体外分析技术
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体外分析技术
Ag
25
50
100
200
400
800
*Ag
Ab
分离B、F
B1%
B2%
B3%
B4%
B5%
B6%
1
2
3
4
5
6
B%
？
B%
F%
B/F
Calibration Curve
优缺点比较
1、放射免疫分析技术
放射免疫技术是利用放射性核素可探测的灵敏性、精确性与抗原抗体反应的特异性相结合的一类免疫测定技术。 放射免疫分析（radioimmunoassay，RIA）——以标记抗原与反应系统中未标记抗原竞争结合特异性抗体来测定待检样品中抗原量。 免疫放射分析（immunoradiometric assay，IRMA）——以过量标记抗体与抗原非竞争结合，采用固相免疫吸附载体分离游离和结合标记抗体。
不同的肿瘤标记物可能出现在相同的粘蛋白上 在肿瘤细胞株中CA199,CA50和CA242共同表达于 MUC-1和诞腺蛋白中。（Baeckstrom et al, 1992）
肿瘤的发展及诊断期
肿瘤标志物在全球的应用情况
肿瘤标志物的分类（化学特性）
癌胚抗原类标志物 糖类抗原标记物 酶类标志物 激素类标志物 癌基因 其他
肿瘤与肿瘤标记物
相同的肿瘤可能检测出多种不同的肿瘤标记物 相同的肿瘤标记物可能出现在不同的粘蛋白上 CA19-9和CA50已经在不同的粘蛋白核心上得到鉴定: MUC-1,MUC-3。（Baeckstrom et al, 1992和1995） 涎腺蛋白。（Baeckstrom et al,1995） 颌下腺粘蛋白 支气管肺泡粘蛋白
1、放射免疫分析技术
优点：超微量分析技术，具有很高的精密度、灵敏度和准确度 缺点：反应条件要求一般，但该技术所用试剂具有放射性，对人体有一定的危害，实验人员应加强防护。同时试剂存在半衰期，试剂必须在半衰期内用完，否则试剂会作废，这需要科学地做好试剂计划。另外反应过程中抗原的含量低到一定程度时会出现不确定因素，使灵敏度受到限制。
核医学体外放射分析技术课件
有效地排除非特异性物质对结合反应的干 扰。
二、结合反应动力学规律
• 遵守质量作用定律 • [L]+[B] 适当的实验条件 [LB]
衍生设计出两种方法学
• 1、竞争结合（competitive binding) • 过量的配体与有限量的结合剂发生竞争性
结合反应。 • 2、非竞争结合（non-competitive binding) • 过量的结合剂与有限量的配体，在非竞争
的条件下发生结合反应。
衍生设计出两种方法学
• 1、竞争结合（主要应用：放射免疫分析）
• [L]+ [L*]+[B] [LB] +[L*B]
• 2、非竞争结合
•结合在试管 或包被珠上
• Sp.Ab1+Ag Sp.Ab1.Ag
• Sp.Ab1.Ag +Ab2* Sp.Ab1.Ag.Ab2*+Ab2*
优点
• 慢性淋巴细胞性甲状腺炎： • 早期：T3,T4升高，然后降低，
TSH,TGAB,TPOAB升高。 • 甲状腺肿瘤：TG升高。 • 全身性疾病：心血管疾病、肿瘤等： • T3下降，rT3、TSH升高。
（二）肾上腺疾病
• 皮质醇增多症： • ACTH\COR正常情况下有节律分泌，检测
可以与单纯性肥胖区分。 • 原发性醛固酮增多症：尿游离皮质醇
• 反应误差关系 • 精密度图
• 2、准确度：测的值与其标称值之间的 相符程度。
• 3、灵敏度（sensitivity): • 4、特异性(specificity) • 5、稳定性(stability)
（三）质量评价
• 内部质量控制 • 外部质量控制
三、以配体与受体间结合反应 为基础的分析系统
二、结合反应动力学规律
• 遵守质量作用定律 • [L]+[B] 适当的实验条件 [LB]
衍生设计出两种方法学
• 1、竞争结合（competitive binding) • 过量的配体与有限量的结合剂发生竞争性
结合反应。 • 2、非竞争结合（non-competitive binding) • 过量的结合剂与有限量的配体，在非竞争
的条件下发生结合反应。
衍生设计出两种方法学
• 1、竞争结合（主要应用：放射免疫分析）
• [L]+ [L*]+[B] [LB] +[L*B]
• 2、非竞争结合
•结合在试管 或包被珠上
• Sp.Ab1+Ag Sp.Ab1.Ag
• Sp.Ab1.Ag +Ab2* Sp.Ab1.Ag.Ab2*+Ab2*
优点
• 慢性淋巴细胞性甲状腺炎： • 早期：T3,T4升高，然后降低，
TSH,TGAB,TPOAB升高。 • 甲状腺肿瘤：TG升高。 • 全身性疾病：心血管疾病、肿瘤等： • T3下降，rT3、TSH升高。
（二）肾上腺疾病
• 皮质醇增多症： • ACTH\COR正常情况下有节律分泌，检测
可以与单纯性肥胖区分。 • 原发性醛固酮增多症：尿游离皮质醇
• 反应误差关系 • 精密度图
• 2、准确度：测的值与其标称值之间的 相符程度。
• 3、灵敏度（sensitivity): • 4、特异性(specificity) • 5、稳定性(stability)
（三）质量评价
