高产谷氨酸菌选育研究进展 精品

Ξ

高产谷氨酸菌选育研究进展

甄卫军, 张石峰, 曾宪贤

( 新疆大学离子束生物工程中心, 新疆乌鲁木齐830008)

摘要: 对目前谷氨酸菌种选育技术及其发展进行了综述, 同时重点报道了离子束生物工程技术应用于谷氨酸菌株选育方面的研究1 研究表明, 以D 110、D 110B 为出发菌, 采用低能N + 离子注入技术已经筛选到两株高产菌株

D 5221、B 3263 , 其10 批次摇瓶平均产酸幅度分别达到8. 4% 、7. 5% , 比出发菌分别提高35. 48% 和25% , 摇瓶发酵

平均糖酸转化率可以达到43% , R G% (残糖) 达到2% 以下, 说明其代谢活力强于出发菌1

关键词: 谷氨酸菌; 选育; 发酵; 离子束生物工程

中图分类号: O 53; Q 93 文献标识码: A 文章编号: 100022839 (2002) 022*******

前言

味精的工业化生产工艺路线是以谷氨酸生产菌株发酵法生产谷氨酸, 原料为淀粉和糖蜜1 谷氨酸生产菌株具有较大的自然变异能力, 通常负变异频率高于正变异频率, 结果往往造成菌种的衰老, 菌株活力减退1 因此国内味精行业普遍存在着产酸率水平低, 糖酸转化率低, 成本高, 能耗高等瓶颈问题1 因此优良生产菌种的选育, 则一直是味精发酵工业上的主要研究课题之一 1 1

传统选育技术

1

20 世纪60 年代中期至70 年代初, 国内主要是从自然界中筛选出一批谷氨酸高产菌株, 比如A s1. 299、A s1. 542、T 6213 等, 以供生产使用170 年代开始, 一些院校、科研院所和生产厂家联合或单独开展遗传育种工作, 将野生株谷氨酸生产菌进行有目的的定向改造, 或者采用物理诱变因子紫外线(U V )、Co 60和铜激光等, 或者采用化学诱变因子硫酸二乙酯(D E S)、亚硝基胍、氯化锂、香豆素等以及这些理化因子的复合诱变, 用来处理菌株进行常规的诱变育种1

目前, 国内各味精厂使用的谷氨酸生产菌株主要有 2 : 北京棒杆菌(A s1. 299)、7338、S2941、D 110、W T H21; 钝齿棒杆菌(A s1. 542 )、HU 7251、B 9、B 9217236、F 2263; 天津短杆菌( T6213 )、FM 82027、FM 842415、U 29、

C M TC 6282、T G3、T G866、

D 85 等1 其中以淀粉为原料的厂家所使用的菌株多为B9、T 6213、7338.

20 世纪80 年代初, 郑善良等3 以T 6213 为出发菌株, 用Co 60 辐射诱变处理, 筛选得产酸能力有明显提高的FM 820 菌株, 该菌株适应于中糖发酵1 与此同时, 张克旭等 4 以A s1. 299 为亲株, 突破了产酸率10% 的大关, 但是, 必须采用吐温强制控制发酵1 由于糖蜜原料发酵的厂家少, 仅限于新疆及内蒙、东北的有

关厂家, 因此推广受到限制190 年代中期, 毛富根等5

采用激光对出发菌株T 6213 进行辐射诱变, 选育出一株L s168 菌株, 其遗传性比较稳定1

最近几年, 王岁楼等6以T 6213 为出发菌株, 经Co 2Χ线、U V 和D E S复合诱变, 并且经过高温驯化, 获得突变菌株T Z2310, 具有耐高温, 不分解谷氨酸的特点, 在以淀粉原料发酵工艺中有良好的稳定性1 云逢霖等7 以T 6213 为出发菌, 经U V 线、N T G 等用原生质体等诱变方法, 选育出S9114 菌株, 具有耐高糖, 耐高谷氨酸, 不利用谷氨酸和产酸高的特性, 摇瓶产酸最高达9. 69% 1

邱玉棠等8利用U V 线、氯化锂、香豆素等多因子复合诱变和高温驯化, 选育出琥珀酸、生物素营养

Ξ 收稿日期: 2001201209

基金项目: 新疆维吾尔自治区自然科学基金项目(项目编号: 20001)

乌鲁木齐市重大科技攻关项目(项目编号: Y 0010)

作者简介: 甄卫军(19692) , 男, 讲师, 现为中国科学院在读硕士研究生1

210 新疆大学学报(自然科学版)2002 年

双缺陷型的耐高糖、耐高谷氨酸且温度适应范围大(32℃- 48℃) 的突变菌株G M H - 9081 由于国内味精行业多采用T 6213 为谷氨酸生产菌种, 经过连续多年的使用, 噬菌体的危害相当严重1 国内谷氨酸基因资源相当贫乏, 在工业生产中, 可选择的菌株少, 选育抗噬菌体的菌株很有意义9 .

