酶工程原理与技术

绪论第一节酶的基本概念

酶：具有生物催化功能和特殊构象的生物大分子。

酶工程:利用酶的催化作用，在特定的酶反应器中，把相应的原料转变为产品的过程。

酶的催化作用具有：专一性、高效性，作用条件温和可控性。

第二节酶的分类与命名

酶的分类：蛋白类酶（P酶）核酸类酶（R酶）两大类别。

蛋白类酶（P酶）：氧化还原酶，转移酶，水解酶，裂合酶，异构酶，合成酶（或称连接酶）

磷酸内酶（R酶）：分子内催化磷酸内酶、分子间催化磷酸内酶。

第三节酶活力的测定

酶活力大小可用一定条件下内酶所催化的反应初速率表示。

终止酶反应的方法：

（1）加热使酶失活（2）加入适宜的酶变性剂（如三氯醋酸）；（3）调节pH值；（4）低温终止反应。

二、酶活力单位

在特定条件下，每1 min 催化1 μmol 的底物转化为产物的酶量定义为1 个酶活力单位。这个单位称为国际单位（IU）

在特定条件下，每秒催化1 mol底物转化为产物的酶量定义为1卡特（Kat） 1Kat = 6×10 7 IU 酶的比活力是指在特定条件下，单位重量（mg）蛋白质或RNA所具有的酶活力单位数。

酶比活力＝酶活力（单位）/ mg （蛋白或RNA）

第一篇酶的生产

1、提取分离法

2、生物合成法

3、化学合成法

生物合成法：经过预先设计，通过人工操作，利用微生物细胞、植物细胞或动物细胞的生命活动来获取所需酶的技术过程。

生物合成的过程：获得优良产酶菌株、优化培养、细胞新陈代谢、酶和其他代谢物、分离纯化。

反义链：在RNA的转录中，用作模板的DNA称为反义链。(3’---5’)

有义链：在RNA的转录中，不用作模板的DNA称为有义链。

不同的RNA的生物学功能：1.作为遗传信息的载体

2.具有生物催化活性。

3.tRNA是在蛋白质合成过程中，作为氨基酸载体。并由其中的反密码子

识别mRNA上的密码子；mRNA是蛋白质合成的模板；rRNA是蛋白质合成的场

所。sRNA是小分子核糖核酸，在分子修饰和代谢调节方面起重要作用。

操纵子:结构基因、操纵基因与启动子一起组成操纵子。

诱导型（有诱导物—引起诱导作用的物质）：乳糖操纵子

阻遏型（无阻遏物—引起反馈阻遏主要作用的物质）：色氨酸操纵子

作用：1.分解代谢物阻遏作用（葡萄糖效应）

2.酶生物合成的诱导作用

3.酶生物合成的反馈阻遏作用

葡萄糖效应：葡萄糖为大肠杆菌生长提供能量，当其过量时，乳糖操纵子中的β-半乳糖苷酶等一组酶合成受抑制的现象。

第一节细胞的选择

微生物

应用微生物开发酶：1）微生物种类多，酶种丰富。2）菌株易诱变，选育优良菌株。3）微生物生长繁殖快，酶易提取，特别是胞外酶。4）微生物生长周期短；不受季节等自然因素的影响。

酶生产的细胞必须具备的条件：

1、酶的产量高

2、容易培养和管理

3、产酶稳定性好

4、利于酶的分离纯化

5、安全无毒、无毒性。

第二节培养基的配制

培养基的基本成分：碳源、氮源、水、无机盐、能源、生长因子

第三节产酶工艺条件及其调节P45

溶氧速率与通气量、氧气分压、气液接触时间、气液接触面积以及培养液的性质等有密切关系。

第四节微生物发酵产酶

一、提高酶产量的措施

1、添加诱导物（诱导物的分类：酶作用底物型诱导物酶的反应产物酶作用底物类似物作诱导物）

2、控制阻遏物浓度

3、添加表面活性剂

4、添加产酶促进剂

二、酶发酵动力学

（一）酶生物合成的模式；同步合成型延续合成型中期合成型滞后合成型

中期合成型酶：酶的生物合成受到产物的反馈阻遏作用或分解代谢物阻遏作用，而且酶所对应的mRNA 稳定性差

滞后合成型的酶：非生长偶联型，酶的生物合成在细胞生长进入平衡期以后才开始，并大量积累。由于(1)培养基中存在阻遏物；(2)mRNA稳定性很好

（一）固定化细胞发酵产酶的特点

(1)提高产酶率(2)可以反复使用或连续使用较长时间(3)发酵稳定性好，对温度、pH的适应范围扩大，基因工程菌的质粒稳定，不易丢失：(4)缩短发酵周期，提高设备利用率(5)产品易于分离纯化(6)只适用于胞外酶等胞外产物的生产

第四章酶的分离纯化

1、机械破碎法：捣碎法、研磨法、匀浆法。（机械运动感产生剪切力破坏组织、细胞）

2、物理破碎法：温度差、压力差、超声波破碎法。（物理因素作用，细胞、组织外层结构破坏而破碎）

3、化学破碎法：添加有机溶剂、表面活性剂。

4、酶促破碎法：自溶法、外加酶制剂。

酶的提取

酶提取方法--盐溶：大多数蛋白类酶都溶于水，而且在低浓度的盐存在的条件下，酶的溶解度随盐浓度的升高而增加的现象。

二、影响酶提取的主要因素

主要影响因素是酶在所使用的溶剂中的溶解度以及酶向溶剂相中扩散的速度。

此外，还受到温度、pH值、提取液体积等提取条件的影响

第三节沉淀分离

一、盐析（硫酸铵）：在盐浓度达到某一界限后，酶的溶解度随盐浓度升高而降低，这称为盐析现象。第六节层析分离

层析分离是利用混合液中各组分的物理化学性质的不同，使各组分以不同比例分布在两相（固定相、流动相）中，随着流动相从固定相上流过，不同组分以不同速度移动而最终被分离。

分离纯化酶常采用：吸附层析、分配层析、离子交换层析、凝胶层析和亲和层析等

三、离子交换层析

离子交换层析是利用离子交换剂上的活性基团对各种离子的亲和力不同而达到分离目的的一种层析分离方法。

按活性基团的性质不同，离子交换剂可以分为阳离子交换剂和阴离子交换剂

由于酶分子具有两性性质，所以可用阳离子交换剂，也可用阴离子交换剂进行酶的分离纯化。

在溶液的pH值大于酶的等电点时，酶分子带负电荷，可用阴离子交换剂（引入碱性基团）进行层析分离；

四、凝胶层析

是指以各种多孔凝胶为固定相，利用流动相中所含各种组分的相对分子质量不同而达到物质分离的一种层析技术

凝胶层析的操作一般包括装柱、上柱、洗脱等过程

五、亲和层析原理