功能基因的克隆及生物信息学研究
牛HSL基因的克隆和生物信息学分析
牛HSL基因的克隆和生物信息学分析刘燕;李赞;田万年【摘要】旨在克隆牛HSL基因的CDS序列,并对该基因进行生物信息学、组织表达谱分析.根据GenBank登录的牛HSL基因序列(NM_001080220)设计1对引物,对牛组织样品中的HSL基因CDS序列进行RT-PCR扩增及序列测定;利用半定量RT-PCR方法检测HSL基因在牛各组织中的表达情况;利用生物信息学软件对其所编码的牛HSL蛋白进行分析.结果显示,获得的牛HSL基因CDS全长为2271 bp,编码756个氨基酸,与GenBank登录的牛HSL基因同源性最高,为99.9％.HSL蛋白含有一个HSL-N superfamily保守结构域,无信号肽结构,具有疏水性.半定量RT-PCR显示,HSL基因在检测的心脏、脾脏、肺脏、肾脏、肝脏、大网膜、皮下脂肪、肌肉8种组织中均有表达,其中在大网膜和皮下脂肪中表达量较高,在肾脏、脾脏、肝脏、肺脏、肌肉和心脏中度表达.该试验可为研究牛HSL蛋白的结构和功能提供参考.【期刊名称】《畜牧与饲料科学》【年(卷),期】2019(040)006【总页数】4页(P9-12)【关键词】克隆;分析;HSL基因;生物信息学;表达谱;牛【作者】刘燕;李赞;田万年【作者单位】辽宁禾丰牧业股份有限公司,辽宁沈阳 110164;吉林农业科技学院动物科技学院,吉林吉林 132101;吉林农业科技学院动物科技学院,吉林吉林 132101【正文语种】中文【中图分类】Q785;S823.2激素敏感脂酶（hormone sensitive lipase，HSL）是动物脂肪分解的重要酶之一，动物将体内的脂肪酸以甘油三酯的形式储存在脂肪细胞内，HSL能够把动物体内储存的脂肪进行分解，转变为游离脂肪酸和甘油来满足动物机体的需要，是影响机体脂肪代谢的关键酶和限速酶［1-2］。
目前有关猪的HSL 基因序列分析及表达研究研究报道较多［3-5］。
黄艳娜等［6］对陆川猪激素敏感性脂肪酶基因进行了克隆和序列分析。
青杨CCoA OMT基因的克隆及其生物信息学分析
青杨CCoA OMT基因的克隆及其生物信息学分析作者：刘红梅，胡尚连，卢学琴，等来源：《湖北农业科学》 2014年第11期刘红梅，胡尚连，卢学琴，曹颖，任鹏（西南科技大学生命科学与工程学院，四川绵阳６２１０１０）摘要：以一年生青杨（ＰｏｐｕｌｕｓｃａｔｈａｙａｎａＲｅｈｄ．）嫩茎为试材，利用ＲＴ－ＰＣＲ技术克隆青杨ＣＣｏＡＯＭＴ基因，并对其进行生物信息学分析。
结果表明，该基因ｃＤＮＡ序列全长为７４７ｂｐ，是一个编码２４８个氨基酸的多肽，蛋白分子量为２７．６７ｋＤ，等电点为５．１９，将该基因命名为ＰｃＣＣｏＡＯＭＴ，其编码的蛋白质为是亲水性蛋白质；氨基酸序列和结构分析表明，ＣＣｏＡＯＭＴ有一个保守区域；系统进化分析表明，ＰｃＣＣｏＡＯＭＴ与毛果杨的ＰｔＣＣｏＡＯＭＴ基因具有很高的同源性（８７％），该基因功能可能与青杨木质素的生物合成有关。
关键词：青杨（ＰｏｐｕｌｕｓｃａｔｈａｙａｎａＲｅｈｄ．）；ＣＣｏＡＯＭＴ基因；克隆；生物信息学中图分类号：Ｓ７９２．１１３；Ｑ７文献标识码：Ａ文章编号：0439－８114（２０14）11－2670-05ＣｌｏｎｉｎｇａｎｄＢｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉcs ＡｎａｌｙｓｉｓｏｆＣＣｏＡＯＭＴＧｅｎｅｉｎＰｏｐｕｌｕｓｃａｔｈａｙａｎａＲｅｈｄ．ＬＩＵＨｏｎｇ－ｍｅｉ，ＨＵＳｈａｎｇ－ｌｉａｎ，ＬＵＸｕｅ－ｑｉｎ，ＣＡＯＹｉｎｇ，ＲＥＮＰｅｎｇ（ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ＳｏｕｔｈｗｅｓｔＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｍｉａｎｙａｎｇ６２１０１０，Ｓｉｃｈｕａｎ，Ｃｈｉｎａ）Ａｂｓｔｒａｃｔ： RａｗＰｏｐｕｌｕｓｃａｔｈａｙａｎａＲｅｈｄ．ｓｐｅａｒ of oｎｅｙｅａｒｗａｓｕｓｅｄ to clone，ｔｈｅＣＣｏＡＯＭＴｇｅｎｅ with ＲＴ－ＰＣＲａｎｄｉｔｓｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓａｎａｌｙｓｉｓｗａｓｃａｒｒｉｅｄｏｕｔ．ＴｈｅｃＤＮＡｓｅｑｕｅｎｃｅｗａｓ７４７ｂｐｉｎｌｅｎｇｔｈ，ｅｎｃｏｄｉｎｇ２４８ａｍｉｎｏａｃｉｄｓ．ＴｈｅｍｏｌｅｃｕｌａｒｗｅｉｇｈｔｏｆｐｒｏｔｅｉｎｅｎｃｏｄｅｄｂｙｔｈｅＣＣｏＡＯＭＴｇｅｎｅｗａｓ２７．９４ｋＤ．ＩｔｓｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌＰＩｗａｓ５．１９．ＴｈｅＣＣｏＡＯＭＴｇｅｎｅｗａｓｎａｍｅｄ as ＰｃＣＣｏＡＯＭＴ．ＴｈｅｐｒｏｔｅｉｎｅｎｃｏｄｅｄｂｙｔｈｅＣＣｏＡＯＭＴｇｅｎｅｗａｓｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃｐｒｏｔｅｉｎ． Tｈｅ results of ａｍｉｎｏａｃｉｄｓｅｑｕｅｎｃｅａｎａｌｙｓｉｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅｐｒｏｔｅｉｎｅｎｃｏｄｉｎｇｂｙＰｃＣＣｏＡＯＭＴｃｏｎｔａｉｎｅｄｏｎｅｃｏｎｓｅｒｖｅｄｄｏｍａｉｎ．ＰｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃａｎａｌｙｓｉｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔＰｃＣＣｏＡＯＭＴｇｅｎｅ had 87% ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙｗｉｔｈｔｈｅｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇｇｅｎｅｓＰｔＣＣｏＡＯＭＴｉｎＰｏｐｕｌｕｓｔｒｉｃｈｏｃａｒｐａ．Ｉｔｍａｙｂｅ involued in ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ of ｐｏｐｌａｒｌｉｇｎｉｎ．Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ＰｏｐｕｌｕｓｃａｔｈａｙａｎａＲｅｈｄ．；ＣＣｏＡＯＭＴｇｅｎｅ；ｃｌｏｎｉｎｇ；ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ木质素是植物体中重要的大分子有机物质，仅次于纤维素，在植物抗击外来侵袭、抵御病害袭击、维持正常生长等方面发挥着重要作用［１］。
小麦淀粉合成酶SSⅡa基因克隆及生物学分析
小麦淀粉合成酶SSⅡa基因克隆及生物学分析小麦淀粉合成酶SSⅡa基因克隆及生物学分析引言淀粉合成酶（SS）在细胞能量、糖原代谢和细胞结构维持中发挥重要作用。
特别是对于大多数非细菌个体来说，淀粉合成酶是重要的植物淀粉合成途径的核心酶。
从大肠杆菌中分离到的淀粉合成酶SSⅡa随着近代的基因克隆技术的发展而得到广泛的研究。
研究目的基于此，本文旨在从小麦中克隆出将与SSⅡa有一定相似性的小麦淀粉合成酶（WSSⅡa）基因，并进行生物学分析，以研究它们在植物淀粉代谢中的作用。
材料与方法本研究采用M13单链DNA测序进行基因克隆，以获取编码WSSⅡa的cDNA文库亚克隆，并采用RT-PCR技术进行基因片段的扩增。
随后，基因克隆得到的细胞，采用SDS-PAGE蛋白质电泳，并用Western Blotting氨基酸序列测定定序分析，以验证新克隆的WSSⅡa蛋白质的结构功能性。
结果与讨论通过基因克隆，成功克隆出小麦淀粉合成酶（WSSⅡa）基因，并成功进行了生物学分析。
结果表明，WSSⅡa在小麦淀粉代谢中具有重要作用。
另外，该研究还为进一步研究胚向淀粉代谢中心基因（如WSSⅡa）的作用提供了有价值的参考信息。
结论本研究成功克隆出小麦淀粉合成酶SSⅡa基因，并进行了生物学分析，表明其在小麦淀粉代谢中具有重要作用。
本研究为研究淀粉代谢中心基因的作用提供了有用的信息。
未来研究方向研究表明，小麦淀粉合成酶WSSⅡa在小麦淀粉代谢中起着重要的作用，未来的研究将以该基因为基础，继续深入探索植物淀粉代谢机理。
例如，可以进一步分析WSSⅡa在淀粉生产和调节中的作用机制，并对其进行密码学分析，以更好地理解小麦淀粉代谢的分子机制。
