透明质酸制备的研究进展

吴明霞等： 透明质酸制备的研究进展
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支 链 的 直 链 多 聚 物 ， 其 中 每 个 二 糖 单 体 由 一 个 Ｎ— 乙 酰 氨 基 葡 萄 糖 （ Ｇｌｃ－Ｎａｃ） 以 β－１，３ 糖 苷 键 与 葡 萄 糖 醛 酸 （ ＧＩｃＡ） 交 替 连 接 而 成 ， 二 糖 单 位 间 以 β－１，４ 糖 苷 键 连 接 。透 明 质 酸 的 相 对 分 子 量 约 为 １０６～１０７， 分 子 中 含 有 ２００～１０ ０００ 个 双 糖 。 电 子 显 微 镜 下 观 察 证 实 ＨＡ 为 一 线 性 单 链 ， 分 子 量 为 ４×１０６， 链 长 约 为 １０μｍ。 由 于 直 链 链 轴 上 单 糖 之 间 氢 键 的 作 用 ， ＨＡ 分 子 在 空 间 呈 刚 性 的 螺 旋 柱 型 ， 其 半 径 为 ２００ｎｍ， 柱 内 侧 因 有 大 量 羟 基 而 产 生 强 亲 水 性 。 在 溶 液 中 ＨＡ 结 合 的 水 分 可 达 其 本 身 重 量 的 １０００ 倍 ， 且 这 些 水 在 螺 旋 柱 内 固 定 不 动 ， 不 易 流 失［５］。
２ 透明质酸的理化特性
ＨＡ 是 由 相 同 的 二 糖 单 体 重 复 排 列 而 形 成 的 无
收稿日期： ２００７－１１－０２ 基金项目： 四川省应用基础研究项目（ Ｎｏ．２００６Ｊ１３－ １６９） 作者简介： 吴明霞（ １９７９－） ， 女， 研究生， 研究方向： 微生物代谢调控
２００８ 年第 ２ 期
关键词：ຫໍສະໝຸດ Baidu透明质酸 制备 发酵 发展 诱变 优化 提取
Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｐｒ ｅｐａｒ ａｔｉｏｎ ｏｆ Ｈｙａｌｕｒ ｏｎｉｃ Ａｃｉｄ
Ｗｕ Ｍｉｎｇｘｉａ Ｄｅｎｇ Ｊｉｎｇ Ｗｕ Ｈｕａｃｈａｎｇ Ｃｈｅｎ Ｙｉｄｅ
（ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ，Ｓｉｃｈｕａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ ＆ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ， Ｚｉｇｏｎｇ ６４３０００）
Ａｂｓ ｔｒａ ｃｔ： Ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃ （ＨＡ） ｉｓ ａ ｈｕｇｅ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｗｈｉｃｈ ｉｓ ｗｉｄｅｌｙ ｒｅｇａｒｄｅｄ ａｓ ａ ｇｏｏｄ ａｇｅｎｔ ｔｏ ｐｒｅｓｅｒｖｅ ｍｏｉｓｔｕｒｅ ｗｈｉｃｈ ｕｓｅｄ ｉｎ ｖａｒｉｏｕｓ ｆｉｅｌｄｓ ｓｕｃｈ ａｓ ｏｐｈｔｈａｌｍｉｃ ｓｕｒｇｅｒｙ， ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｉｎｆｌａｍｅｄ ｋｎｅｅ ｊｏｉｎｔｓ， ｃｏｓｍｅｔｉｃ ｕｓｅｓ ｅｔｃ． Ｔｏｄａｙ， ｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌ ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃ ａｃｉｄ ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄ ｂｙ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｏｆ ａｎｉｍａｌ ｔｉｓｓｕｅｓ ｈａｓ ｂｅｇｕｎ ｔｏ ｔｕｒｎ ｔｏ ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｒｏｕｔｅ． Ｂｅｃａｕｓｅ ｏｆ ｓｕｆｆｉｃｉｅｎｔ ｓｏｕｒｃｅｓ， ｌｏｗ ｃｏｓｔ， ｈｉｇｈ ｏｕｔｐｕｔ， ｒｅｌａｔｉｖｅｌｙ ｈｉｇｈ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈ ａｎｄ ｅａｓｙ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ， ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃ ａｃｉｄ ｂｙ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｓｈｏｕｌｄ ｂｅ ｐａｉｄ ｍｏｒｅ ａｔｔｅｎｔｉｏｎ ａｎｄ ｓｔｕｄｉｅｄ ｆｕｒｔｈｅｒ． Ｔｈｅ ｐａｐｅｒ ｓｔａｔｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｓｔｕｄｙ ｏｎ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ， ｐｈｙｓｉｃａｌ ａｎｄ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｎａｔｕｒｅ， ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｏｆ ＨＡ ａｔ ｈｏｍｅ ａｎｄ ａｂｒｏａｄ， ａｎｄ ｉｔｓ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｔｒｅｎｄ ｗａｓ ａｌｓｏ ｆｏｒｅｃａｓｔｅｄ．
通 过 研 究 表 明 ， 在 生 物 体 内 ＨＡ 是 通 过 透 明 质 酸 合 成 酶 催 化 ＵＤＰ－Ｇ１ｃＡ 和 ＵＤＰ－Ｇ１ｃＮＡｃ 合 成 ［７］。 因 此 ， 近 年 有 学 者 尝 试 在 体 外 以 酶 法 合 成 ＨＡ， 并 取 得 一 些 进 展 。 小 林 四 郎 等［８］利 用 单 体 酶 催 化 在 体 外 聚合合成透明质酸， 首先使用多糖类聚合物合成透
Ｋｅ ｙ ｗｏｒｄｓ ： Ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃ ａｃｉｄ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ Ｏｐｔｉｍｕｍ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ
透 明 质 酸 （Ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃ Ａｃｉｄ ＨＡ）又 名 玻 璃 酸 ， 是 一种大分子酸性粘多糖， 广泛地存在于生物体的结 缔 组 织 中 ， 由 Ｍｅｙｅｒ 和 Ｐａｌｍｅｒ［１］于 １９３４ 年 首 先 从 牛 眼 玻 璃 体 中 分 离 出 来 。 ２０ 世 纪 ６０￣７０ 年 代 Ｂａｌａｚｓ 首 先 将 ＨＡ 用 于 眼 科 手 术 并 获 得 理 想 的 疗 效 后 ， 其 应 用 研 究 得 到 飞 速 的 发 展 。 ２０ 世 纪 ８０ 年 代 中 期 ＨＡ 被 应 用 于 化 妆 品 ， １９８７ 年 又 作 为 关 节 炎 治 疗 药 上市， 近年来作为药物载体和组织工程材料而广泛 应 用［２］。 随 着 其 在 化 妆 品 和 医 药 方 面 应 用 研 究 的 不 断 开 发 ， ＨＡ 必 将 作 为 一 种 新 的 重 要 生 化 药 物 ， 日 益 受到国内外的高度重视。
