第七章凝胶层析

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（二）分配系数测定
• 分配系数
• 当测得某物质的Ve及Vt ，内水体积Vi及外 水体积V0时，算出Kd及Kav的值。
• Kd及Kav Ve被认为是一种组分对于某一个 凝胶柱的特征常数。
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（三）分辨率
• 凝胶层析中，两物质（A和B）和分 辨率（R）定义为： •
• 当R值＞1，两物质完全分开，小于 1时则不能完全分离。 • 分离时较大柱床体积可增大△Ve 。 • 减少（WA+WB）的方法是适当浓缩 样品、选用小粒度凝胶、流速适当 减慢等。
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操作压
层析柱由于进出口之 间液位压力差形成的 对凝胶颗粒的压力称 作“操作压”。
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层析床横截面所允许的最大压力
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三、凝胶层析操作
• （一）样品和加样 • 蛋白质类样品浓度:不 大于4%。
• 加样时应尽量减少样品 的稀释，及凝胶床面的 搅动。
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样品粘度对洗脱曲线的影响 柱：交联葡聚糖G-25，4×85cm； 流速180ml/h； 样品：0.1%血红蛋白+1.0%氯化钠 ； （1）相对粘度为0.118； （2）相对粘度为0.042； （3）相对粘度为0.010
第七章 凝胶层析 (Gel chromatography)
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凝胶层析(Gel chromatography)
• 分子筛层析、凝胶扩散层析、排阻层析、限 制扩散层析等。
• 是将样品混合物通过一定孔径的凝胶固定相， 由于各组分流经体积的差异，使不同分子量 的组分得以分离的层析方法。
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第一节 凝胶层析的基本原理
• 凝胶层析的分离过程是在装有 多孔物质填料的柱中进行的。 • 柱的总体积为VA，它包括填料 的骨架体积VGM ，填料的孔体 积Vi(内水体积)以及填料颗粒 之间的体积V0（外水体积）。 • VA=V1+V0+VGM
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4
原
理
• 当具有一定分子量分布的高聚 物溶液从柱中通过时，较小的 分子在柱中停留时间比大分子 停留的时间要长，于是样品各 组分即按分子大小顺序而分开， 最先淋出的是最大的分子。 • Ve=V0+Vi Kd • flash
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五、凝胶层析的扩展
• （一）上行凝胶层析 利用流动和重力方向相反的上行层 析法，即洗脱液向上流动的层析法。 • 反转柱 • （二）增加有效床高 -提高分辨率 • （1）串联层析 ：有效柱长 • （2）循环层析：即在同一根或两 根柱上，样品反复进行层析。
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循环层析
图7.21 人血浆蓝蛋白的循环层析分离 柱：交联葡聚糖凝胶G-100，3.2×93cm；样品：5.2ml （3%）；流速：20ml/h； 洗脱液：0.1mol/L pH8.0 Tris缓冲液（含0.5mol/L NaCl）
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五、多孔玻璃微球(Bio-glas)
• 特点：1、化学稳定性高、强度大。 • 2、对糖类、蛋白质等物质有吸附作用。 • 3、编号表示其孔径, 越大，分离分子量也越大。
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六、疏水性凝胶（hydrophobic gels）
• 聚甲基丙烯酸酯凝胶和聚苯乙烯凝胶。 • Styragel商品, 分离范围为1 600～40 000 000。 • 生物珠（Bio-Bead S），适于分离分子量较小的物 质。 • 分离不溶水的有机物质。
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常用的商品化凝胶介质
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一
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Hale Waihona Puke Baidu
第三节 凝胶层析的实验 条件和操作
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第三节 凝胶层析的实验条件和操作
• • • • 一、凝胶的选择和处理 二、凝胶层析柱的设计和制备 三、凝胶层析操作 四、主要参数测算
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一、凝胶的选择和处理
• （一）凝胶的选择 • (1).将分子量极为悬殊的两类物质分开，如 蛋白质与盐类，称作类分离或组分离。
• 1．重量法 • Vt=Vo+Vi+Vg =π /4· 2h d Vi=g· r W • Vo=Vt－（Vi+Vg） Vg估算为1cm3/g干胶。 • 2．过柱法 • 已知物质的洗脱体积 Ve=Vo+KdVi • 如用全渗入（Kd=1）或全排阻（Kd=0）的物质过柱， 测量其洗脱体积，计算该凝胶柱的V0值及Vi值。 • 常用蓝色葡聚糖（Kd=0）及重铬酸钾（Kd=1）。
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葡聚糖凝胶性能与编号的关系
编号
交联 吸液量 度
膨胀 速度
凝胶 孔径
分离限 凝胶 强度
大 （ Sephadex G－150 ）