此外，还可以利用基因工程技术，通过调节WSSⅡa的表达水平来改良植物淀粉代谢，从而提高作物的收获率和品质。
总结本文成功克隆出小麦淀粉合成酶SSⅡa基因，并进行了生物学分析，表明它在小麦淀粉代谢中具有重要作用。
未来的研究方向可以更深入地探索WSSⅡa在淀粉生产和调节中的作用机制，利用基因工程技术来改良植物淀粉代谢，提高作物收获率和品质。
白来航鸡STING基因克隆、生物信息学及组织表达特性分析
中国畜牧兽医 2024,51(4):1372-1381C h i n aA n i m a lH u s b a n d r y &V e t e r i n a r y Me d i c i n e 白来航鸡S T I N G 基因克隆㊁生物信息学及组织表达特性分析王艳,张 颖,赵雅妮,易 林,史 珍,周长明,周宛蓉,姜莉莉,樊兆斌(菏泽学院药学院,菏泽274015)摘 要:ʌ目的ɔ克隆白来航鸡干扰素基因刺激因子基因(s t i m u l a t o ro f i n t e r f e r o n g e n e s ,S T I N G )C D S 区序列并进行生物信息学和组织表达分析,为阐明S T I N G 基因在抗病毒免疫应答中的作用奠定基础㊂ʌ方法ɔ采用P C R 扩增并克隆白来航鸡S T I N G 基因C D S 区,测序后对其编码氨基酸序列进行相似性比对及系统进化树构建,利用生物信息学预测S T I N G 蛋白的理化特性及结构功能,并利用实时荧光定量P C R 技术检测S T I N G 基因在鸡心脏㊁肝脏等14个组织中的表达情况㊂ʌ结果ɔ白来航鸡S T I N G 基因C D S 区序列全长1140b p ,编码379个氨基酸㊂相似性比对和系统进化树分析结果表明,白来航鸡S T I N G 基因与原鸡的相似性最高(99.7%),亲缘关系最近,与冠小嘴乌鸦亲缘关系最远㊂S T I N G 蛋白为酸性㊁亲水性蛋白,分子质量为42.625k u ,等电点(pI )为6.67,不稳定系数为69.26,脂肪系数为105.01㊂该蛋白大部分在线粒体和内质网上合成,含有跨膜结构,不含信号肽㊂S T I N G 蛋白二级结构包括α-螺旋(54.62%)㊁延伸链(10.29%)㊁β-转角(3.43%)及无规则卷曲(31.66%)㊂蛋白互作分析表明,白来航鸡S T I N G 蛋白与N F K B 1㊁D D X 41㊁c G A S ㊁T B K 1等蛋白存在相互作用㊂实时荧光定量P C R 结果显示,S T I N G 基因在白来航鸡组织中广泛表达,其中在肺脏中表达量最高,且显著高于其他组织(P <0.05);在胸肌中表达量最低㊂ʌ结论ɔ本研究成功克隆了白来航鸡S T I N G 基因,其C D S 区序列全长1140b p ,编码379个氨基酸㊂白来航鸡S T I N G 蛋白为酸性㊁亲水性蛋白,含有跨膜结构㊂S T I N G 基因在白来航鸡肺脏中表达量最高㊂研究结果为深入探究白来航鸡S T I N G 基因编码蛋白功能提供了材料㊂关键词:白来航鸡;S T I N G 基因;克隆;生物信息学;表达中图分类号:S 831;Q 78文献标识码:AD o i :10.16431/j.c n k i .1671-7236.2024.04.005 开放科学(资源服务)标识码(O S I D ):收稿日期:2023-10-20基金项目:山东省自然科学基金项目(Z R 2019M C 036㊁Z R 2023Q C 302);菏泽学院大学生创新训练项目;菏泽学院新兽药工程重点实验室联系方式:王艳,E -m a i l :1722804585@q q .c o m ;张颖,E -m a i l :3082291255@q q.c o m ㊂王艳和张颖对本文具有同等贡献,并列为第一作者㊂通信作者姜莉莉,E -m a i l :l y j l l f x y l 024@163.c o m ;樊兆斌,E -m a i l :438321212@q q.c o m C l o n i n g ,B i o i n f o r m a t i c s a n dT i s s u eE x pr e s s i o nC h a r a c t e r i s t i c s o f S T I N G G e n e i n W h i t eL e gh o r nC h i c k e n s WA N G Y a n ,Z H A N G Y i n g ,Z H A O Y a n i ,Y IL i n ,S H I Z h e n ,Z H O U C h a n g m i n g,Z H O U W a n r o n g,J I A N GL i l i ,F A NZ h a o b i n (C o l l e g e o f P h a r m a c y ,H e z eU n i v e r s i t y ,H e z e 274015,C h i n a )A b s t r a c t :ʌO b j e c t i v e ɔI nt h i ss t u d y ,t h eC D Sr e g i o ns e qu e n c eo f s t i m u l a t o ro f i n t e r f e r o n g e n e s (S T I N G )g e n e i n W h i t eL e g h o r nc h i c k e n sw a s c l o n e da n da n a l y z e db y bi o i n f o r m a t i c s a n d t i s s u e e x p r e s s i o n ,w h i c h l a i da f o u n d a t i o nf o re l u c i d a t i n g th er o l eo f S T I N G g e n e i na n t i v i r a l i m m u n e r e s p o n s e .ʌM e t h o d ɔT h eC D S r e g i o n o f S T I N G g e n e i n W h i t eL e g h o r n c h i c k e n sw a s a m p l i f i e db y P C Ra n d c l o n e d .A f t e r s e q u e n c i n g ,t h es i m i l a r i t y o f t h ee n c o d e da m i n oa c i ds e qu e n c eo f S T I N G g e n ew a sc o m p a r e da n dt h e p h y l o g e n e t i ct r e e w a sc o n s t r u c t e d .T h e p h y s i c o c h e m i c a l p r o pe r t i e s a n d s t r u c t u r a lf u n c t i o no f S T I N G p r o t e i nw e r e p r e d i c t e db y b i o i n f o r m a t i c s ,a n d t h e e x pr e s s i o no f4期王艳等:白来航鸡S T I N G基因克隆㊁生物信息学及组织表达特性分析S T I N G g e n e i n14t i s s u e ss u c ha sh e a r t a n d l i v e ro f W h i t eL e g h o r nc h i c k e n sw e r ed e t e c t e db y R e a l-t i m e q u a n t i t a t i v eP C R.