体外分析技术

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函数式
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标准曲线
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得到的标准曲线之所以是曲线而不是直线， 这是可逆反应的质量作用定律决定的。函 数式见上图 根据放射免疫分析法的基本原理，建立放 射免疫分析必须具备以下技术条件： 1、可靠的标准品 2、高比活度的标记品 3、高亲和力的抗体 4、合适的分离技术 5、理想的曲线拟合方式
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2、标记抗原

标记抗原是样品测量的基础 对标记抗原的要求是： 1）比活度和放射化学纯度必须足够 高——以保证分析的灵敏度 标记抗原的放化纯必须不小于95% 2）放射性核素的半衰期合适 3）标记抗原的生理活性未改变 4）标记抗原的应有较高的稳定性
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3、抗体

在放射免疫分析中，抗体质量的好 坏是影响放射免疫分析的关键因素 之一。 高质量的抗体必须具备三个条件： 高亲和力、高特异性、高滴度
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三、质量控制

Quality Control , QC

（一）定义：质量控制 就是控制误差， 即对分析工作中的误差进行经常性的 检查，遇有质量异常则及时采取对策， 以保证分析误差控制在可接受的范围 内。 放射免疫分析是一类高灵敏度的超微 量分析技术，极易受各种因素的影响 而使检测结果失真，因此必须有严格 的质量控制体系。
二、基本方法

（一）基本试剂
放射免疫分析反应需要三种基本试剂： 1、标准品（非标记标准抗原） 2、标记抗原 3、抗体
Байду номын сангаас
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1、标准品
标准品是样品定量的基础，它的 质和量的变化直接影响待测样品的测 定值。 对标准品的要求如下： 1）标准品和待测样品应属于同一种物质； 2）在与抗体反应时，标准品和待测样品 应有相同的活性和亲和能力； 3）高度纯化，不含有影响分析的杂质； 4）对标准品的定量一定要精确
1、logit-log模型 2、四参数logistic模型： 3、四参数质量作用定律模型 U={（A-D）/[1+（X/C）B]}+D 其中U为各试验管结合率（含NSB） A、B、C、 D分别为0剂量时的结合率， logit-log函数的斜 率，各点实际结合率下降一半时X的量，NSB。

F或B/F与Ag的量呈函数关系，利用这一函数关系求
出待测抗原的的浓度。
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反应式
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具体方法
用一系列浓度已知的标准抗原（浓度递 增的标准品）在严格相同的条件下与一定量
的*Ag和有限量的Ab共同反应，反应达到平
衡后，分离B与F，测定B的放射性做为纵坐 标，以每一反应管的标准品浓度为横坐标， 绘成标准曲线。根据被测抗原试管中的B的 CPM值在标准曲线上求出该抗原的浓度
定义与分类
一、体外放射分析技术：在体外实验条件下，以 特异性结合反应为生物学基础，以结合反应动 力学规律为共同方法学基础，利用核射线对体 内的各种生物活性物质进行体外定量分析的各 种方法。 二、分类： 1、竞争性体外放射分析法（如RIA） 2、非竞争性体外放射分析法（如IRMA） 3、由体外放射分析技术派生出来的非放射性标记 免疫分析技术（酶、化学发光、时间分辨荧光 分析）

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1）高亲和力

只有高亲和力的抗体才能得到斜率 高的标准曲线，而斜率高的标准曲 线是高灵敏度和高精密度的必备条 件。亲和力测定方法最常用的是 Scatchard作图法（P36） KA值越大（即直线斜率越大）， 抗体的亲和力越大方法的灵敏度和 精密度越高
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2）高特异性


抗体必须与反应系统中抗原以外的 物质尤其是抗原类似物结合得少， 以免影响分析结果 抗体特异性的测定： 方法：测抗体的交叉反应率 交叉反应率越小，抗体的特异性越 高
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1、精密度（precision）是指在相同条件 下对某一样品多次检测所得结果的符合 程度，即复管的重复性，它是最重要的 质量参数。 常用精密度图来评价实验室 内部的精密度水平。 2、准确度（accuracy）是指测定值与真 值的接近程度，用回收率来评价，回收 率是反应测定值偏差的质控指标。 3、灵敏度（sensitivity）是指检测能与 零剂量区分的最小检测量。 累计10次测定结果，计算出零标准 管的结合率为X—2SD时对应的剂量值， 即为灵敏度。
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一、基本原理

竞争性抑制 被测量的微量物质Ag（未标记抗原）
和标记有放射性核素的该种物质*Ag(标记抗原)对其抗 体Ab有相同的结合能力，反应时， Ag和 一定量的 *Ag竞争有限量的Ab。生成的*AgAb的量随Ag的增加
而减少，呈负相关关系。

反应达到平衡后，分离*AgAb （B）与*Ag（F），B、
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3）高滴度


滴度 是抗体实际应用时的稀释倍数 抗体的滴度越高，其中的干扰物质 的影响就越小。 滴度的测定：以一定浓度的*Ag与稀释 度不同的抗体进行反应，当*Ag的结合 率为50%时对应的抗体的稀释度即为 该抗体的滴度。这时的抗体浓度就是 实际使用时的浓度。
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（二）分离技术



1、聚乙二醇（PEG）沉淀法 2、双抗体沉淀法 3、双抗体+PEG法 4、葡萄球菌A蛋白（SPA）沉淀法 5、活性炭吸附法：葡聚糖包被的活性炭 6、微孔滤膜过滤法：玻璃或醋酸纤维滤膜 7、磁化分离技术：氧化铁-活性炭（-抗体） 8、固相分离技术： 1）第一抗体与试管联接 2）第二抗体与试管联接
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（三）数据处理
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第一节 放射免疫分析法 radioimmunoassay， RIA

1959年，美国的两位科学家Berson和 Yalow首次将示踪技术的高度灵敏性和免 疫学抗原-抗体结合的高度特异性结合起 来，创立了放射免疫分析技术，开创了 生物活性物质微量测定技术的新时代。 RIA 的特点：灵敏度高、特异性强、准 确度高、稳定性好。经不断改进，现在 广泛应用于临床检测和科学研究的很多 领域。
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（三）实验室内部质量控制

实验室内部质量控制侧重对检测质量 的控制，它保证从收集样本开始到发 出报告为止的全过程中，能及时发现 检测过程中出现的各种误差，分析产 生的原因，找出纠正的办法，以确保 检测的质量。 常用以下指标对检测结果做可靠性评 价：精密度、准确度、特异性、灵敏 度、稳定性、有效性
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（二）误差的来源


1、系统误差：这种误差表现为检测结 果呈倾向性的偏高或偏低，常有一些可 以确定的因素导致，如：量器不准、试 剂不纯、标准品的定量不准、仪器状态 不佳、分离效果不好、不适当的曲线拟 合模型等等，系统误差是通过努力可以 消除的。 2、随机误差：这种误差多由难以确定 且无法控制的原因引起，误差的出现是 随机的，由各种偶然因素造成，符合正 态分布，如量取液体或分离时的误差。