淋巴细胞分离与培养

• (2) pH 值 过高或过低,或培养过程中瓶塞 不紧,CO2 逸出,导致pH 值上升。 • (3) 诱导剂 淋巴细胞在体内外一般是不分裂 的,在培养过程中须添加刀豆球蛋白(ConA) 、 脂多糖(LPS)白细胞介素2 ( IL - 2) 、植物血 凝素(PHA) 、丝裂霉素等促分裂剂和抗原物 质。须注意它们的浓度及是否失效。 • (4) 培养器皿洗涤不干净 有蜡、油污或酸 残留。
• (5) 培养用液含有杂质 配制过程中所使用的各种溶 液必须用三蒸水,若含有Fe 、Ca 等离子及杂质,可影 响细胞的增殖 。 • (6) 接种的细胞数目过多或过少,或提取的淋巴细胞 中混有大量红细胞 。 • (7)血清质量不佳。 • (8) 恒温培养箱的CO2 、温度等不稳定。 • (9) 存在个体差异 在相同条件下,某一受试者的血 培养不成功,而对照实验培养结果正常,其原因有时无法 查出.淋巴细胞的生长情况,还与受试对象的年龄有关, 青年人的淋巴细胞比中、老年人的生长得要好。
• 3、实验步骤 • （1）培养液配制（在超静工作台内无菌操作）； • 每个培养瓶（容积30ml）中加入5ml培养液， 其中含： • RPMI1640 4ml • 灭活小牛血清 1ml • PHA 2.5mg • 青霉素 500U • 链霉素 500ug • 依次将上述试剂加入培养瓶中，反复吹打使其混 合均匀，用5%NaHCO3调节培养基的pH值至 7.2-7.4。
• 2、方法 • (1)．采静脉血2ml 加入肝素抗凝管 • (2)．用竹签将血块轻轻剥离管壁（主张用 玻璃棒），2000rPm 离心20 分钟，用毛 细吸管吸取上清（血清）于血清收集管中， 于4℃冰箱保存备用，
• 3．将装有静脉血2ml 加入肝素抗凝管（或枸 橼酸钠）轻轻摇动使血液与抗凝剂混匀，出现 凝集不能继续实验。5min 后加入Hank's 液 2ml(Hank's 液为缓冲等渗液，类似营养液， 保持细胞活性及完整性，可抵抗轻微的酸碱变 化)，手动轻轻摇匀。 • 4．用毛细吸管吸取抗凝血，将抗凝血全部沿 管壁缓慢加至另一含2ml 淋巴细胞分离液液面 上，注意保持两种液体界面清晰。
• EBV、HPV等人疱疹病毒并不携带一整套诱 导宿主细胞性状发生巨大变化的基因，它们只 是启动与细胞转化有关的一系列事件的发生， 而这些事件的发生需要细胞内蛋白质来实现。 从某种意义上来说，这些病毒只是扳动了改变 靶细胞生长特性的调控开关。它们的转化活性 来源于病毒基因组中的某些特殊基因，就是癌 基因。这些癌基因在病毒早期的裂解循环中， 参与病毒颗粒的复制；当转化发生时，它们整 合进入淋巴细胞的基因组中，持续表达癌蛋引 起细胞无限制分裂等肿瘤样改变，遂形成淋巴 母细胞系。
• （2）培养空间 • 培养液与液面上的空间二者的体积比例 一般以1∶10 为宜,培养液液面高度最好 维持在2～5mm 的范围,以便于气体交 换。 • （3）恒温培养箱 • 温度应维持在37 ℃,CO2 浓度为5 % ,O2 为95 % ,100 %的饱和湿度。
• 5、常见失败原因 • (1) 污染 • 污染仍是细胞培养失败的主要原因,包括 细菌和真菌,中药制剂尤易出现真菌污染。 支原体污染不易发觉,但对细胞生长影响 较小,尤其只培养72 小时。一般是分离 过程中的用液和培养基出现了污染。
• 【难点】 • 1．将抗凝血与Hank‘s 液的混合液加入 淋巴细胞分离液时，必须保持两种液体 界面清晰。 • 2．用毛细吸管吸取淋巴细胞层时，要掌 握好力度，在细胞层上作各个方向的吸 取，勿吸到其它层的液体或细胞，吸取 时勿使各层细胞相混。
二、淋巴细胞培养
• 1、原理 • 通常情况下哺乳动物外周血中是没有分裂细胞 的，只有在异常情况下才能发现。外周血中的 小淋巴细胞几乎都处于G1期或G0期的非增殖 状态。体外培养时经一定剂量的植物血凝素 （PHA）刺激，T淋巴细胞可转变为淋巴母细 胞，重新进入增殖周期，进行有丝分裂。外周 血中的淋巴细胞经过68-72小时（三个周期） 的短期培养，即可产生大量的增殖期细胞群。