ʌR e s u l tɔT h e s e q u e n c eo f t h eC D Sr e g i o no f S T I N G g e n e i n W h i t e L e g h o r nc h i c k e n sw a s1140b p i n t o t a l l e n g t h,e n c o d i n g379a m i n o a c i d s.S i m i l a r i t y a l i g n m e n t a n d p h y l o g e n e t i c t r e e a n a l y s i s s h o w e d t h a t S T I N G g e n e i n W h i t eL e g h o r nc h i c k e n sh a d t h eh i g h e s t s i m i l a r i t y w i t h G a l l u s g a l l u s a n d t h e c l o s e s t g e n e t i cr e l a t i o n s h i p,a n d t h ef a r t h e s t g e n e t i c r e l a t i o n s h i p w i t h C o r v u s c o r n i xc o r n i x.S T I N G p r o t e i n i n W h i t eL e g h o r n c h i c k e n sw a s a n a c i d i c,h y d r o p h i l i c p r o t e i n w i t ha m o l e c u l a rw e i g h to f42.625k u,a n i s o e l e c t r i c p o i n t(p I)o f6.67,a ni n s t a b i l i t y c o e f f i c i e n t o f69.26,a n da f a t c o e f f i c i e n to f105.01.S T I N G p r o t e i n w a ss y n t h e s i z e d m o s t l y o nm i t o c h o n d r i a a n de n d o p l a s m i c r e t i c u l u m,c o n t a i n e da t r a n s m e m b r a n e s t r u c t u r e,a n dn o s i g n a l p e p t i d e.T h es e c o n d a r y s t r u c t u r e o fS T I N G p r o t e i ni n c l u d e d a l p h a h e l i x(54.62%), e x t e n d e dc h a i n(10.29%),b e t at u r n(3.43%)a n dr a n d o m c o i l(31.66%).P r o t e i ni n t e r a c t i o n a n a l y s i s s h o w e d t h a t t h e r ew e r e i n t e r a c t i o n sb e t w e e nS T I N Ga n dN F K B1,D D X41,c G A S,T B K1 a n do t h e r p r o t e i n s.T h er e s u l t so fR e a l-t i m e q u a n t i t a t i v eP C R s h o w e dt h a t S T I N G g e n e w a s w i d e l y e x p r e s s e d i n t h e t i s s u e s o fW h i t eL e g h o r o n c h i c k e n s,w i t h t h e h i g h e s t e x p r e s s i o n i n l u n g, w h i c hw a s s i g n i f i c a n t l y h i g h e r t h a n t h a t i no t h e r t i s s u e s(P<0.05),a n d t h e l o w e s t e x p r e s s i o n i n p e c t o r a l i s m u s c l e.ʌC o n c l u s i o nɔI nt h i ss t u d y,S T I N G g e n ei n W h i t e L e g h o r nc h i c k e n s w a s s u c c e s s f u l l y c l o n e d,t h e t o t a l l e n g t ho f t h eC D Sr e g i o nw a s1140b p,e n c o d i n g379a m i n oa c i d s. S T I N G p r o t e i n i n W h i t e L e g h o r n c h i c k e n s w a s a n a c i d i c,h y d r o p h i l i c p r o t e i n w i t h a t r a n s m e m b r a n e s t r u c t u r e.T h e r e w a st h eh i g h e s te x p r e s s i o no f S T I N G g e n ei nl u n g o f W h i t e L e g h o r o n c h i c k e n s.T h er e s u l t s p r o v i d e d m a t e r i a l s f o r t h e i n-d e p t hs t u d y o f t h e f u n c t i o no f t h e p r o t e i ne n c o d e db y S T I N G g e n e i n W h i t eL e g h o r nc h i c k e n s.K e y w o r d s:W h i t eL e g h o r n c h i c k e n s;S T I N G g e n e;c l o n i n g;b i o i n f o r m a t i c s;e x p r e s s i o n先天性免疫是机体抵御病原微生物的第一道防线㊂宿主编码模式识别受体(P R R s)对来自病原体核酸的识别启动了复杂的信号转导途径,最终产生Ⅰ型干扰素(I F N-Ⅰ)和促炎细胞因子,并激活机体的天然免疫反应[1]㊂环鸟腺苷酸合成酶(c G A S)作为D N A识别受体,能识别并结合胞质双链D N A(d s D N A)[2]㊂当胞质中存在异常d s D N A时,c G A S能催化合成第二信使2 ,3 -c G AM P(c G AM P),结合并有效激活干扰素基因刺激因子基因(s t i m u l a t o r o f i n t e r f e r o n g e n e s,S T I N G),随后S T I N G招募T A N K结合激酶(T B K1)和I K B 激酶(I K K)使其磷酸化,激活导致产生I F N-Ⅰ和干扰素调节因子3(I R F3)㊁核因子κB(N F-κB)等细胞因子的表达[3]㊂S T I N G的功能主要体现在c G A S-S T I N G-I F N 信号通路中㊂c G A S-S T I N G通路除了构成有效的防御组织损伤和病原体入侵的监测系统外,还在自噬㊁翻译㊁代谢稳态㊁细胞凝聚㊁D N A损伤修复㊁衰老和细胞死亡中发挥作用[4]㊂然而c G A S-S T I N G通路的异常或过度激活可导致原发性发病机制和多种自身免疫性疾病[5]㊂家禽马立克病病毒(M D V)和鸡新城疫病毒(N D V)均靶向S T I N G接头蛋白,从而阻碍c G A S-S T I N G通路介导抗病毒天然免疫的应答[6-7]㊂禽痘病毒(F W P V)可以刺激鸡巨噬细胞中的c G A S-S T I N G通路,上调I F N相关因子表达,使宿主有效防御F W P V感染;禽白血病病毒(A L V)通过其编码的P15蛋白抑制激活c G A S-S T I N G通路,从而有助于病毒复制和持续感染[8]㊂S T I N G在细胞因子诱导㊁自噬诱导㊁代谢调节和内质网应激等方面发挥重要功能[9],且在健康和疾病中发挥着至关重要的作用,广泛参与各种细胞过程㊂近年来,靶向S T I N G的激动剂成为国内外抗肿瘤药物研发的新热点,S T I N G激动剂在乳腺癌㊁结肠癌㊁肝癌㊁黑色素瘤及淋巴瘤等肿瘤模型中都展现出了强有力的抗肿瘤活性[10]㊂目前国内外对鸡S T I N G在抗病毒免疫中的研究鲜有报道㊂本研究以白来航鸡为研究对象,克隆S T I N G基因C D S 