• 内部质量控制 • 外部质量控制
三、以配体与受体间结合反应 为基础的分析系统
第五章体外分析技术
（3）分离方法主要是使大分子和小分子物质分离。
双抗体法(测量B)： 用抗原免疫动物而产生的抗体称为第一抗体，用第一抗 体再免疫另一种动物所产生的抗体称为第二抗体。
当RIA反应完成后，于反应液中加入第二抗体，第二抗 体则与含有第一抗体的免疫复合物B相结合形成第二抗体复 合物，其分子量比第一抗体复合物大，可用离心方法分离 出来，称为双抗体法（double antibody method）。
(一)实验室内质量控制： 是一个实验室内部实验方法的质量控制，以便在一个人 的同一批或不同批实验中，不同操作者和不同方法之间有 可比性。 零标准管结合率（B0%）：即最大结合率，指不加非标记抗 原时，标记抗原与抗体的结合率，一般要求在30%～50%，该 指标主要用来反映标记物与抗体的质量是否稳定。 非特异性结合率（NSB%）：指不加抗体时标记抗原与非特 异物质的结合率，一般要求＜5%～10%。 最低浓度管与最高浓度管的结合率之差：＞30%。
标准曲线直线回归的参数：包括截距a、斜率b和相关系数r， 要求a、b值稳定，r ＞ 0.99。 ED25、ED50与 ED75：指标准曲线的结合率在25%、50%和75%时 对应的抗原浓度值，它反映标准曲线的稳定性，有助于批间 结果的比较。 质控图：连续测定10批以上高、中、低三种已知浓度的质控 血清的均数±标准差（x±s），画出均数线与两个标准差的 范围，将以后每次实验测定的高、中、低值标在图上，即为 质控图。 WHO要求在一次实验中有下列情况之一者，其结果应舍弃： ① 三种QCS中有一个测定值＞3s； ② 三种QCS中在同一方向上有两种＞2s；
2．反应动力学：因标记抗体是过量的，且反应是非竞争 性的，抗原抗体是全量反应，故反应速度比RIA快。
3．灵敏度明显高于放射免疫分析，约为放射免疫分析的 10～100倍。
实验核医学-体外分析技术
实验核医学
Experimental nuclear medicine
体外分析技术
In Vitro Radioassay
主讲人/制作人：
体外分析技术
In Vitro Radioassay
一、体外放射分析技术 二、非放射免疫分析技术 三、临床应用
结束
体外放射分析
一、体外放射分析的概念和分类
二、放射免疫分析（RIA) 1、基本原理 2、必备条件 3、质量控制
放射免疫分析Radioimmunoassay（RIA)
一、基本原理：
放射免疫分析是竞争性体外放射分析原理的代表。 在体外，以放射性核素标记抗原和非标记抗原，同时 与适量的特异性抗体发生的竞争性免疫结合抑制反应。
*Ag + Ab + Ag
*Ag-Ab + *Ag
Ag-Ab十Ag
RIA操作步骤：
1、加样 2、温浴反应 3、分离B/F 4、放射性测量 5、绘制标准曲 线，查找待测物 浓度
b值稳定，r＞0.99。
4．ED25、ED50及ED75 指标准曲线的结合率在25％、50％及75％时对应的抗原浓度值，
它反映标准曲线的稳定性，有助于批间结果的比较。
5．反应误差关系(RER) 是评价RIA整批误差的综合指标，RER应＜0.04。
6．质控图
WHO要求在一次实验中，有下列情 况之一者，其结果应予舍弃：
质量控制包括监测各重要环节的质量、测定误差和结果的 可靠性。
（一）、质量控制
1．最高结合率(B0％) 指不加非标记抗原时标记抗原与抗体的结合率，一般要求在30～50％。
2．非特异性结合率(NSB％) 指不加抗体时标记抗原与非特异性物质的结合率，一般要求＜5～10％。
Experimental nuclear medicine
体外分析技术
In Vitro Radioassay
主讲人/制作人：
体外分析技术
In Vitro Radioassay
一、体外放射分析技术 二、非放射免疫分析技术 三、临床应用
结束
体外放射分析
一、体外放射分析的概念和分类
二、放射免疫分析（RIA) 1、基本原理 2、必备条件 3、质量控制
放射免疫分析Radioimmunoassay（RIA)
一、基本原理：
放射免疫分析是竞争性体外放射分析原理的代表。 在体外，以放射性核素标记抗原和非标记抗原，同时 与适量的特异性抗体发生的竞争性免疫结合抑制反应。
*Ag + Ab + Ag
*Ag-Ab + *Ag
Ag-Ab十Ag
RIA操作步骤：
1、加样 2、温浴反应 3、分离B/F 4、放射性测量 5、绘制标准曲 线，查找待测物 浓度
b值稳定，r＞0.99。
4．ED25、ED50及ED75 指标准曲线的结合率在25％、50％及75％时对应的抗原浓度值，
它反映标准曲线的稳定性，有助于批间结果的比较。
5．反应误差关系(RER) 是评价RIA整批误差的综合指标，RER应＜0.04。
6．质控图
WHO要求在一次实验中，有下列情 况之一者，其结果应予舍弃：
质量控制包括监测各重要环节的质量、测定误差和结果的 可靠性。
（一）、质量控制
1．最高结合率(B0％) 指不加非标记抗原时标记抗原与抗体的结合率，一般要求在30～50％。