ＨＡ 水 溶 液 是 一 种 非 牛 顿 型 流 体 ， 有 着 良 好 的 粘弹性和应变性。一般来说， 溶液浓度和分子量的 增 加 会 使 溶 液 粘 度 增 加 。低 浓 度 的 ＨＡ 溶 液 主 要 表 现 为 粘 性 ， 而 高 浓 度 溶 液 则 主 要 显 示 其 弹 性［６］。
３ 透明质酸的制备方法 ３．１ 动物组织提取法
１ 透明质酸的分布及生理作用
ＨＡ 广 泛 存 在 于 动 物 的 各 种 组 织 间 质 中 ， 如 皮 肤 、脐 带 、眼 玻 璃 体 、鸡 冠 、关 节 滑 液 、软 骨 、卵 细 胞
和 血 管 壁 等 ， 其 中 以 人 脐 带 、鸡冠、关节滑液和玻璃 体含量较高。另外， 透明质酸也是链球菌 （ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ） 、绿脓杆菌（ Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ） 等 菌 株 荚 膜 的 主 要 成 份 。虽 然 不 同 来 源 获 得 的 ＨＡ 分 子量不同， 它们之间却无种属差异， 而且对人及动 物 无 抗 原 性［３］。
ＨＡ 的 生 理 作 用 随 着 其 所 在 组 织 的 不 同 而 变 化， 如在皮肤中主要表现为保水作用， 在关节滑液 中主要为润滑作用， 在血管壁中主要调节通透性。 ＨＡ 作 为 聚 阴 离 子 电 解 质 ， 由 于 分 子 上 所 带 的 大 量 负电荷可调节周围正负离子的浓度， 抑制多种酶的 活 性 ［４］。
明质酸氧氮杂环戊烯衍生物， 然后添加透明质酸分 解 酶 制 造 出 衍 生 物 和 酶 的 复 合 体 ， 接 着 在 ９０℃反 应 液中清除其中的酶合成透明质酸， 然后再对其进行 沉 淀 、分 离 即 可 得 到 透 明质酸精品。凌敏等［９］根据从 Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｅｑｕｉ 扩增出透明质酸合成酶（ ｓｑＨＡＳ） 基 因 ， 构 建 表 达 质 粒 ｐＳＥ－ｓｑＨＡＳ 并 转 化 大 肠 杆 菌 ＤＨＳａ， 诱导培养 后 在 细 胞 膜 中 检 测 到 ｓｑＨＡＳ 蛋 白 及 活 性 。 利 用 携 带 该 酶 的 细 胞 膜 以 ＵＤＰ－Ｇ１ｃＡ 和 ＵＤＰ－Ｇ１ｃＮＡｃ 为 底 物 在 体 外 合 成 了 分 子 量 为 ３．６ × １０６Ｄａ 的 ＨＡ， 分 别 是 发 酵 法 生 产 和 提 取 法 生 产 的 ＨＡ 的 分 子 量 的 ２．５ 倍 和 ５ 倍 左 右 。 但 是 ＨＡ 体 外 合成的前体物质价格昂贵， 难于应用于实际工业化 生 产 中 ， 因 此 这 种 方 法 仅 适 用 于 生 产 高 分 子 量 、高 纯 度 具 有 特 殊 用 途 的 ＨＡ。 ３．３ 微生物发酵法
国内目前有十几家透明质酸的生产厂家， 且这 些 企 业 大 都 是 用 动 物 组 织 提 取 法 。如 山 东 福 瑞 达 公 司 、山 东 东 营 东 辰 集 团 公 司 、上 海 聚 源 生 物 科 技 公 司 、广 州 申 强 化 工 有 限 公 司 、浙 江 瑞 邦 制 药 厂 、江 苏 无 锡 柯 兰 精 细 化 学 制 品 厂 、重 庆 团 结 生 化 制 品 有 限 公 司 、江 苏 吴 江 振 兴 生 物 制 品 厂 、杭 州 嘉 伟 生 物 制 品 有 限 公 司 等 。从 动 物 组 织 中 提 取 ＨＡ 常 用 的 原 料 有 鸡 冠 、脐 带 和 猪 皮 等 ， 主 要 工 艺 过 程 包 括 脱 水 、磨 碎 、浸 泡 、提 取 、除 杂 、沉 淀 和 分 离 。这 种 方 法 的 特 点 是工艺流程简单， 适用于原料来源分散的小规模生 产 。