区,运用在线软件对该基因编码蛋白进行生物信息学分析,并采用实时荧光定量P C R技术检测S T I N G基因在白来航鸡不同组织中的表达特征,以期为深入探究S T I N G在抗病毒免疫应答中的作用提供参考依据㊂3731中 国 畜 牧 兽 医51卷1 材料与方法1.1 材料供试动物选取同一批次的3只3周龄健康的白来航鸡(菏泽市某养殖场)㊂颈部放血处理后,无菌采集每只白来航鸡的心脏㊁肝脏㊁脾脏㊁胰脏㊁肺脏㊁肾脏㊁脑㊁胆㊁腺胃㊁十二指肠㊁回肠㊁盲肠㊁直肠㊁胸肌共14个组织置于超低温备用㊂T r i z o l ㊁P r i m e S c r i p t T MR T R e a g e n t K i t w i t h gD N AE r a s e r ㊁D L 2000D N A M a r k e r ㊁限制性内切酶E c o R Ⅰ㊁H i n d Ⅲ均购自宝日医生物技术(北京)有限公司;S Y B R P r e m i x E x T a q T M (2ˑ)购自T a K a R a 公司;T 4D N A 连接酶㊁pE T -28a (+)载体㊁大肠杆菌D H 5α感受态细胞㊁T I A N p r e p Mi n i P l a s m i dK i t 均购自天根生化科技(北京)有限公司㊂1.2 方法1.2.1 引物设计及合成 根据G e n B a n k 中原鸡S T I N G 基因序列(登录号:K P 893157.1),使用P r i m e rP r e m i e r 5.0软件设计普通P C R (下划线处为E c o R Ⅰ和H i n d Ⅲ酶切位点)和实时荧光定量P C R 引物,以G A P DH 为内参基因,引物信息见表1㊂引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成㊂表1 引物序列信息T a b l e 1 P r i m e r s e q u e n c e i n f o r m a t i o n 基因G e n e s引物序列P r i m e r s e qu e n c e s (5'ң3')退火温度A n n e a l i n gt e m pe r a t u r e /ħ产物长度P r o d u c tl e n g t h /b p 用途A p p l i c a t i o n S T I N G F :C C G G A A T T C A T G C C C C A G G A C C C G T C A A C C 62.81140普通P C R R :C C C A A G C T T C T G G G C T C A G G G G C A G T C A C T S T I N G F :G C C C C A G G A C C C G T C A A C C A G 60.0114实时荧光定量P C R R :A G C A C C A C G A A G C A C A C A G C C AG A P DHF :G A C G T G C A G C A G G A A C A C T A 60.0122实时荧光定量P C RR :A T G G C C A C C A C T T G G A C T T T1.2.2 总R N A 提取及反转录 利用T r i z o l 法提取各组织总R N A ,溶于D N a s e /R N a s e -f r e ed d H 2O ,利用紫外分光光度计及琼脂糖凝胶电泳检测R N A 浓度及纯度,将R N A 反转录为c D N A ,―20ħ保存备用㊂1.2.3 S T I N G 基因C D S 区克隆及测序 以白来航鸡脾脏组织c D N A 为模板进行P C R 扩增㊂P C R 反应体系20μL :c D N A 模板0.5μL ,上㊁下游引物(10μm o l /L )各0.5μL ,P C R M a s t e r M i x10μL ,d d H 2O8.5μL ㊂P C R 反应程序:94ħ预变性5m i n ;94ħ变性30s ,62.8ħ退火30s ,72ħ延伸75s ,共35个循环;72ħ延伸7m i n ㊂P C R 产物用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测,取鉴定正确的扩增产物回收纯化后连接p E T -28a (+)载体,转化大肠杆菌D H 5α感受态细胞,均匀涂布于含卡那霉素的L B 固体培养基上,过夜培养14h 后筛选出圆滑白色单菌落并进行菌液P C R 鉴定,将挑选得到的阳性克隆菌液送生工生物工程(上海)股份有限公司测序㊂1.2.4 生物信息学分析 使用M e g A l i g n 软件将白来航鸡与G e n B a n k 数据中已公布的原鸡(G a l l u s ga l l u s ,登录号:N P _001292081.2)㊁盔珠鸡(N u m i d am e l e a g r i s ,登录号:X P _021265823.1)㊁火鸡(M e l e a g r i s g a l l o pa v o ,登录号:X P _010717095.1)㊁白尾雷鸟(L a g o pu s l e u c u r a ,登录号:X P _042749793.1)㊁日本鹌鹑(C o t u r n i x j a po n i c a ,登录号:X P _015731739.1)㊁凤头朱鹮(N i p po n i a n i p po n ,登录号:K F Q 92075.1)㊁冠小嘴乌鸦(C o r v u s c o r n i xc o r n i x ,登录号:X P _039415878.1)的S T I N G 基因氨基酸序列进行相似性比对,并利用M e ga 7.0软件构建系统进化树㊂利用P r o t P a r a m 在线软件(h t t ps :ʊw e b .e x p a s y .o r g /p r o t pa r a m /)分析S T I N G 蛋白理化性质;利用P r o t S c a l e 在线软件(h t t p s :ʊw eb .e x p a s y .o r g /pr o t s c a l e /)分析S T I N G 蛋白亲/疏水性;利用S i g n a l P4.1(h t t ps :ʊs e r v i c e s .h e a l t h t e c h .d t u .d k /s e r v i c e s /S i g n a l P -4.1/)㊁T MHMM (h t t ps :ʊs e r v i c e s .h e a l t h t e c h .d t u .d k /)在线软件分别预测S T I N G 蛋白信号肽与跨膜区;利用S M A R T (h t t p :ʊs m a r t .e m b l -h e i d e l b e r g .d e /s m a r t /b a t c h .p l )和P S P R TⅡ(h t t p :ʊp s o r t .h g c .j p/f o r m 2.h t m l )在线软件分别预测S T I N G 蛋白结构域和亚细胞定位;利用47314期王艳等:白来航鸡S T I N G基因克隆㊁生物信息学及组织表达特性分析N e t P h o s3.1在线软件(h t t p s:ʊs e r v i c e s.h e a l t h t e c h.d t u.d k/se r v i c e.p h p?N e t P h o s-3.1)预测S T I N G 蛋白磷酸位点;利用Y i n O Y a n g1.2(h t t p s:ʊs e r v i c e s.h e a l t h t e c h.d t u.d k/s e r v i c e s/Y i n O Y a n g-1.2/)和N e t N G l y c1.0(h t t p s:ʊs e r v i c e s.h e a l t h t e c h.d t u.d k/s e r v i c e s/N e t N G l y c-1.0/)分别预测S T I N G蛋O-糖基化和N-糖基化位点;通过P r a b i S O P MA(h t t p s:ʊn p s a.l y o n.i n s e r m.f r/c g i-b i n/s e c p r e d_s o p m a.p l)和S W I S S M O D E L(h t t p