酵母细胞计数与大小测量

3.根据你的实验体会，说明血细胞计数板的误差主要来自于哪些方面？如何减少误差，力求准确？
答：血细胞计数的误差分别来源于技术误差和固有误差。其中由于操作人员采血不顺利，器材处理、使用不当，稀释不准确，细胞识别错误等因素所造成的误差属技术误差；而由于仪器（计数板、盖片、吸管等）不够准确与精密带来的误差称仪器误差，由于细胞分布不均匀等因素带来的细胞计数误差属于分布误差或计数域误差（filed error）。仪器误差和分布误差统称为固有误差或系统误差。技术误差和仪器误差可通过规范操作、提高熟练程度和校正仪器而避免或纠正，但细胞分布误差却难于彻底消除。减少误差可以通过：①避免技术误差，纠正仪器误差；②缩小计数域误差或分布误差；③排除异常标本的干扰。
6.5
7.2
6.4
7.5
7.6
6.4
7.5
6.8
数据的格数为目镜测微尺上对应的格数
长轴
7.8
8.5
8.8
8.3
9.2
8.4
8.3
7.8
9.3
8.5
短轴
5.7
6.3
7.2
6.6
7.4
6.2
6.3
5.8
7.6
6.3
酵母菌长轴平均值（um）= 8.53um
酵母菌短轴平均值（um）= 6.75um
3.酵母菌稀释液的计数
三、实验仪器、材料和用具
1.实验用具
载玻片、盖片、200uL移液器及tip、擦镜纸、 装有蒸馏水的洗瓶。
2.实验仪器
普通生物显微镜、目镜测微尺、镜台测微尺、血球计数板、手动计数器。
3.菌种
稀释20倍的酿酒酵母溶液。
四、实验操作步骤
1.稀释：
1.1200rpm,28℃, 24h,用YPD培养基稀释15~25倍。(助教统一完成)
答：在更换目镜或者物镜后，需要重新对焦，此时镜台距离目镜的距离发生了改变，则目镜测微尺的尺寸与镜台上尺寸存在的比例关系不再存在，必须进行重新标定，不然易产生实验误差。
2.不改变目镜和目镜测微尺，而改用不同放大倍数的物镜来测定同一菌体大小时，其测定结果是否相同？
答：测量结果应不同。不同的物镜对应着不同的微调焦距，当光路的路线发生变化时，原先存在的距离比例关系会变化，此时结果会不相同，只是差异较小。
1.2镜检计数室：
1.3在加样前，先对计数板的计数室进行镜检若有污物，则需清洗后才能进行计数。酒精棉球擦洗与擦镜纸擦洗后的效果如下图。
2.加样品：
2.1在清洁干燥的血球计数板上盖上盖玻片，再把吸取了稀释并振荡均匀的啤酒酵母菌液的细口滴管对准盖玻片边缘，轻挤滴头，让菌液沿缝隙靠毛细渗透作用自行进入计数室，让计数室刚好充满菌液。注意不可有气泡。
显微镜直接计数法是将小量待测样品的悬浮液置于一种特别的具有确定面积和容积的载玻片上（又称计菌器），于显微镜下直接计数的一种简便、快速、直观的方法。目前国内外常用的计菌器有：血球计数板、Peteroff-Hauser计菌器等。
显微计数法适用于各种含单细胞菌体的纯培养悬浮液，如酵母、细菌、霉菌孢子等。菌体较大的酵母菌或霉菌孢子可采用血球计数板。
1mL菌悬液中含有细胞数=五个中格总菌数(A)/5×25×104×稀释倍数(B)
微生物细胞的大小是微生物基本的形态特征，也是分类鉴定的依据之一。微生物大小测定需借助测微尺---目镜测微尺和镜台测微尺，两者配合使用。
镜台测微尺是一个在特制载玻片中央封固的标准刻尺，其尺度总长为1mm，精确分为10个大格，每个大格又分为10个小格，共100个小格，每个小格10μm。镜台测微尺并不直接用来测量细胞的大小，而是用于校正目镜测微尺每格地相对长度。
酵母细胞计数与大小测量
一、目的与要求
1.了解血球计数板的构造和使用方法，并掌握使用血球计数板进行微生物计数的方法。
2.学习用显微测微尺测量酵母细胞的大小，使大家对微生物大小有一种直观的认识。
3.观察酵母细胞形态特征,出芽繁殖。
二、实验原理
血球计数板是一块比普通载玻片厚得多的玻璃片，其上由四条平行槽构成的三个平台，中间的平台较宽，其中间又被一短槽隔成两半，每边平台上面各刻有一个方格网，即为此计数板的计数室。计数室的长宽各为1 mm，中间平台下陷0.1mm，故盖上盖玻片后计数室的容积为0.1mm3。计数室有两种规格。一种是16X25型，共有16个大格，每个大格又分为25个小格。另一种是25X16型，共有25个大格，每个大格又分成16个小格。应用血球计数板在显微镜下直接计数微生物细胞的数量，就是先测定若干个方格中的微生物细胞的数量。再换算成每ml菌液中微生物细胞数量。