2．非特异性结合率(NSB％) 指不加抗体时标记抗原与非特异性物质的结合率，一般要求＜5～10％。
体外分析技术核医学
通过核医学技术可以检测和定位肿瘤，为早期诊断和治疗提供准确信息。
2
心脏疾病评估
核心医学可以评估心脏功能、血液供应情况以及冠状动脉梗塞的程度。
3
神经精神疾病研究
利用核医学技术，研究人类的脑部功能，了解神经精神疾病的病理生理机制。
未来展望
随着科技的不断进步，体外分析技术核医学将继续发展，并在疾病诊断、治疗和疗效评估方面发挥越来越重要 的作用。
PET显像技术
正电子发射计算机断层显像（PET）利用放射性同位素的正电子发射特性，提供高分辨率、高敏感度的全身代 谢和功能成像。
SPECT显像技术
单光子发射计算机断层显像（SPECT）使用放射性同位素的单光子发射特性，提供三维的功能和代谢成像，广 泛用于心脏和脑部疾病诊断。
临床应用实例
1
癌症筛查
结束语
体外分析技术核医学为医学研究和临床实践带来了革命性的进展，将为人类 健康的未来带来更多希望和机遇。
Байду номын сангаас
体外分析技术核医学
体外分析技术核医学是一门研究放射性同位素用于医学诊断和治疗的技术。 本次演讲将带您了解该领域的原理、技术和应用实例，并展望未来发展。
原理介绍
体外分析技术核医学利用放射性同位素的特性，通过探测其发出的放射线来 获取有关人体内部结构和功能的信息。
体外标记法
体外标记法是使用放射性同位素标记生物分子，如蛋白质和抗体，以便在体 内观察特定细胞、器官或病变的存在和活动。
核医学课件：体外分析技术
标准曲线
目前已普遍采用计算机进行数据处 理，自动绘制标准曲线，自动换算 样品中被测物质的浓度
实验操作基本步骤
1.加样：加样总体积要保持一致，所处的介质环境 也要一致。
2.孵育：根据不同的分析对象孵育的温度和时间 不同，一般是37℃。
3.分离：选择好的分离方法分离游离抗原和 抗原－抗体复合物。 4.测量：测量游离或结合物部分的放射性。 5.数据处理：绘制标准曲线和待测物浓度的计算
* Ag
基本反应式
Ag-Ab
*Ag:标记抗原，Ag 非标记抗原 Ab：抗体 *Ag- Ab 标记抗原抗体复合物 Ag- Ab 非标记抗原抗体复合物
Ag-Ab+Ag
条件：1.*Ag与Ag 免疫活性相同
2. *Ag与Ab 恒量
*Ag-Ab+*Ag
理
*Ag与Ag由于免疫化学性质一致，共同竞争 性与Ab结合，当*Ag和Ab的量保持恒定， *Ag与Ag之和大于Ab时，则*Ag-Ab复合物的 形成受Ag含量的制约，二者之间存在函数关 系 ， 即 Ag 量 越 大 ， *Ag-Ab 量 越 小 ； Ag 量 越 小，*Ag-Ab量越大；测定*Ag-Ab或*Ag量即 可推算出被测Ag量
量B、F的cpm
*Ag
B%=B/(B+F)
Ag 1
2
3
4
5 6？
25 50 100 200 400 800
B%
B% 标准曲线
常 用 的 反 应 参 数 有 B%，B/F，F/B、 F%等这些反应变量都可以用作纵坐标来对 应标准抗原的浓度作标准曲线，选用的反应 变量不同，标准曲线的形状也不同。但是这 些标准曲线都是反映的反应变量对应标准抗 原浓度变化而变化的函数关系。
体外分析技术
Dr. Yalow
算出Ag 量的一种超微量分析技术。
6
放射免疫分析法的创立
开创了医学生物学超微量分析方法
使人体内微量生物活性物质的测量成为可能
对现代医学的发展起到推动作用 集中了放射性核素示踪技术的高灵敏度和免疫发应的高特 异性，具有灵敏度高、特异性强、精密度好、应用面广、 方法简便等优点。
7
• R：放射性核素标记抗原
体结合以外，还要和一些杂质蛋白或容器的管壁等结
合，对我们的分析结果产生影响。NSB管是用蒸馏水 代替特异性抗体，在相同条件下反应后测得的放射性。
19
3. 总放射性管（T） 反应后不分离就直接测得的放射性 就是总放射性。表示标记抗原抗体复合物和游离的标 记抗原的总放射性。
4. 标准管（B1~Bn） 放有不同浓度的标准抗原，再加入 相同量的标记抗原和特异抗体。一般在反应后分离出 沉淀，测定沉淀的放射性作为B。 5. 样品管（Bx） 用同剂量的样品代替标准管中的标准 抗原，在相同条件下反应和分离，同样取沉淀测得其 放射性，就可以在绘制的标准曲线上找到样品的浓度。
• 她的发明为我们检测体内微量物质提供了新的手段。
• 但当Yalow教授将稿件投向《科学》杂志时，惨遭拒绝。然后她将文 章改投JCI，暂被拒绝，审稿者要求她把“发现了胰岛素抗体”的词句
改成“发现了结合球蛋白”，因为当时认为抗体是抗细菌的。
• 事实证明Yalow的发现是正确的，是有重大价值的。她于1977年获 得诺贝尔医学奖。在获奖演讲中，她特地向全世界展示了那封拒绝信。
体外分析技术
彭志平 重庆医科大学
1
生物活性物质
• 生物活性物质是指来自生物体内，能作用于生物体、组织、
细胞、生物大分子并产生某种效应的物质。
体外分析技术
Berson & Yalow
History review
1960年美国的Berson和 Yalow 将核技术与免疫学 技术结合建立了放射免疫 分析法。 首先用于测定血浆胰岛素 浓度，由于该法对医学的 巨大贡献，1977年Yalow 获得了Nobel Prize。