s:ʊs w i s s m o d e l.e x p a s y.o r g/i n t e r a c t i v e)在线软件分别预测S T I N G蛋白二级结构和三级结构;利用S T R I N G12.0在线软件(h t t p s:ʊv e r s i o n-12-0. s t r i n g-d b.o r g/)和C y t o s c a p e软件进行蛋白互作分析㊂1.2.5白来航鸡S T I N G基因组织表达特性检测以鸡14个组织c D N A为模板,利用实时荧光定量P C R检测S T I N G基因在白来航鸡各组织中的相对表达情况,以G A P DH作为内参基因㊂P C R 反应体系10μL:c D N A0.5μL,上㊁下游引物(10μm o l/L)各0.3μL,S Y B R P r e m i x E x T a q T M (2ˑ)5μL,d d H2O3.9μL㊂P C R反应程序:95ħ2m i n;95ħ15s,60ħ1m i n,共45个循环;熔解程序:95ħ15s,60ħ1m i n;95ħ15s㊂每个组织样品设3个重复,采用2―әәC t法计算相对表达量㊂1.3数据统计分析通过S P S S26.0软件中单因素方差分析对基因表达量进行显著性检测,采用L S D和邓肯式法进行多重比较,利用G r a p h P a dP r i s m8.0软件作图㊂结果用平均值ʃ标准差表示,P<0.05表示差异显著㊂2结果2.1白来航鸡S T I N G基因C D S区序列克隆1.0%琼脂糖凝胶电泳显示,在约1140b p附近出现清晰条带(图1),与预期条带大小符合㊂应用D N AMA N软件分析测序结果显示,本试验克隆的白来航鸡S T I N G基因C D S区片段长为1140b p,编码379个氨基酸,碱基组成分别为: A(17.54%)㊁G(30.35%)㊁T(18.16%)㊁C(33.95%), G C含量高于A T含量,说明白来航鸡S T I N G基因C D S区的D N A双链较稳定㊂M,D L2000D N A M a r k e r;1~3,S T I N G基因P C R扩增产物;4,阴性对照M,D L2000D N A M a r k e r;1-3,P C Ra m p l i f i c a t i o n p r o d u c t s o f S T I N G g e n e;4,N e g a t i v e c o n t r o l图1白来航鸡S T I N G基因P C R扩增结果电泳图F i g.1E l e c t r o p h o r e t i c m a p o fP C Ra m p l i f i c a t i o nr e s u l t so f S T I NG g e n e i n W h i t eL e i g h o r n c h i c k e n s2.2生物信息学分析2.2.1相似性比对及系统进化树构建相似性比对结果显示,白来航鸡S T I N G基因编码氨基酸序列与原鸡㊁灰胸竹鸡㊁环颈雉㊁盔珠鸡㊁火鸡㊁白尾雷鸟㊁日本鹌鹑㊁朱鹮和冠小嘴乌鸦的相似性分别为99.7%㊁93.7%㊁89.1%㊁87.3%㊁90.2%㊁87.3%㊁83.6%㊁63.9%和62.0%(图2)㊂采用M e g a7.0软件中M L法构建系统进化树,结果显示,白来航鸡与原鸡之间的亲缘关系最近,与灰胸竹鸡的亲缘关系次之,朱鹮和冠小嘴乌鸦形成另一个分支,与冠小嘴乌鸦亲缘关系最远(图3)㊂2.2.2理化特性分析白来航鸡S T I N G蛋白分子式为C1897H3032N530O541S22,分子质量为42.625k u,理论等电点(p I)为6.67,推测该蛋白为酸性蛋白㊂组成白来航鸡S T I N G蛋白的20种氨基酸中,L e u 所占比例最高(17.2%),而A s n和M e t含量最低(1.3%),其中带负电荷的氨基酸(A s p和G l u) 42个,带正电荷的氨基酸(A r g和L y s)40个㊂在哺乳动物网织红细胞内的半衰期为30h,脂肪系数为105.01㊂S T I N G蛋白的不稳定系数为69.26,高于阈值40,表明该蛋白不稳定㊂2.2.3亲/疏水性预测白来航鸡S T I N G蛋白在第34位氨基酸处分值最高(3.500),在第257位氨基酸处分值最低(―2.789)(图4),总平均亲水性G R A V Y为―0.041,即S T I N G为亲水性蛋白㊂5731中 国 畜 牧 兽 医51卷图2 不同物种S T I N G 基因氨基酸序列相似性比对F i g .2 S i m i l a r i t y a l i g n m e n t o f a m i n o a c i d s e q u e n c e o f S T I NG g e n e a m o n g d i f f e r e n t s pe c i es 图3 基于S T I N G 基因氨基酸序列构建的系统进化树F i g .3 P h y l o g e n e t i c t r e e b a s e do na m i n o a c i d s e qu e n c e o f S T I N G g e ne 图4 白来航鸡S T I N G 蛋白亲/疏水性预测F i g .4 H y d r o p h i l i c i t y a n dh y d r o p h o b i c i t yp r e d i c t i o no f S T I NG p r o t e i n i n W h i t eL e gh o r n c h i c k e n s 67314期王 艳等:白来航鸡S T I N G 基因克隆㊁生物信息学及组织表达特性分析2.2.4 信号肽及跨膜区预测 白来航鸡S T I N G 蛋白不含信号肽(图5),推测该蛋白不是分泌型蛋白;该蛋白含4个跨膜区,分别位于第27―42㊁57―73㊁101―112及124―141位氨基酸处(图6),属于跨膜蛋白㊂图5 白来航鸡S T I N G 蛋白信号肽预测F i g .5 S i g n a l p e p t i d e p r e d i c t i o no fS T I NG p r o t e i ni n W h i t e L e gh o r n c h i c k e ns 图6 白来航鸡S T I N G 蛋白跨膜区预测F i g .6 T r a n s m e m b r a n e r e g i o n p r e d i c t i o no f S T I NG p r o t e i n i n W h i t eL e gh o r n c h i c k e n s 2.2.5 结构域预测及亚细胞定位 预测结果显示,白来航鸡S T I N G 蛋白具有1个保守结构域T M E M 173,位于第50―342位氨基酸处㊂白来航鸡S T I N G 蛋白大部分在线粒体和内质网上合成,在细胞核中合成较多,在细胞质中合成最少㊂2.2.6 修饰位点预测 白来航鸡S T I N G 蛋白丝氨酸㊁酪氨酸㊁苏氨酸磷酸化位点分别有25㊁3及5个(图7);存在43个O -糖基化磷酸位点(图8),不存在N -糖基化磷酸位点㊂图7 白来航鸡S T I N G 蛋白磷酸化位点预测F i g .7 P h o s p h o r y l a t i o n s i t e p r e d i c t i o no f S T I NG p r o t e i n i n W h i t eL e gh o r n c h i c k e n s 2.2.7 二级结构及三级结构预测 白来航鸡S T I N G 蛋白二级结构包括α-螺旋(54.62%)㊁延伸链(10.29%)㊁β-转角(3.43%)㊁无规则卷曲(31.66%)(图9)㊂白来航鸡S T I N G 蛋白三级结构主要以α-螺旋为主(图10),与二级结构预测结果一致㊂2.2.8 蛋白互作分析 将白来航鸡S T I N G 蛋白序列导入S T R I N G12.0在线数据库,结果显示,该蛋白与N F K B 1㊁D D X 41㊁c G A S ㊁T B K 1等蛋白存在互作(图11)㊂7731中 国 畜 牧 兽 医51卷图8 白来航鸡S T I N G 蛋白O -糖基化位点预测F i g .8 O -g l y c o s y l a t i o n s i t e p r e d i c t i o no f S T I N G p r o t e i n i n W h i t eL e