4.假设酵母菌是标准的椭球体（ ，其中a和b为半短轴，c为半长轴），根据测量结果试计算出酵母菌溶液中酵母菌所占的体积分数（%）。
酵母菌所占的体积分数
5.用血球计数板进行酵母菌计数时，如何调节显微镜，使酵母菌和计数室同时清晰可见？
答：调节显微镜的聚光器至视野光线强度合适；尽可能使用低倍镜观察，放大倍数越小，景深越大；加镜油，增大景深；使用偏蓝的光线照射，提升显微镜的分辨率；压紧玻片，减小玻片与计数板之间的距离，以压迫酵母菌靠近计数板。
血球计数板计数板是一块特制的载玻片，其上有四条槽构成三个平台；中间较宽的平台又被一短横槽隔成两半，每一边的平台上各刻有一个方格网，每个方格网共分为九个大方格，中间的大方格即为计数室。计数室规格：①25（中格）×16（小格）；②16（中格）×25（小格）。每种规格计数室中的小方格都是400个。计数室大小：每一个大方格边长为1mm，盖上盖玻片后，盖玻片与载玻片之间的高度0.1mm，所以计数室的容积为0.1mm3。本次使用的25个中方格：
五、实验数据记录与分析
1.目镜测微尺标定结果（标定时要求取整数格）
物镜（100X）
160
16
1
镜台测微尺是将1mm等分为100格，故每一个为0.01mm，即10um。并且有：
2.酵母菌大小测定结果（测量时小数点后估计1位）
长轴
8.3
8.2
8.4
8.7
8.4
8.8
9.2
8.3
9.1
8.3
短轴
7.2
6.5
3.2聚焦后如果不能同时看清酵母细胞和计数室,可调整聚光器位置使酵母细胞和计数室同时能看清. (若视野不清晰,用擦镜液擦40x)
3.3显微镜计数(400x)：一般样品稀释度要求每中格内有l0～20个菌体为宜。计数时，如用16X25规格的计数板要按对角线方位，取左上，右上，左下，右下四个大格(共4个中格，l00个小格)内的细胞逐一进行计数：如果使用规格为25X16型的计数板，除了取左上，右上，左下，右下四个中格外，还需加数中央的一个中格(共5个大格，80个小格)内的细胞，计数时当遇到中格线上的酵母菌时，一般只计此中格的上方及右方线上的细胞， 而且只计胞体一半以上在线内的细胞.如遇酵母出芽，芽体大小达到母细胞的一半时，即作两个菌体计数。将各中格的细胞数填入表中，如果各中格的细胞数相差不大，表明酵母菌悬液较均匀，数据可以使用。
左上
左下
右上
右下
中
11
5
5
7
13
917
20
18.34
7
19
15
26
2
47
20
32
11
51
10
1517Βιβλιοθήκη 181613
9
14
16
13
30
14
21
17
21
26
20
15
12
14
18
19
20
13
27
19
16
18
18
17
25
19
19
38
29
六、实验讨论
1.为什么更换不同的放大倍数的目镜或者物镜时，必须用镜台测微器重新对目镜测微尺进行标定？
2.1每次吸液前都要振荡均匀！
3.显微镜计数：
3.1将血球计数板置于显微镜载物台上，先用低倍镜找到计数室所在位置，然后换成高倍镜(X40)观察，若酵母细胞只往某一方向流去，表明载物台没有水平，需调水平直到菌液不往某一方向流动为止，注意在显微镜下是“水往高处流”。静置1分钟后进行计数。在计数前若发现菌液太浓或太稀，需重新调节稀释度后再计数。
计数时预想效果图如下：
4.记录并计算数据
重复实验测量8组实验数据，取其平均值，按下列公式计算每ml菌液中所含的酵母菌细胞数。计算：16X 25型血球计数板的计算公式：
25X16型血球计数板的计算公式(√)：
5.清洗血球计数板：
使用完毕后，马上将血球计数板用洗瓶冲洗，可用棉花擦洗，切勿用硬试管刷洗刷，洗完后用蒸馏水冲洗一遍，斜置自行晾干或用滤纸沾干，最后用擦镜纸揩干净。
目镜测微尺是一块可放入接目镜内的圆形小玻片，其中央有精确的等分刻度，一般有等分为50小格和100小格两种。测量时，需将其放在接目镜中的隔板上，用以测量经显微镜放大后的细胞物像。由于不同显微镜或不同的目镜和物镜组合放大倍数不同，目镜测微尺每小格在不同条件下所代表的实际长度也不一样。
因此，用目镜测微尺测量微生物大小时，必须先用镜台测微尺进行校正，以求该显微镜在一定放大倍数的目镜和物镜下，目镜测微尺每小格所代表的相对长度。然后根据微生物细胞相当于目镜测微尺的格数，即可计算出细胞实际大小。