Yalow
Berson
Radioimmunoassay
3.经过一定时间的温竞争结合反应；4.待竞争结合反应平衡后，分离结合B（Bond）部分和游离F(Free)部分；
5.用放射性探测器测得*Ag-Ab放射性为B或游离*Ag的放射性为F；
6.计算出结合率B%[B/（B+F）×100]，或B/B0%；B0为不含Ag的结合率，因Ag为“0”， 故B0 *Ag-Ab的结合率为最大结合率； 7.以B%或B/B0为纵坐标，标准抗原浓度为横坐标，绘制出B%或B/B0随Ag量变化的曲线即 为标准曲线（图4-2）。
免疫放射分析法（Immunoradiometric assay, IRMA） 是1968年由Miles 和Hiles应用125I标记牛血清胰岛 素获得成功而建立的，到70年代中期单克隆抗体 (McAb)的制备技术问世以来，免疫放射分析法的分 析技术得到突破性的发展，使体外放射分析的灵敏 度和精确度不断提高，应用迅速推广。
Ab限量，Ag*定量, Ag*和Ag的量大于 Ab结合位点，二者 通过竞争方式与Ab 结合；随着Ag增加，Ag* 与Ab结合形成Ag*Ab复合 物的放 射量降低,二者变化 成函数关系。
抗原抗体反应
Ag*
反应条件 体积 温度 时间 pH Ab 平衡 非平衡 一步法 二步法
Ag
(标准Ag/样品Ag)
体外放射分析的临床应用
体外放射分析的临床应用体外放射分析（in vitro radiolabeling）是一种利用放射性同位素标记化合物，并通过测量其放射性衰减来定量分析和测定化合物在生物体内的代谢和动力学特性的方法。
这种技术被广泛应用于医学和生物学领域，为临床诊断和治疗提供了重要的工具和指导。
本文将探讨体外放射分析在临床应用方面的重要性和发展。
体外放射分析技术是通过选择适当的放射性同位素对目标分子进行标记，然后通过计数器或放射性测量设备测量其放射性衰减，从而获得相关的代谢和动力学数据。
借助这项技术，医生和研究人员能够了解药物在体内的分布、转化和清除情况，从而为临床治疗提供科学的依据。
在临床应用方面，体外放射分析技术在药物研发、肿瘤诊断和治疗、心脑血管疾病研究等领域发挥着重要作用。
首先，该技术可以用于药物药代动力学研究，通过测量药物在体内的消除速率和分布情况，进一步优化药物剂量和给药方式，以提高治疗效果和减少不良反应。
其次，体外放射分析还可用于肿瘤标记和显像，通过选择适当的放射性同位素标记肿瘤特异性配体或药物，可以帮助医生准确评估肿瘤的位置、大小和代谢活性，从而为肿瘤的诊断和治疗提供重要信息。
此外，体外放射分析还可以用于心脑血管疾病研究，包括心脏灌注显像、脑血流量测定等，为相关疾病的诊断、治疗和病情监测提供有力支持。
与传统的临床检测方法相比，体外放射分析技术具有一定的优势和特点。
首先，放射性同位素标记物具有极高的灵敏度和特异性，可以在较低浓度下进行检测，从而实现对生物体内微量物质的准确分析。
其次，该技术具有实时动态监测的能力，能够对药物和其他生物分子在生物体内的时空分布情况进行连续观察，揭示其代谢途径和作用机制，为仿真仿真仿真量给药提供重要参考。
此外，由于体外放射分析使用的是放射性同位素标记，其测量结果更具客观性和可比性，能够为临床研究和临床治疗提供科学依据。
尽管体外放射分析技术在临床应用领域具有广阔的前景，但仍然面临一些挑战和限制。
(核医学课件)02.RIA体外分析技术
RIA体外分析技术的优势与局限
1 优势
高灵敏度：能够检测极低浓度的物质
2
高特异性：能够准确区分类似结构的分 子
3
4 局限
广泛应用：适用于多种生物样品和分析 物质
放射性污染风险，需要严格的实验室操 作控制
常见的RIA体外分析技术方法
RIA技术在医学诊断和研究中有多种变种：
• 双抗体RIA • 竞争性RIA • 免疫放射分析（IRMA） • 固相RIA • 辐射免疫沉淀法（RIP）
放射性示踪技术
免疫学
RIA利用放射性示踪技术标记 分析物质，使其具备辨识性， 进而实现可靠的浓度测定。
RIA基于抗原抗体反应原理， 利用特异性抗体对待测物质 进行检测，确保高特异性和 高敏感性。
实验室应用
RIA广泛应用于医学诊断、生 物医学研究和临床实验，可 检测和分析激素、肿瘤标志 物、免疫功能指标等生物分 子的含量。
激素诊断
RIA可用于测定病。
肿瘤标志物检测
RIA可以精确测定血液或组织中的肿瘤标 志物，用于早期诊断、治疗监测和预后评 估。
免疫功能检测
RIA在评估免疫功能指标，如免疫球蛋白、 细胞因子等方面发挥重要作用。
药物浓度测定
RIA可测定药物在体内的浓度，用于调整 和监测药物治疗的效果。
(核医学课件)02.RIA体外 分析技术
为了有效地进行医学诊断，了解RIA体外分析技术的原理和应用至关重要。本 节将介绍RIA体外分析技术的基本知识和发展前景。
RIA体外分析技术的概述
RIA体外分析技术是一种高灵敏度、高特异性的实验室分析方法，用于测量微量物质在体内或体外 的浓度。通过结合放射性示踪技术和免疫学，RIA可以检测和定量分析各种生物分子。
第五章体外分析技术
的疗效判断,评价胰岛素产品质量.