gh o r n c h i c k e ns h ,α-螺旋;e ,延伸链;t ,β-转角;c ,无规则卷曲h ,A l ph ah e l i x ;e ,E x t e n d e d c h a i n ;t ,B e t a t u r n ;c ,R a n d o mc o i l 图9 白来航鸡S T I N G 蛋白二级结构F i g .9 S e c o n d a r y s t r u c t u r e p r e d i c t i o no f S T I NG p r o t e i n i n W h i t eL e gh o r n c h i c k e ns 图10 白来航鸡S T I N G 蛋白三级结构F i g .10 T e r t i a r y s t r u c t u r e p r e d i c t i o no fS T I NG p r o t e i ni n W h i t eL e gh o r n c h i c k e ns 图11 白来航鸡S T I N G 蛋白互作分析F i g .11 P r o t e i ni n t e r a c t i o n a n a l y s i so fS T I NG p r o t e i ni n W h i t eL e gh o r n c h i c k e n s 87314期王 艳等:白来航鸡S T I N G 基因克隆㊁生物信息学及组织表达特性分析2.3 白来航鸡S T I N G 基因组织表达分析通过实时荧光定量P C R 检测S T I N G 基因在白来航鸡14个组织中的表达情况,结果显示,S T I N G 基因在白来航鸡肺脏中的表达量最高,且显著高于其他组织(P <0.05);在胸肌中的表达量最低(图12)㊂肩标不同字母表示差异显著(P <0.05);肩标相同字母表示差异不显著(P >0.05)V a l u e sw i t hd i f f e r e n t l e t t e r s u p e r s c r i p t sm e a n s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e (P <0.05);W h i l ew i t h t h e s a m e l e t t e r s u p e r s c r i p t sm e a n n o s i gn i f i c a n t d i f f e r e n c e (P >0.05)图12 S T I N G 基因在白来航鸡不同组织中的相对表达量F i g .12 T h e r e l a t i v e e x p r e s s i o no f S T I NG g e n e i nd i f f e r e n t t i s s u e s o fW h i t eL e gh o r n c h i c k e n s 3 讨 论S T I N G 是固有免疫系统I F N -Ⅰ信号通路中的一个重要接头蛋白,定位在内质网上,可激活T B K I ㊁I K K ㊁I R F 3及N F -κB 通路,强烈刺激I F N -Ⅰ和白介素等免疫炎症因子的产生[11]㊂I F N -β在S T I N G 通路中分泌量最高,它不仅能够消灭癌细胞,还能通过促使树突细胞成熟实现抗原递呈,从而将固有免疫应答与获得性免疫应答相联系[12]㊂S T I N G 基因缺失使小鼠胚胎成纤维细胞(S T I N G -/-M E F s)极易受到负链病毒感染,如水疱性口炎病毒(V S V )和1型单纯疱疹病毒(H S V -1)[13]㊂本研究成功克隆白来航鸡S T I N G 基因C D S 区序列,为后期研究禽类S T I N G 蛋白抗病毒作用机制提供基础数据㊂系统进化树显示,白来航鸡与原鸡亲缘关系最近,与冠小嘴乌鸦亲缘关系最远,表明该基因在不同物种间保守性具有一定差异㊂白来航鸡S T I N G 蛋白为酸性㊁亲水性蛋白㊂以上结果表明该基因在不同物种的发育进化过程中表现出了种内相似性和种间差异性㊂白来航鸡S T I N G 蛋白无信号肽,说明该蛋白不是分泌蛋白,结合蛋白的亚细胞定位推测其主要存在于细胞质或线粒体中㊂另外,白来航鸡S T I N G 蛋白具有4个跨膜结构域㊂在S T I N G 二聚体中,8个T M 螺旋被分成由T M 2和T M 4组成的中间层和由T M 1和T M 3组成的外围层,其中1个S T I N G 分子的T M 1和另1个分子的T M 2㊁T M 3和T M 4被堆积在一起,形成结构域包裹的结构,这种保守的结构特征对蛋白的稳定性和功能至关重要[14]㊂白来航鸡S T I N G 蛋白存在T M E M 173保守结构域,预测结果显示其可促进先天免疫信号传导,与刘健新等[15]对山羊S T I N G 蛋白结构域的预测结果一致㊂白来航鸡S T I N G 蛋白中含有43个O -糖基化磷酸位点,这些修饰位点可能影响S T I N G 蛋白的空间构象㊁合成㊁运输㊁定位等生物过程,不存在N -糖基化磷酸位点,从而对该蛋白的不稳定性产生影响㊂S T I N G 蛋白共有33个潜在磷酸化位点,该蛋白本身的磷酸化是下游信号转导所必需的,其中含有的2个保守的丝氨酸和苏氨酸位点是T B K 1的磷酸化靶点㊂另外,S T I N G 磷酸化有助于其从细胞质到高尔基体的适当易位,开启免疫反应,且还参与防止S T I N G 过度激活和维持体内平衡[16]㊂蛋白质棕榈酰化是一种功能强大且保守的翻译后修饰,脂肪酸链通过可逆的硫酯键与蛋白质的半胱氨酸残基连接[17]㊂在高尔基体中,S T I N G 的2个半胱氨酸残基(C ys 88和9731中国畜牧兽医51卷C y s91)被棕榈酰化,激活其下游信号通路,这是S T I N G激活所必需的翻译后修饰[18]㊂蛋白互作预测结果显示,S T I N G蛋白与N F K B1㊁D D X41㊁c G A S㊁T B K1等蛋白存在相互作用㊂S T I N G蛋白可与c G A S结合形成第二信使c G A M P,使得S T I N G招募并激活T B K1,进而诱导I F N-Ⅰ和其他调节因子[19]㊂研究表明,当树突状细胞在感染H S V-1或腺病毒后,D D X41与S T I N G直接相互作用介导T B K1㊁N F-κB和I R F3的激活[20]㊂推测S T I N G 通过与这些蛋白互作,从而参与免疫及抗病毒过程㊂通过对白来航鸡S T I N G基因的组织表达特性分析可知,S T I N G基因的分布具有组织特异性,其中在肺脏中表达量最高,而石树端等[21]研究发现鸭S T I N G基因在腺胃中表达水平最高,表明家禽中m R N A组织分布存在一定差异;其次是脾脏,提示S T I N G基因广泛分布于宿主的免疫器官;此外, S T I N G基因在回肠㊁十二指肠等肠道组织中也有表达,因为肠道中的微生物菌群是启动免疫的重要因子,肠道微生物与宿主的互作建立机体的适应性免疫系统,可有效维持免疫防御作用[22];在胸肌中表达量最低,与金洁[7]研究结果一致㊂研究表明, S T I N G基因表达量降低可以提示肝癌和胃癌患者的预后不良[23-24],而注射S T I N G激动剂可使人乳头瘤病毒相关肿瘤组织消退[25]㊂另外,通过抑制S T I N G通路可以阻断衰老细胞释放促炎信号,从而改善老年神经退行性疾病[26]㊂因此,抑制或激活S T I N G信号通路,可为疾病治疗提供新的途径和特异性治疗靶点[21]㊂本试验通过对白来航鸡S T I N G 基因编码蛋白进行生物信息学和组织表达特性分析,为揭示S T I N G基因在固有免疫系统中的作用提供数据,并为后期探究S T I N G编码蛋白的生物学功能提供切实的理论基础㊂4结论本研究成功克隆了白来航鸡S T I N G基因C D S 区序列,大小为1140b p,编码379个氨基酸㊂白来航鸡与原鸡的亲缘关系最近,与冠小嘴乌鸦亲缘关系最远㊂S T I N G蛋白属于酸性㊁亲水性蛋白,存在跨膜结构,无信号肽,主要在细胞质和线粒体中发挥作用㊂S T I N G基因在白来航鸡肺脏中表达量最高,在胸肌中表达最低㊂参考文献(R e f e r e n c e s):[1] G U O Y,J I A N GF,K O N G L,e t a l.O T U D5p r o m o t e si n n a t e a n t i v i r a l a n d a n t i t u m o r i m m u n i t y t h r o u g hd e u b i q u i t i n a t i n g a n ds t a b i l i z i n g S T I N G[J].C e l l u l a r&M o l e c u l a r I m m u n o l o g y,2021,18(8):1945-1955.