒检验中的应用
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病毒分离培养常用方法
病毒学检验
方法
应用价值
存在问题
应用最早； 动物 方法简便； 接种 结果易于观察
自身带病毒； 有的接种后不敏感； 动物饲养问题
孵育的湿度
40％～70％
翻卵
每天180°转动鸡胚1～2次
通风
排出CO2，吸入O2
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病毒学检验
鸡卵
卵白 卵黄 系带 胚盘 发育中的胚胎
发育中的胚胎
破壳而出的小鸡
病毒学检验
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三、检卵
病毒学检验
目的
了解鸡胚的存活情况，标记气室边界和胚胎位置； 观察接种后胚胎的状况
观察内容
血管是否明显 有无胎动 绒毛尿囊膜发育之界线
的繁殖受到抑制； 某些细菌和病毒能够从感染的鸡传递到鸡胚。
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病毒学检验
一、 鸡胚的结构与生理
鸡胚是由外胚层 、中胚层和内胚 层三个胚层发育 起来的，它们共 同构成了胚胎的 组织与器官。
气室
尿囊腔 卵黄
卵白
卵壳
壳膜
绒毛尿囊膜 羊膜 鸡胚胎
羊膜腔
9～11日龄鸡胚结构
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病毒学检验
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病毒学检验
卵壳与壳膜
发现 肿瘤的病毒病原
胰岛素 休克治疗 抗细菌药物（百浪多息） 心肺旁道器 小儿麻痹症疫苗 变性脑病的病毒病原 心脏移植
年份 1910 1921 1927 1935 1953 1954 1965 1967
发现人 洛斯 班定 博莱罗克 多麦克 葛明 索尔克 格但斯克 伯纳德
所用动物 鸡 狗 狗
小鼠 猫
恒河猴 猩猩 狗
适用于大多数教学和 科研实验。
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病毒学检验
3、无特定病原体动物(SPF)
三级动物，除普通动物、清洁动物不得携带的 病原体外，还要求排除潜在感染或条件致病的 病原体。
目前国际公认的标准级别的实验动物。
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病毒学检验
饲养管理：SPF动物必须饲养在温湿度衡定的空气净化 的屏障系统中，实行严格的微生物控制。
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病毒学检验
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病毒学检验
第二节 动物接种技术
病毒学检验
实验动物（experimental animals）是指经
人工饲养，遗传背景明确、来源清楚，控制其携 带的微生物，用于科学研究、教学、生产、鉴定 以及其它科学实验的所有动物。
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病毒学检验
医学科学的重大发现与动物实验的关系
发现
血液循环 醚麻醉
用剪刀沿人工气室边缘将膜剪下，放入加有灭菌生理盐水 的培养皿内，观察病灶形状或用于传代，或用50％甘油保 存。同时作无菌培养。
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3. 尿囊腔接种
病毒学检验
流感病毒、流行性腮腺炎病毒和新城疫病毒的传 代。
尿囊腔接种示意图
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接种步骤源自文库方法
病毒学检验
1. 照胚：
取9~11日龄发育良好的鸡胚，观察气室及胚胎位置， 标出气室底边，在无大血管处标出尿囊腔注射部位。
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病毒学检验
标记气室和胚胎位置 30
2. 消毒
病毒学检验
气室向上放置鸡胚于卵架上； 先后用碘酊和酒精棉球消毒蛋壳所标记的位置。
距气室底边0.5cm
3. 打孔
在所标记注射部位用剪刀尖端打孔； 注意用力要稳，恰好使蛋壳打通而不伤及壳膜。
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病毒学检验
接种部位消毒
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4. 注入病毒材料
病毒学检验
卵壳位于最外层的坚硬壳层 壳膜位于卵壳的下层，允许气体和液体分子交换
气室
功能主要是呼吸和调节压力
绒毛尿囊膜
壳膜之下，主要是胚胎的呼吸器官
羊膜
胚胎的最内层包被，含羊水，胚胎在其中。
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尿囊腔
位于绒毛尿囊腔和羊膜之间 ，胚胎排泄器官；含5－ 20ml尿囊液，含大量的尿酸盐
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4、无菌动物和悉生动物
四级动物。 无菌动物要求现有的检测技术在动物体内外的任
何部位均检不出任何微生物和寄生虫。 悉生动物又称已知菌动物 ，是指在无菌动物体
内植入已知微生物的动物，必须饲养于隔离系统 。
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病毒学检验
无菌动物饲养条件：无菌隔离器。
第一代通过无菌手术剖腹取胎,饲养在无菌隔离器内，
病毒学检验
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鸡胚接种技术的优点
病毒学检验
鸡胚为一整体，有神经血管的分布及脏器的构造； 鸡胚的组织分化程度低，可选择适当途径接种，病
毒易复制，感染病毒的膜和液体含大量病毒； 来源充足，操作简单，通常是无菌的，对接种的病
毒不产生抗体。
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鸡胚接种技术的缺点
病毒学检验
通常不产生特异性的感染指征； 食入的抗生素会传递给鸡胚，使病原体在鸡胚中
病毒学检验
第二章 鸡胚和动物接种技术
Chapter2 Inoculation technology of embryo and animal
本章内容
病毒学检验
第一节 鸡胚接种技术 第二节 动物接种技术 第三节 鸡胚和动物接种技术在
病毒检验中的应 用
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教学要求
病毒学检验
掌握
鸡胚接种途径及方法、病毒的检测 实验动物的种类、实验动物接种途径和接种方法