骨钙素解甲状
腺\甲状旁腺功能
肝脏
急性黄疸型肝炎\慢性活动性肝炎\肝硬化
胆酸 放免<300μg/dl 肝癌\胆汁淤积时明显升高,慢性迁延性肝
炎及胆囊炎轻度升高。妊娠胆淤明显升高。
透明质酸 放免 <120μg/l 肝硬化\肝纤维化\慢性肝炎时升高,肝硬
同上
甲状腺球 放免〈30%
甲状腺自身免疫疾病特异指
蛋白抗体
标，桥本氏甲状腺炎
甲状腺微 放免〈20%
甲状腺自身免疫疾病特异指
粒体抗体
标，桥本氏甲状腺炎
TSH 免放 0.4-3.1μIU/ml 鉴别原发与继发甲低,评价下
丘脑-垂体-甲状腺轴功能,垂体瘤,库欣综合征
甲状腺 放免4-14.5μg/ml 诊断甲癌\慢性淋巴细胞性
三、质量控制
Quality Control , QC
（一）定义：质量控制 就是控制误差， 即对分析工作中的误差进行经常性的 检查，遇有质量异常则及时采取对策， 以保证分析误差控制在可接受的范围 内。
放射免疫分析是一类高灵敏度的超微 量分析技术，极易受各种因素的影响 而使检测结果失真，因此必须有严格 的质量控制体系。
CA-153 放免<30U/ml 乳癌诊断特异,乳癌肝及骨转移\卵巢癌\
子宫内膜癌一定程度增高
肾上腺及肾脏
尿免疫球蛋白 放免<8mg/l 早期诊断肾脏受损\受损部位及程度判断
尿白蛋白 放免<10mg/l
同上
尿β2微球蛋白 放免<230mg/l
同上
上午8时: 50~280μg/l 综合征,肾上腺肿瘤、肿瘤、应激
糖类抗原 放免<20mg/l 肿瘤诊断\预后, 放化疗及手术后的疗
核医学体外分析技术
资料仅供参考,不当之处，请联系改正。
抗CGMP抗体的交叉反应图
资料仅供参考,不当之处，请联系改正。
（3）高滴度的抗体：
抗体滴度(Titer)指抗体实际应用时的稀释倍数。
稀释倍数越大，抗体的滴度越高，滴度一般要求在1/1000以 上为好。
滴度曲线的目的：确定抗体稀释度；找出抗原和抗体 的最适比例（B/T为50%时的抗体稀释度）。
1Bq=1/S
1Ci=3.7
10¹ºBq
2)保持标记抗原的免疫活性：
每个蛋白质分子上标记1-2个碘原子。
资料仅供参考,不当之处，请联系改正。
3)便于放射性测量：
125I标记的抗原有r射线能直接测量
4)放射化学纯度高： 放射化学纯度: 是指具有免疫活性的标记抗原占总 放射性的百分数。 放化纯度要求大于90%以上
❖ 诺贝尔医学奖获得者－ Yalow博士。
❖ 1959年 Yalow和 Berson两位博士在研究胰岛素的抗 体时发展起来的。最早建立的是INS的RIA法。
❖ RIA法是一种高特异性、
❖ 高灵敏度的微量检测技术。
American physicist and medical researcher Rosalyn Yalow, corecipient of the 1977 Nobel Prize in physiology or medicine, "for the development of radioimmunoassays of peptide hormones."