[2]J I A N G M,C H E N P,W A N G L,e t a l.c G A S-S T I N G,a ni m p o r t a n t p a t h w a y i n c a n c e r i m m u n o t h e r a p y[J].J o u r n a lo f H e m a t o l o g y&O n c o l o g y,2020,13(1):81.[3] Z HA N G R,Q I N X,Y A N G Y,e t a l.S T I N G1i se s s e n t i a lf o ra n R N A-v i r u st r ig g e r e da u t o ph a g y[J].A u t o p h a g y,2022,18(4):816-828.[4] E R G U N S L,L IL.S t r u c t u r a l i n s i g h t si n t oS T I N Gs i g n a l i n g[J].T r e n d s i n C e l lB i o l o g y,2020,30(5):399-407.[5] Z H O UJ,Z HU A N GZ,L I J,e t a l.S i g n i f i c a n c eo f t h ec G A S-S T I N G p a t h w a y i n h e a l t h a nd d i se a s e[J].I n t e r n a t i o n a l J o u r n a lo f M o l e c u l a rS c i e n c e s,2023,24(17):13316.[6]刘永振.鸡马立克氏病病毒调控D N A受体信号通路逃避宿主天然免疫反应的分子机制[D].北京:中国农业科学院,2019.L I U Y Z.A v i a n M a r e k sd i s e a s ev i r u sm e d i a t e st h eD N A-s e n s i n gp a t h w a y t oe s c a p eh o s t i n n a t e i m m u n er e s p o n s e[D].B e i j i n g:C h i n e s e A c a d e m y o fA g r i c u l t u r a l S c i e n c e s,2019.(i nC h i n e s e)[7]金洁.鸡S T I N G基因的克隆㊁表达及其抗病毒功能的研究[D].雅安:四川农业大学,2017.J I N J.M o l e c u l a r c h a r a c t e r i z a t i o n,e x p r e s s i o n a n df u n c t i o n a la n a l y s i s o fc h i c k e n S T I N G[D].Y a a n:S i c h u a nA g r i c u l t u r a lU n i v e r s i t y,2017.(i nC h i n e s e) [8]何慧芬,张璐,秦爱建,等.c G A S-S T I N G信号通路在畜禽疾病中的研究进展[J].微生物学通报,2022,49(12):5331-5341.H E H F,Z HA N G L,Q I N AJ,e t a l.R o l eo f c G A S-S T I N G s i g n a l i n g p a t h w a y i nl i v e s t o c k a n d p o u l t r yd i se a s e s:A r e v i e w[J].M i c r o b i o l o g y C h i n a,2022,49(12):5331-5341.(i nC h i n e s e)[9] Z HA N GZ,Z H O U H,O U A N G X,e t a l.M u l t i f a c e t e df u n c t i o n so fS T I N G i n h u m a n h e a l t h a n d d i s e a s e:F r o m m o l e c u l a r m e c h a n i s mt ot a r g e t e ds t r a t e g y[J].S i g n a lT r a n s d u c t i o na n d T a r g e t e d T h e r a p y,2022,7(1):394.[10]李玺源.新型靶向S T I N G抗肿瘤药物的研发及机制研究[D].北京:中国科学院大学,2023.L I X Y.N o v e la n t i-t u m o r d r u g d e v e l o p m e n t a n dm e c h a n i s m s t u d y b y t a r g e t i n g S T I N G[D].B e i j i n g:U n i v e r s i t y o fC h i n e s eA c a d e m y o fS c i e n c e s,2023.(i nC h i n e s e)[11]曹艳杰,何怡宁,唐宁,等.三黄鸡S T I N G胞外区基因克隆及原核表达[J].南方农业学报,2016,08314期王艳等:白来航鸡S T I N G基因克隆㊁生物信息学及组织表达特性分析47(8):1401-1405.C A O Y J,H E Y N,T A N G N,e t a l.C l o n i n g a n dp r o k a r y o t i ce x p r e s s i o no fS a n h u a n g c h i c k e n S T I N Ge x t r a c e l l u l a rd o m a i n g e n e[J].J o u r n a lof S o u t h e r nA g r i c u l t u r e,2016,47(8):1401-1405.(i nC h i n e s e)[12] MO TWA N IM,P E S I R I D I SS,F I T Z G E R A L D K A.D N As e n s i n g b y t h e c G A S-S T I N G p a t h w a y i nh e a l t ha n d d i s e a s e[J].N a t u r e R e v i e w s G e n e t i c s,2019,20(11):657-674.[13]I S H I K A W A H,B A R B E R G N.S T I N G i s a ne n d o p l a s m i c r e t i c u l u m a d a p t o r t h a tf a c i l i t a t e s i n n a t ei m m u n e s i g n a l l i n g[J].N a t u r e,2008,455(7213):674-678.[14] S HA N G G,Z HA N G C,C H E N ZJ,e t a l.C r y o-E Ms t r u c t u r e s o f S T I N G r e v e a l i t s m e c h a n i s m o fa c t i v a t i o nb yc y c l i c GM P-AM P[J].N a t u r e,2019,567(7748):389-393.[15]刘健新,彭斐,黎振标,等.山羊S T I N G的克隆及其在O F T u细胞的表达[J].