三种消化酶测定

三种消化酶测定

蛋白酶活力的测定

[目的与原理]

掌握蛋白酶活力的测定方法，测定鱼、虾、贝等水产动物主要消化器官肝胰脏、胃、肠等蛋白酶的活力。

动物消化器官内含有各种消化腺，这些消化腺分泌消化酶进行化学性消化作用，将机体摄入的大分子营养物质转变为可溶性小分子物质而吸收

进入血液循环。本实验采用福林—酚法测定机体内主要消化酶—蛋白酶活力。福林—酚试剂（Folinphenol）在碱性溶液中极不稳定，易被酚类化合物还原为蓝色化合物。蛋白质中含有酚基的氨基酸包括（酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸），用蛋白酶分解酪蛋白（底物），生成含酚基的氨基酸与福林－酚试剂成蓝色反应，可从蓝色的深浅测知酶活力多少。

[试剂与器材]

试剂：

1、福林试剂：在2000ml磨口回流装置内加入钨酸钠（Na2WO4·2 H2O）100g，钼酸钠

(Na2MoO4·2H2O)25g，水700ml，35％磷酸50ml，浓盐酸100ml，文火回流10小时，然后加人硫酸锂50g，水50ml和溴水数滴，摇匀，去除冷凝器，继续煮沸15分钟，以除去多余的溴。溶液呈金黄色，冷却后，定容至1000ml，过滤，滤液即福林试剂（试剂不应呈绿色，否则需重配）。置于棕色瓶中保存，使用时用氢氧化钠标定，稀释至1N。

2、0.55M碳酸钠溶液

3、10％三氯乙酸

4、0.02M pH7.5磷酸缓冲液：

0.02M 磷酸氢二钠溶液的配制：取

Na2HPO4·2H2O 3.561g (或

Na2HPO412H2O 7.164g)，溶解于1L蒸馏水中。0.02M 磷酸二氢钠溶液的配制：取NaH2PO4 H2O 2.76g (或NaH2PO4

2H2O 3.121g)，溶解于1L蒸馏水中。

将0.02M 磷酸氢二钠溶液84ml与0.02M 磷酸二氢钠溶液16ml混合，即为0.02M pH7.5磷酸缓冲液。

5、0.5％酪素：（酪蛋白）0.5克，以0.5N NaOH 1ml湿润。再加少量0.02MpH7.5磷酸缓冲液稀释。在热水浴中溶解，定容至

100ml，冰箱中可保存一周。

材料：

鲜活鱼、虾、贝的肝胰脏、胃、肠标本。

器材：

分光光度计、光径1.0cm比色杯、离心管、电子天平、离心机、匀浆器、剪子、镊子、冰块、试管若干、移液管若干。

[实验步骤]

1、酶粗提液的制备

取新鲜肝胰脏、胃、肠组织称重，在冰盘上剔除脂肪及内容物，以10倍缓冲液或去离子水匀浆各组织，将组织悬液低温下离心

（3000rpm/min）,上清液为酶粗提液（酶液）。

2、酶活力测定

（1）标准曲线的制作：精确称取烘干的酪氨酸50mg，加少量0.2N盐酸溶解，定容至

100ml，分别配制溶液0—100μg/ml不同浓度溶液，不同浓度各取酪氨酸溶液1ml，加0.5％酪素2ml，于370C 水浴中反应15分钟，然后加入三氯乙酸3ml，离心除去沉淀。取清液1ml，加入0.55M碳酸钠5ml，再加入福林试剂1ml，于370C水浴显色15分钟，在680nm波长下比色，测光密度（O D）。以光密度读数为纵坐标，酪氨酸的微克数为横坐标，绘制曲线。

（2）样品测定

样品测定设对照管和测定管。

对照管测定管

适当稀释酶溶液/ 1ml

去离子水1ml /

370C水浴预热3---5分钟

0.5酪素（预热过）2ml 2ml

370C水浴准确反应15分钟

10％三氯乙酸3ml 3ml

离心去除沉淀

取上清液于另外试管内1ml 1ml

0.55M碳酸钠5ml 5ml

福林试剂1ml 1ml

37℃水浴显色15分钟，680nm波长比色，以对照管校零，读取测定管光密度。

3、计算

在37℃下每分钟水解酪素产生1μg酪氨酸为一个酶活力单位

蛋白酶的活力单位＝A/15×F

A为样品测得光密度查曲线，得相应酪氨酸μg 数

F 为酶液最终稀释倍数，15为反应时间（min）[方法评估]

福林—酚法测定蛋白酶活力是生产实践和科学

研究中应用的基本实验方法。

[应用意义]

水产动物消化系统内的消化酶随动物种类而异，而且消化酶的种类和在消化道中分布的差别是

和动物食性相适应的。分析消化蛋白酶活力有助于了解动物对蛋白质食物的消化能力，掌握动物的营养需求。

[注意事项]

1、实验材料应新鲜，不新鲜会发生组织自溶和酶原被破坏。

2、酶液与底物作用时间、作用温度要严格控制，否则数据误差很大。

3、酶液要用适当缓冲液稀释到测定光密度在0.2—0.6之间。

淀粉酶活力的测定

[目的与原理]

掌握淀粉酶活力的测定方法，测定水产经济动物的主要消化器官肝胰脏、胃、肠内的淀粉酶活力。

淀粉酶催化淀粉分子中葡萄糖苷键水解，产生葡萄糖、麦芽糖等。在基质充分的条件下，反应后加入的碘液与未被水解的淀粉结合成蓝色复合物，其蓝色深浅与未经酶促反应的空白管比较其吸光度，从而推算出淀粉酶的活力单位。

[试剂与器材]

试剂：

1、0.04%可溶性淀粉

精确称取可溶性淀粉0.20g，置于20ml烧杯内，加入蒸馏水约5ml，摇匀使成淀粉混悬液，另称取无水磷酸二氢钠13.3g及苯甲酸4.3g，共置于500ml烧杯内，加入蒸馏水约250ml,煮沸后，将淀粉混悬液倒入此烧杯内，并用蒸馏水洗涤装淀粉混悬液的烧杯数次，洗涤亦倒入此烧杯内。继续煮沸1分钟，冷却至室温后倒入500ml容量瓶中，并用蒸馏水稀释至500ml 刻度。此淀粉液pH应为7.0±0.1，在室温下保存2―3个月。

2、0.1N碘贮存液：精确称取碘酸钾(KIO3)

3.567g及碘化钾（KI）45g置于1L容量瓶内，加入蒸馏水约800ml，然后缓慢加入浓盐