❖ 目的：利用标准曲线来推算出病人样品（Ag）的含量。
❖ 配制一系列的标准品浓度：（0、20、40、80、160和320ng/L）
1B。 2
请简述体外分析技术的发展和现状
请简述体外分析技术的发展和现状
这几年体外分析技术迅猛发展,从基因水平的基因测序、SNP筛查、点突变基因诊断，到蛋白水平的各种生物标志物(biomarker)检测，到细胞水平的循环肿瘤细胞检测（CTC）、薄层液基细胞学检测（TCT），再到组织水平上的PET/CT 等.还有最近比较热的是一滴血可检测多个疾病指标的报道。
总的来说体外分析向更简便，更快捷，非侵入性，多信息化的方向发展。
虽说体外分析产业在中国起步较晚，近年来却发展迅速，深受资本追捧。
中国体外分析市场快速发展，预计将在未来的10~15年内超过美国，成为世界上最大的体外诊断市场。
根据EvaluateMedTech的预测我们可以看到，体外分析产业拥有巨大的潜力。
近年来，国家也从政策层面大力支持和整顿体外诊断行业的发展，从行业整体看，受益于医保覆盖面的提升及医院诊断技术的升级，国内体外分析断产业近年来整体快速成，近年来，随着中国医疗不断的改革，人们对自身健康愈加关注都驱动了体外分析试剂市场的需求，加上国家政策的大力扶持，体外诊断试剂未来将成为并购高发的产业地带。
体外分析技术
体外分析技术体外分析技术是指在试管内进行反应从而测定某生物活性物质的超微量分析技术。
该类技术的特点是高灵敏度和高特异性，广泛用于临床和科学研究的很多领域。
应用最多的是：放射免疫分析、免疫放射分析、受体的放射配基结合分析及非放射性免疫分析。
第一节放射免疫分析一、原理放射免疫分析法 (radioimmunoassay,RIA) 的基本原理是，限量标记抗原[*Ag]和可变量的非标记待测抗原[Ag]与定量的特异抗体[Ab]发生竞争结合反应，通过测定复合物的放射性来计算出待测非标记抗原的量。
这一过程可用下式表示：*Ag + Ag + Ab [AgAb]* + [AgAb]上述式中，Ab的分子数少于*Ag，因此即使系统中没有Ag，仅有*Ag，当反应达到平衡时，绝大部分 (因为是可逆反应，不会是100%) Ab将形成*AgAb复合物。
如果系统中加入Ag，则Ag与*Ag竞争结合Ab，形成AgAb，*AgAb将减少。
Ag越多则*AgAb越少。
实践和理论推导都证明，*AgAb和Ag呈二次方程的函数关系，如以Ag为横坐标，*AgAb (B)或*AgAb 占加入总*Ag的% (B%)为纵坐标，是一条斜率逐步由大变小的下降曲线。
如以游离的*Ag (F)或游离*Ag占加入总*Ag的% (F%)为纵坐标，则是一条斜率逐步由大变小的上升曲线。
也可以*AgAb/*Ag的比值 (R)为纵坐标，也是一条斜率逐步由大变小的上升曲线。
分析中，首先以不同量的已知标准品Ag和定量*Ag及限量Ab进行竞争结合反应，得到以B或B%、F或F%、或R为纵坐标的剂量效应曲线 (也称标准曲线)，然后以未知样品测得的B或B%、F或F%、或R从曲线上查出相应的剂量。
二、试剂盒基本试剂试剂盒由国家批准的生产单位提供，提供RIA的主要试剂、操作方法、保存条件及保存期限。
使用者应按说明书的要求合理使用。
如果临床工作需要，使用者可以对试剂稀释度、操作步骤等进行适当修改，但应当对改变了的方案进行精密度、准确度、灵敏度等考核，并作详细记录。
核医学体外分析技术(68页).doc
核医学--体外分析技术
（四）分离方法的5个种类要熟记 分离的目的是放射免疫反应达到平衡 后，使抗原抗体复合物和游离抗体抗原分 开，分别测量其放射性。分离技术直接影 响分析结果的准确性，理想的分离技术应 具备既安全又迅速，不受其他因素干扰， 操作简便，重复性好等优点。
核医学--体外分析技术
1.双抗体法 是用抗原免疫动物产生相应的抗体作为第一 抗体，再以第一抗体为抗原免疫另一种动物，所 产生的抗体为第二抗体。第二抗体与第一抗体形 成的抗原抗体复合物结合后形成第二抗体复合物， 其分子量比第一抗体复合物大，可离心分离出来， 这种方法称为双抗体法（double antibody method）。 优点是：易分离、特异性强、使用方便。 不 足：易受其他因素干扰、成本高、操作时 间长。
核医学--体外分析技术
二、基 本 试 剂 放射免疫分析的反应中主要包括3种剂； 1、抗体（ Ab） 2、标记抗原（*Ag） 3、标准抗原（标准品）及试剂盒提 供分离试剂或材料，缓冲液及质量控制 （高、中、低值）用品等。
核医学--体外分析技术
(一) 抗体有3个条件必须满足 需要选择亲和力大、特异性强、滴度高的抗体。 1、抗原和抗体之间的结合能力和其牢固性称亲和力 （affinity），亲和力大者反应结合速度快，解离度小。 2、指抗体分别与相应抗原和抗原结构类似物结合能力 的比较，交叉反应越小，特异性（specificity）越强。 3、稀释倍数简称滴度，滴度（titer）越高，所需的抗 血清量越少，杂质干扰也越少。
90年代时间分辨技术 70年代酶(荧光)免疫技术 （EIA...FEIA）
50年代放免分析技术 （RIA）
（TRFIA）
核医学--体外分析技术
放射免疫分析技术（ra d ioimmunoassay,RIA）
第五章 体外分析技术
1968年Miles和Hales建立了免疫放射分析方法，利用标 记抗体作示踪剂，在反应系统中加入过量的抗体，故其 灵敏度比放射免疫分析法明显提高，而且标准曲线的测 量范围也明显扩大。
放射免疫分析
RADIOIMMUNOASSAY,RIA
Definition
是以抗原抗体的免疫反应 为基础，利用待测抗原与 定量的标记抗原同有限量 的特异性抗体竞争性结合， 以放射性测量为微量定量 手段，获得待测生物样品 中抗原浓度的技术。