小 （ Sephadex G－ 50 ）
小
大
慢
大
大
小
大
小
快
小
小
大
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葡聚糖凝胶（G类）的规格
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葡聚糖凝胶（G类）特点
• • • • 1、孔径。 2、稳定性。 3、吸附作用。 4、芳香族化合物和杂环化合物。
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三、聚丙烯酰胺凝胶
• 商品名为生物凝胶-P（Bio-Gel P）。 • 该凝胶由丙烯酰胺组成；以亚 甲基双丙烯酰胺为交联剂，聚 合而成。 • 特点： 1、孔径； 2、稳定性、强度； 3、无非特异吸附，保存方便； 4、编号反映出它的分离界限。
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聚丙烯酰胺凝胶的性质
• 生物凝胶的编号反映出它的分离界限。 • 如Bio-Gel P-100。
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凝胶柱床大小与所需凝胶量的关系
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（二）凝胶柱的装填
• 常用的支持物有棉花、玻璃纤维、玻 璃珠、垂熔玻璃等。 • 空柱中应留约1/5的水或溶剂. • 不断搅拌下使胶粒均匀沉降，使不发 生凝胶分层和胶面倾斜。
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（三）凝胶床的检查和维护
• 观察有无凝胶分层、沟流和气泡等现象。
• 有色物质溶液过柱，观察柱床有无沟流， 色带是否平整。 • 检查物质为蓝色葡聚糖。
方 法
• （1）直接将样品加到层析床表面。 • （2）样品比重高。
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（二）洗脱与收集
• 1、洗脱剂。 • 2、流速（操作压、型号、 粒度）。 • 3、分部收集器。
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（三）凝胶柱的再生
• 反冲。
• 重新装柱。
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四、主要参数测算
• V0及Vi的测算 • Kd及Kav的值 • 分辨率R
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（一）V0及Vi的测算
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（一）平衡排除理论
• 当溶质层流过一个填料颗料这段距离 时，溶质分子已多次进出于填料的孔， 达到平衡。 • 平衡条件只是在流速很慢时的一个极 端情况。
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（二）扩散分离理论
• 溶质分子在流经色谱 柱的过程中，在流动 相和固定相之间没有 达到平衡，存在着流 速依赖性。
聚苯乙烯和苯乙烯样品淋出曲线 的流速依赖性 1．流速为0.65ml/min； 2．流速为2.0ml/min溶剂为甲 苯
• 如用Sephadex G-200分离血清蛋 白质的效果要比Sephadex G-150 为好。
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（二）凝胶粒度的选择
• 细粒凝胶柱流速低，洗 脱峰窄，分辨率高，用 于精制分离或分析。
• 粗粒凝胶柱流速高，洗 脱峰平坦，分辨率低， 用于粗制分离，脱盐。
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（三）凝胶的预处理
• 使用前须溶涨，使干胶颗粒充分吸收溶剂， 并达到平衡。
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Sepharose CL的性质
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（三）超胶（Utro-gel ACA）
• 所谓超胶是琼脂糖与聚丙烯酰胺的混合凝胶。 • 商品名称后面的编号为两位数，各表示混合胶 中聚丙烯酰胺与琼脂糖的百分浓度。
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（四） Superose系凝胶
• 是由珠状琼脂糖经两次交联制得的可用 于HPLC的高速凝胶过滤介质。 • 有6%和12%两个规格。
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保 存
• 保存的方法有干法、湿法和半缩法三种。
• 湿法：加入一定量的防腐剂置于冰箱中作短期保 存（6个月以内）。 • 常用0.02%叠氮化钠、0.02%三氯叔丁醇、20%乙 醇等。 • 干法：用浓度逐渐升高的乙醇分步处理洗净的凝 胶，脱水收缩，抽滤，用60~80℃吹干。 • 半缩法：
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二、修饰葡聚糖凝胶 (Modified Sephadex)
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琼脂糖凝胶分离范围
琼脂糖凝胶有3个规格：Sepharose2B、4B、6B分 别表示琼脂糖浓度为2%，4%，6%。
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几种蛋白质Kav值
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（二）架桥琼脂糖凝胶（Sepharose CL）
• 架桥琼脂糖凝胶为琼 脂线性分子经1，3-二 溴丙醇交联的凝胶。
• 它的凝胶孔径均匀， 机械强度明显加大。 • 对热和化学物质的稳 定性大大增加,在 pH3~14范围内稳定。