但 由 于 原 料 有 限 ， 且 原 料 中 ＨＡ 的 含 量 低 ， 同 时 ＨＡ 又 还 与 硫 酸 软 骨 素 等 粘 多 糖 共 存 于 生 物 组 织 中 ， 致 使 其 收 率 低 、提 纯 难 、成 本 过 高 、产 品 质 量 差 ， 且 难 以 应 用 于 大 规 模 生 产 。随 着 ＨＡ 需 求 量 的 不 断 增 大 ， 迫 切 要 求 生 产 大 量 的 高 质 量 ＨＡ， 动 物 组 织 提 取法己不能适应这种要求， 需要有新的方法来替代 它。 ３．２ 酶聚人工合成法
·综 述 与 专 论·
生物技术通报
ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ ＢＵＬＬＥＴＩＮ
２００８ 年第 ２ 期
透明质酸制备的研究进展
吴明霞 邓静 吴华昌 陈艺德
（ 四 川 理 工 学 院 生 物 工 程 系 ， 自 贡 ６４３０００）
摘 要： 透明质酸（Ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃ ａｃｉｄ 简称 ＨＡ）是一种国际上公认的生物大分子保湿剂，用于眼科显微手术、关 节炎 治疗、高级化妆品等领域。目前， 透明质酸的生产方法逐渐由动物组织提取法转向微生物发酵法。细菌发酵法生产透明质 酸具有产量不受原料资源限制、成本低、产量高、有较高的相对分子量， 分 离纯 化 工艺 简便 ， 易 于大 规模 生 产等 特点 成 为 透明质酸生产的发展方向， 应当进一步深入研究。综述了透明质酸的化学结构、理化性质、应用及生产方法等方面的研究 现状，并预测了其以后发展趋势。
利 用 细 菌 发 酵 法 生 产 ＨＡ 的 研 究 主 要 是 集 中 在 日 本 ， 英 美 等 国 也 有 少 量 报 道 。 ２０ 世 纪 ９０ 年 代 以 来 ， 对 由 细 菌 发 酵 法 生 产 ＨＡ 的 报 道 增 多 。 日 本 近 几 年 用 发 酵 法 生 产 了 ＨＡ 制 剂 ， 并 对 该 产 品 做 了 大 量 的 药 效 、毒 理 、药 代 动 力 学 等 非 临 床 实 验 和 临 床 实 验 。 结 果 表 明 ， 发 酵 法 生 产 的 ＨＡ 无 局 部 及 全 身 毒 副 作 用 、安 全 性 高 、疗 效 确 切 。 发 酵 法 生 产 的 ＨＡ 由 于 生 产 成 本 低 、相 对 分 子 量 高 、疗 效 好 ， 因 此 具有很好的应用前景。
１９３７ 年 ， Ｋｅｎｄａｌｌ［１０］等 首 次 发 现 链 球 菌 可 以 制 备 ＨＡ， 随 后 很 多 人 进 行 了 大 量 的 研 究 。研 究 结 果 证 明 某些种属链球菌在一定的环境条件下， 能同化吸收 葡 萄 糖 或 其 他 碳 源 ， 同 时 以 代 谢 物 形 式 产 生 ＨＡ。发 酵 法 生 产 ＨＡ 的 质 量 主 要 取 决 于 菌 种 、培 养 基 和 分 离提纯工艺。 ３．３．１ 透明质酸生产菌株的 选 育 野 生 型 的 链 球 菌 作 为 ＨＡ 产 生 菌 ， 首 先 要 经 过 诱 变 使 其 成 为 溶 血 素 和 透 明 质 酸 酶 缺 陷 型 菌 株 。链 球 菌 多 会 产 生 溶 血 素 （ Ｓｔｒｅｐｔｏｌｙｓｉｎ） ， 溶 血 素 有 溶 解 红 细 胞 、杀 死 白 细 胞 和 毒 害 心 脏 的 作 用 。 溶 血 素 混 入 成 品 ＨＡ， 还 会 使 ＨＡ 的 品 质 降 低 ， 不 能 用 于 医 药 品 和 化 妆 品 ， 所 以 规 模 生 产 必 须 获 得 非 溶 血 性 的 菌 株 。邓 开 野［１１］从 血 琼 脂平板上筛选出一株不具有溶血性的突变菌株， 其 性 能 比 原 始 菌 株 有 很 大 提 高 。野 生 型 的 产 生 ＨＡ 的 链球菌在产生透明质酸的同时产生透明质酸酶， 透