Main methods
Ag + Ab + * Ag AgAb + Ag
*Ag + *AgAb
Main methods
放射性标记抗原与非标记抗原（包括标准抗原或待测抗原） 与有限量的特异性抗体发生可逆性竞争结合，形成抗原抗 体复合物。 反应体系中同时存在*Ag、Ag和Ab，而*Ag的量一定、Ab的 量固定，而且Ag+*Ag＞＞Ab时，随着Ag的增加，*AgAb的 量相应减少，即与Ag（包括标准抗原或待测抗原）的量呈 负相关。当反应达到平衡后，将反应体系中的标记抗原抗体复合物与游离的标记抗原分离，测定其放射性。以标 准抗原的浓度为横坐标，以标记抗原-抗体复合物的结合 率（B/T、B/F、或F/T）为纵坐标，绘制剂量反应曲线， 也称剂量效应曲线（calibration curve）。
Radiolabeled compounds
标记物
合适的核素标记（半衰期、射线类型、能量 等）,常用核素有125I和3H 标记物的用量要小，应等于或低于待测物的 最小量 足够的比活度 放化纯度高 免疫活性 稳定性好，贮存不易脱标
Specific binding reagent
体外分析
特异性(specificity)：不受交叉反应的程 度 亲和力 (affinity)：配体与抗体相互结合 的程度，用亲和力常数表示 滴度 (titer)：在 RIA 时，结合 50% 的标记 配体的抗体稀释度；IRMA分析要求较高滴 度（过量）
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分离技术
固相法：将抗体吸附在某种固体支持物 （球、管）上，如塑料、纤维素等材料 双抗法 Ag+Ab AgAb+Ab2 AgAbAb2 Ab2（第二抗体）：羊抗兔抗体，也称通用 抗体
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log-logit法
log-logit坐标系及线性回归法： 是目前公认比较好的拟合方法，它是以 结合率的logit值为纵坐标，以标准品浓 度的对数值为横坐标，制成散点图，然 后用最小二乘法对各散点进行直线回归， 得出回归方程，获得标准曲线，可用计 算机或计算器完成
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RIA原理
为了定量地测定待测样品中抗原的含量， 如在这个体系中加入放射性核素标记的 同类抗原，体系中同时存在两个平衡
Ag＋Ab ＋ Ag* Ag.Ab Ag*.Ab
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Ag＋Ab
------- Ag.Ab
＋ Ag* -------- Ag*.Ab
Ag*Ag* 和 Ab 的量保持恒定， Ag* 与 Ag 之和大 于 Ab 时，则 Ag*.Ab 复合物的形成受 Ag 含量 的制约，二者之间存在函数关系，即随着 Ag 浓度的增加， Ag*.Ab 复合物也减少，因
RIA分析误差
系统误差：向一个方向偏离，但可纠正 如标准品不标准、加样器不准等 随机误差：不可避免，但可控制在一定范 围 如加样、分离、放射性测量等
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F或B/F与Ag的量呈函数关系，利用这一函数关系求
出待测抗原的的浓度。
3
反应式
4
具体方法
用一系列浓度已知的标准抗原（浓度递 增的标准品）在严格相同的条件下与一定量
的*Ag和有限量的Ab共同反应，反应达到平
衡后，分离B与F，测定B的放射性做为纵坐 标，以每一反应管的标准品浓度为横坐标， 绘成标准曲线。根据被测抗原试管中的B的 CPM值在标准曲线上求出该抗原的浓度
2
一、基本原理
竞争性抑制 被测量的微量物质Ag（未标记抗原）
和标记有放射性核素的该种物质*Ag(标记抗原)对其抗 体Ab有相同的结合能力，反应时， Ag和 一定量的 *Ag竞争有限量的Ab。生成的*AgAb的量随Ag的增加
而减少，呈负相关关系。
反应达到平衡后，分离*AgAb （B）与*Ag（F），B、
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（二）误差的来源
1、系统误差：这种误差表现为检测结 果呈倾向性的偏高或偏低，常有一些可 以确定的因素导致，如：量器不准、试 剂不纯、标准品的定量不准、仪器状态 不佳、分离效果不好、不适当的曲线拟 合模型等等，系统误差是通过努力可以 消除的。 2、随机误差：这种误差多由难以确定 且无法控制的原因引起，误差的出现是 随机的，由各种偶然因素造成，符合正 态分布，如量取液体或分离时的误差。
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第一节 放射免疫分析法 radioimmunoassay， RIA
1959年，美国的两位科学家Berson和 Yalow首次将示踪技术的高度灵敏性和免 疫学抗原-抗体结合的高度特异性结合起 来，创立了放射免疫分析技术，开创了 生物活性物质微量测定技术的新时代。 RIA 的特点：灵敏度高、特异性强、准 确度高、稳定性好。经不断改进，现在 广泛应用于临床检测和科学研究的很多 领域。
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3）高滴度
滴度 是抗体实际应用时的稀释倍数 抗体的滴度越高，其中的干扰物质 的影响就越小。 滴度的测定：以一定浓度的*Ag与稀释 度不同的抗体进行反应，当*Ag的结合 率为50%时对应的抗体的稀释度即为 该抗体的滴度。这时的抗体浓度就是 实际使用时的浓度。