杨汝德10利用传统选育技术经过反复多次筛选, 得到抗噬菌体菌株U 29 , 可以抗B 721 和B271 两种噬菌体1 阮法华等11采用细胞融合技术选育得到抗噬菌体的非容源性菌株Z G88 , 可以抗T 6213 噬菌体1 单志萍12通过自发突变, 获得一株产酸较高的突变株9217, 可以抗T 6- 13 噬菌体1

基因工程技术选育谷氨酸菌株的研究

20 世纪70 年代后, 基因工程技术迅速发展, 在微生物育种方面得以应用1 日本科学工作者首先用2

基因工程方法, 将所需的某一供体微生物的遗传物质DN A提取出来, 在离体条件下切割后, 把它和供做载体的DN A分子连接起来, 从而使基因得以转移出来1 通过此法, 已经培育出一株高产菌株9 1 国内在该领域仍处于起步阶段, 主要是采用细胞融合技术进行选育1 张克旭等13 以T G866 和B9 的原生质体进行种间融合, 获得了兼有两亲株遗传形状的细胞个体大, 产酸高的融合子F 263 和F 288 , 经过摇瓶发酵, 发现融合子稳定, 有一定的使用价值1 国内吴其威14 利用克隆技术对天津短杆菌T 6213 的八种氨基酸基因进行了酶切定位研究, 为构造高产菌种打下了基础1

张蓓等15以T 6213 为亲株, 利用物化复合诱变因子, 获得具有目的遗传标记寡酶素抗性和氟乙酸抗性的两株突变株, 再以细胞融合技术选育出新的融合子, 通过摇瓶传代, 发现性状稳定1 尽管近年来人们已迫切地研究利用原生质体融合及D N A重组等一系列的分子育种方法来选育GA 高产菌, 由于发酵工业生产规模大, 反复扩大培养很容易引起质粒失活甚至丢失, 造成基因表达困难, 因此采用基因克隆技术进行育种难度大 6 1

离子束生物工程技术选育谷氨酸菌株的研究

1986 年中科院等离子体物理研究所余增亮研究员首创性地将离子束注入技术应用于农作物改良并获得成功, 同时发现了离子注入对生物的诱变效应, 证实了质量(离子) 生物效应的存在16 , 开辟了低能离子与生物体相互作用的方向, 建立了质量、能量、电荷三因子作用的机制体系, 填补了重离子生物学的3

空白171 离子束应用于生物技术, 是国际公认的拥有自主知识产权的研究成果18 1 现有的生产菌株对以往常用的物理和化学方法表现出不同的抗性, 离子束注入作为新的诱变源表现出损伤轻、突变谱宽、突变率高和突变容易控制等特点19 , 离子束注入技术作为新型的诱变源在改良微生物方面取得了丰硕的成果20 222 .

D 110 菌是以甜菜糖蜜为原料的谷氨酸产生菌1 新疆是我国的重要甜菜糖料基地, 因此糖蜜资源非常丰富, 但是由于各个糖厂甜菜糖蜜成分的不均一性, 加之D 110 菌经过近20 年的连续使用, 已经出现了较大的衰退, 使得生产不稳定1 因此利用人工诱变来选育高产的谷氨酸生产菌是生产厂家急需解决的问题1 优良的菌株应具有耐高糖、耐高谷氨酸、糖蜜适应性稳定、倍增时间短, 同时不分解利用谷氨酸和细胞渗透性好等特点1

表1 初筛菌与出发菌的摇瓶发酵结果

菌株号乳酸% 转化率%

GA % OD pH R G%

D 110 (出发菌) D 5221 (初筛菌) D 110B (出发菌) D 3263 (初筛菌)6. 2 2. 4 36. 39 1. 18 6. 7 2. 4 8. 4 2. 6 42. 8 1. 25 6. 5 1. 85

6. 0 2. 6 38. 05 1. 21 6. 7 2. 3

7. 5 2. 5 39. 1 1. 3 6. 6 2. 0

以D 110 和D 110B 为出发菌经过初步的一次和二次离子注入, 通过初筛和摇瓶10 个批次的复筛, 得到了