• （ 一 ） 亲 脂 性 葡 聚 糖 凝 胶 （ Lipophilic Sephadex） • 骨架结构上引入一些有机基团，如甲基、羟 丙基，使呈亲脂性，同时保留亲水性。
• （二）交联葡聚糖离子交换剂（Sephadex – ion-exchanger） • 将活性交换基团连接于葡聚糖凝胶上制成的 各种交换剂。
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交联葡聚糖离子交换剂
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• （三）Supperdex系凝胶 • 由高交联度多孔琼脂糖与葡聚糖共价结合 而成。 • （四）Sephacryl系凝胶 • 是由烯丙烷基葡聚糖经甲叉双丙烯酰胺共 价交联制成的。 • 理化稳定性好，为硬性凝胶，可耐高压灭 菌。
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Supperdex系凝胶
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Sephacryl系凝胶
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分配系数Kd
• 排阻系数： • • 当Kd=1时，洗脱体积Ve=V0+Vi，为全渗入。 • 当Kd=0时，洗脱体积Ve=V0，为全排阻。 • 0＜Kd ＜1时，洗脱体积Ve=Vo+KdVi ，为部分渗入。
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物质的Kd值
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凝胶层析的特点
• （1）凝胶层析操作简便，所需设备简 单。 • （2）分离效果较好，重复性高。 • （3）分离条件缓和。 • （4）应用广泛。 • （5）分辨率不高，分离操作较慢。
• 干胶以10倍以上吸液量的溶剂浸泡。 • 热法溶涨(水浴)。
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二、凝胶层析柱的设计和制备
• （一）层析柱的选择 • 层析柱长度与直径的比值称作“柱比”。 • 对于类分离，柱床体积一般为样品溶液体积 的5倍，柱比5:1到10:1即可。
• 对于分级分离，则要求柱床体积大于样品体 积25倍以上，甚至多达100倍。柱比在25至 100之间。
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（三）流动分离理论
• 红细胞在毛血细管中流动 时比血浆流得快.
• 较大的分子较先通过或绕 过这个填料颗粒，使溶质 能按其大小进行分离。
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分离过程
• 三种不同分子量物 质的混合样品用某 种规格的凝胶柱进 行分离。 • 样品加入，以水或 其他溶液进行洗脱， 即得洗脱曲线 。
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分离过程
• 最先流出物质A，A分子量最大，完全不能 进入颗粒内部，只能从颗粒间隙流过， “全排阻”。其流经体积最小，等于外水体 积V0。
• (2).将分子量相差不大的大分子物质加以分 离，如分离血清球蛋白与白蛋白，这叫做 分级分离。
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1．类分离
• （1）使大分子的分配系数Kd=0； • （2）小分子的Kd=1。
• 选 用 Sephadex G-25 凝 胶 ， 分 离 范 围 1 000～5 000。
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2．分级分离
• （1）使各种物质的Kd值尽可能相 差大。 • （2）不使分子量分布在凝胶分离 范围的一侧。 • （3）分子量大于渗入限的3倍， 并小于排阻限的1/3。
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第二节 凝胶的结构和性质
• • • • • • 一、葡聚糖凝胶 (Sephadex) 二、修饰葡聚糖凝胶 (Modified Sephadex) 三、聚丙烯酰胺凝胶 （Bio-Gel P） 四、琼脂糖类凝胶 （Sepharose ） 五、多孔玻璃微球 (Bio-glas) 六、疏水性凝胶（hydrophobic gels）
• 最后流出物质C，它分子量最小，其分子可 以自由进出凝胶颗粒， “全渗入”。流经 体积是外水体积与内水体积之和V0+Vi。 • 物质B分子量介于渗入限与排阻限之间，其 分子能够部分地进入凝胶颗粒中。 “部分 排阻”或“部分渗入”。流径体积Ve是全部 外水体积加上内水体积的一部分，即 Ve=V0+KdVi
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一、葡聚糖凝胶 (Sephadex)
• 商品名为Sephadex G类 .
• 交联葡聚糖的基本骨架是葡 聚糖。 • 再经3-氯-1，2-环氧丙烷为 交联剂，形成三维网状结构 的高分子化合物。
• 其交联度是通过交联剂的加 量及反应条件来控制的。
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Sephadex G
• 编号意义： • 1、吸液量； • 2、溶涨时间； • 3、凝胶孔径； • 4、分离范围 • 蛋白质、多糖
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四、琼脂糖类凝胶
（Sepharose ）
• （一）琼脂糖凝胶
• 结构是由β-D-半乳糖与3，6-脱水-L-半乳糖 以α-1，3-和β-1，4-糖苷键相间连接而成的 链状分子。
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琼脂糖凝胶特点
• • • • • • 1、没有共价键的交联。 2、孔径 琼脂糖的浓度。 3、琼脂糖凝胶的化学稳定性较差。 4、非特异性吸附力低。 5、分离范围大。 6、颗粒强度差。