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（二）分离技术
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2、标记抗原
标记抗原是样品测量的基础 对标记抗原的要求是： 1）比活度和放射化学纯度必须足够 高——以保证分析的灵敏度 标记抗原的放化纯必须不小于95% 2）放射性核素的半衰期合适 3）标记抗原的生理活性未改变 4）标记抗原的应有较高的稳定性
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3、抗体
在放射免疫分析中，抗体质量的好 坏是影响放射免疫分析的关键因素 之一。 高质量的抗体必须具备三个条件： 高亲和力、高特异性、高滴度
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（三）实验室内部质量控制
实验室内部质量控制侧重对检测质量 的控制，它保证从收集样本开始到发 出报告为止的全过程中，能及时发现 检测过程中出现的各种误差，分析产 生的原因，找出纠正的办法，以确保 检测的质量。 常用以下指标对检测结果做可靠性评 价：精密度、准确度、特异性、灵敏 度、稳定性、有效性
二、基本方法
（一）基本试剂
放射免疫分析反应需要三种基本试剂： 1、标准品（非标记标准抗原） 2、标记抗原 3、抗体9Fra bibliotek1、标准品
标准品是样品定量的基础，它的 质和量的变化直接影响待测样品的测 定值。 对标准品的要求如下： 1）标准品和待测样品应属于同一种物质； 2）在与抗体反应时，标准品和待测样品 应有相同的活性和亲和能力； 3）高度纯化，不含有影响分析的杂质； 4）对标准品的定量一定要精确
1、logit-log模型 2、四参数logistic模型： 3、四参数质量作用定律模型 U={（A-D）/[1+（X/C）B]}+D 其中U为各试验管结合率（含NSB） A、B、C、 D分别为0剂量时的结合率， logit-log函数的斜 率，各点实际结合率下降一半时X的量，NSB。
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函数式
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标准曲线
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得到的标准曲线之所以是曲线而不是直线， 这是可逆反应的质量作用定律决定的。函 数式见上图 根据放射免疫分析法的基本原理，建立放 射免疫分析必须具备以下技术条件： 1、可靠的标准品 2、高比活度的标记品 3、高亲和力的抗体 4、合适的分离技术 5、理想的曲线拟合方式
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三、质量控制
Quality Control , QC
（一）定义：质量控制 就是控制误差， 即对分析工作中的误差进行经常性的 检查，遇有质量异常则及时采取对策， 以保证分析误差控制在可接受的范围 内。 放射免疫分析是一类高灵敏度的超微 量分析技术，极易受各种因素的影响 而使检测结果失真，因此必须有严格 的质量控制体系。
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1、精密度（precision）是指在相同条件 下对某一样品多次检测所得结果的符合 程度，即复管的重复性，它是最重要的 质量参数。 常用精密度图来评价实验室 内部的精密度水平。 2、准确度（accuracy）是指测定值与真 值的接近程度，用回收率来评价，回收 率是反应测定值偏差的质控指标。 3、灵敏度（sensitivity）是指检测能与 零剂量区分的最小检测量。 累计10次测定结果，计算出零标准 管的结合率为X—2SD时对应的剂量值， 即为灵敏度。
定义与分类
一、体外放射分析技术：在体外实验条件下，以 特异性结合反应为生物学基础，以结合反应动 力学规律为共同方法学基础，利用核射线对体 内的各种生物活性物质进行体外定量分析的各 种方法。 二、分类： 1、竞争性体外放射分析法（如RIA） 2、非竞争性体外放射分析法（如IRMA） 3、由体外放射分析技术派生出来的非放射性标记 免疫分析技术（酶、化学发光、时间分辨荧光 分析）
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1）高亲和力
只有高亲和力的抗体才能得到斜率 高的标准曲线，而斜率高的标准曲 线是高灵敏度和高精密度的必备条 件。亲和力测定方法最常用的是 Scatchard作图法（P36） KA值越大（即直线斜率越大）， 抗体的亲和力越大方法的灵敏度和 精密度越高
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2）高特异性
抗体必须与反应系统中抗原以外的 物质尤其是抗原类似物结合得少， 以免影响分析结果 抗体特异性的测定： 方法：测抗体的交叉反应率 交叉反应率越小，抗体的特异性越 高
1、聚乙二醇（PEG）沉淀法 2、双抗体沉淀法 3、双抗体+PEG法 4、葡萄球菌A蛋白（SPA）沉淀法 5、活性炭吸附法：葡聚糖包被的活性炭 6、微孔滤膜过滤法：玻璃或醋酸纤维滤膜 7、磁化分离技术：氧化铁-活性炭（-抗体） 8、固相分离技术： 1）第一抗体与试管联接 2）第二抗体与试管联接
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（三）数据处理