• （2）血样本的采集：先以碘酒和75%乙 醇消毒皮肤。用2ml灭菌注射器吸取约 0.2ml肝素,作静脉穿刺，抽取外周静脉血 1ml。转动针筒以混匀肝素 • （3）接种：常规消毒后，立即将针头插入 灭菌小瓶内，送入超净工作台 ，在火焰旁 将血液滴入2～3个盛有5ml培养液的培养 瓶内，每瓶0.2～0.3ml（6号针头45度倾 斜，约20滴），盖上橡皮塞，轻轻摇动以 混匀。贴好标签，将培养瓶放在37℃恒温 箱内静置培养72h。
淋巴细胞分离与培养技术
• 淋巴细胞作为血液中白血胞的主要组成 成分，是动物机体完成细胞免疫和体液 免疫的重要基础，为抵抗外来侵害提供 了完善的免疫防护机制。同时，淋巴细 胞还具有寿命长，激活后可分裂、增殖 的特性，因此很适合于离体培养，为免 疫学研究带来极大的方便。另外，利用 体外培养的淋巴细胞进行抗癌研究、爱 滋病治疗、新药研制已屡见不鲜。
• 4、注意事项 • （1）pH 值 • 细胞生长的最适pH 为7. 0～7. 2 ,可忍耐 的pH 范围为6. 6～7. 8 ,当pH 低于6. 8 或大于7. 6 时, 都会抑制细胞生长 。 RPMI1640 培养基加入血清后pH 值一般 升高0. 2～0.4 ,故配1640 培养液及其他 用液时使pH 值达到7. 2比较合适,并且需 经常检测pH 值。
一、淋巴细胞分离
• 1、分离原理 • 人淋巴细胞的方便来源是外周血，分离 的原则是收率较高，纯度较好，失活较 低，根据不同试验有相对纯度，无论采 用哪种方法，应尽最大可能保持细胞应 有活性Baidu Nhomakorabea分离的技术可根据细胞的物理 性状和表面标志设计。
• 密度梯度离心法 • 其原理是：人外周血中各种细胞的密度不同， 人红细胞密度为1.093，粒细胞为1.092，淋 巴细胞为1.074±0.001。密度梯度离心法的 原理主要根据各类血细胞比重的差异，利用比 重介于某两类细胞之间的细胞分离液对血液离 心，使一定比重的血细胞依相应的密度梯度分 布于不同的独立带，从而达到分离的目的。
• 5．将试管平衡后置水平式离心机， 2000rpm 离心10min。 • 6．用毛细吸管仔细吸取血浆与分层液界面 处淋巴细胞层至一刻度离心管内。 • 7．加入Hank's 液5ml，手动旋转试管使 液体混匀，2000rpm 离心10min，弃上 清，沉淀即主要为淋巴细胞。
• 备注：如做淋巴细胞转化或其它培养，所 用试剂、器材应是无菌的。
三、永生淋巴细胞株的建立
• 为保留遗传病标本，用继代培养或病毒转化方法 可使很多类型的细胞数量倍增，如皮肤成纤维细 胞、脐静脉内皮淋巴细胞是分子与细胞遗传学研 究中常用的材料,但由于其寿命很短,而且由于许 多原因难以再次获得病人或有重要研究价值个体 的血液标本,给临床诊断和进一步的深入研究带来 一定困难。并且随着这些个体的死亡,这些宝贵的 材料就会永远丢失。细胞、干细胞、胶质细胞、 肿瘤细胞如宫颈癌上皮细胞等。其中EBV转化淋 巴细胞所建立的永生培养细胞库是最为成熟和标 准化的。
• EB病毒可有效地转化外周血B淋巴细胞, 建立永生的淋巴母细胞系,可永久保存宝 贵的病例材料。世界上许多遗传研究中 心都用此方法处理每一份血标本，在液 氮中冻存转化后的淋巴细胞。这样就可 以无限期地保存、复苏和增殖病人体细 胞样本，建立人类遗传种质库
• 淋巴细胞是EBV的天然宿主，EBV对B 细胞有天然的亲和力并可使其发生转化 并增殖。与通常在体外使用的B细胞活化 剂引起的B细胞的暂时的一过性分裂不同， EBV转化的淋巴细胞是一种非裂解型细 胞：病毒感染后不能在细胞体内复制后 代，但能整合在宿主细胞基因组上，一 部分整合了病毒基因组的细胞发生转化
• 2、实验准备 • 1. 实验器材： • 超净工作台、37℃恒温培养箱、酒精灯、无菌注射器 （1ml、2ml、5m1）、针头、培养瓶、橡皮塞、75％ 酒精棉球、止血带、离心机、定时钟、试管架、 手术镊 子 • 2.实验材料： • 人外周静脉血（肝素抗凝） • 3.试剂 • 抗凝剂：肝素溶液（500U/ml） • 培养基：RPMI1640, 按照说明书配制后抽滤、分装， 冻存备用。 • 小牛血清：市售，冰冻保存，用时在56℃水浴条件灭 活。 • 植物血球凝集素（PHA）：市售，按说明书要求使用 • 抗菌素：青霉素：50000U/ml，链霉素： 50000ug/ml，均用无菌生理盐水配制。培养液中的终 浓度均为100 U/ml • 5%NaHCO3