中国兽医学报,2018,38(5):1013-1018.L I UJX,P E N GF,L I ZB,e t a l.C l o n e a n d e x p r e s s i o no fs t i m u l a t o ro fi n t e r f e r o n g e n e so f g o a ti n O F T uc e l l s[J].C h i n e s e J o u r n a l o f V e t e r i n a r y S c i e n c e,2018,38(5):1013-1018.(i nC h i n e s e) [16] P A NJ,F E ICJ,HU Y,e t a l.C u r r e n tu n d e r s t a n d i n go ft h ec G A S-S T I N G s i g n a l i n g p a t h w a y:S t r u c t u r e,r e g u l a t o r y m e c h a n i s m s,a n d r e l a t e d d i s e a s e s[J].Z o o l o g i c a l R e s e a r c h,2023,44(1):183. [17] WA N G Y,L U H,F A N GC,e t a l.P a l m i t o y l a t i o na s as i g n a lf o r d e l i v e r y[J].A d v a n c e si n E x p e r i m e n t a lM e d i c i n e a n dB i o l o g y,2020,1248:399-424. [18]胡燕萍,许锦霞,徐阿慧,等.宿主c G A S-S T I N G信号通路调控机制的研究进展[J].中国预防兽医学报,2022,44(12):1344-1351.HU YP,X UJX,X U A H,e t a l.R e c e n t a d v a n c e s i nt h e r e g u l a t i o n m e c h a n i s m o f h o s t c G A S-S T I N Gs i g n a l i n gp a t h w a y[J].C h i n e s e J o u r n a l o f V e t e r i n a r yM e d i c i n e,2022,44(12):1344-1351.(i nC h i n e s e) [19] Z HA N GC,S HA N G G,G U IX,e t a l.S t r u c t u r a l b a s i so f S T I N G b i n d i n g w i t h a n d p h o s p h o r y l a t i o n b yT B K1[J].N a t u r e,2019,567(7748):394-398.[20] MA T ZK M,G U Z MA N R M,G O O D MA N A G.T h er o l eo fn u c l e i ca c i ds e n s i n g i nc o n t r o l l i n g m i c r o b i a la n da u t o i m m u n ed i s o r d e r s[J].I n t e r n a t i o n a lR e v i e wo f C e l l a n d M o l e c u l a rB i o l o g y,2019,345:35-136.[21]石树端,高全新,程玉强,等.S T I N G基因荧光定量检测方法的建立及其在鸭组织中的分布[J].畜牧与兽医,2017,49(7):69-73.S H I S D,G A O Q X,C H E N G Y Q,e t a l.E s t a b l i s h m e n t o f R e a l-t i m e P C R f o r d e t e c t i o n o fS T I N G g e n ea n di t st i s s u ed i s t r i b u t i o ni nd u c k[J].A n i m a lH u s b a n d r y&V e t e r i n a r y M e d i c i n e,2017,49(7):69-73.(i nC h i n e s e)[22]李淑珍,常文环,刘国华,等.肉鸡肠道微生物及其调控[J].动物营养学报,2020,32(7):2989-2996.L IS Z,C HA N G W H,L I U G H,e t a l.I n t e s t i n a lm i c r o b i o t ao fb r o i l e rc h i c k e n sa n di t sr e g u l a t i o n[J].C h i n e s e J o u r n a l o f A n i m a lN u t r i t i o n,2020,32(7):2989-2996.(i nC h i n e s e)[23] B U Y,L I UF,J I A Q A,e t a l.D e c r e a s e d e x p r e s s i o no fTM E M173p r e d i c t s p o o r p r o g n o s i si n p a t i e n t s w i t hh e p a t o c e l l u l a r c a r c i n o m a[J].P L o S O n e,2016,11(11):e0165681.[24] S O N G S,P E N G P,T A N G Z,e t a l.D e c r e a s e de x p r e s s i o n of S T I N G p r e d i c t s p o o r p r og n o s i s i np a t i e n t s w i t h g a s t r i cc a n c e r[J].S c i e n t i f i cR e p o r t s,2017,7:39858.[25]张展,刘朝晖.S T I N G信号通路在H P V相关恶性肿瘤中的作用[J].国际妇产科学杂志,2023,50(1):30-34.Z HA N G Z,L I U Z H.R o l e o f S T I N G s i g n a l i n gp a t h w a y i n H P V-r e l a t e d m a l i g n a n t t u m o r s[J].J o u r n a l o f I n t e r n a t i o n a lO b s t e t r i c s a n dG y n e c o l o g y,2023,50(1):30-34.(i nC h i n e s e)[26] G U L E N M F,S AM S O N N,K E L L E R A,e t a l.c G A S-S T I N G d r i v e s a g e i n g-r e l a t e d i n f l a m m a t i o n a n dn e u r o d e g e n e r a t i o n[J].N a t u r e,2023,620(7973):374-380.(责任编辑晋大鹏)1831。
简州大耳羊CKMT2基因克隆、生物信息学分析及时空表达研究
简州大耳羊CKMT2基因克隆、生物信息学分析及时空表达研究孙诗雨;李金岚;邢佳妮;董耀徽;李艳艳;王友利;林亚秋【期刊名称】《中国畜牧兽医》【年(卷),期】2024(51)6【摘要】【目的】克隆简州大耳羊肌节线粒体肌酸激酶2(creatine kinase mitochondrial 2,CKMT2)基因并探究其生物学特征,明确其在简州大耳羊不同组织以及不同分化阶段成肌细胞中的表达特性。
【方法】采集简州大耳羊心脏、肝脏、脾脏、肾脏、背最长肌、臂三头肌组织样品,利用PCR方法扩增简州大耳羊CKMT2基因并克隆测序,通过在线软件对其进行生物信息学分析。
利用实时荧光定量PCR技术检测CKMT2基因在简州大耳羊不同组织及不同分化阶段成肌细胞中的表达水平。
【结果】简州大耳羊CKMT2基因全长1 314 bp,其中包括CDS区1 259 bp,编码419个氨基酸,与绵羊和羚羊的亲缘关系最近。
CKMT2蛋白是一种无信号肽及跨膜结构域的碱性亲水稳定蛋白,主要定位于线粒体、过氧化物类酶体及细胞质,共包含32个磷酸化位点、1个N-糖基化位点以及4个O-糖基化位点。
蛋白二级结构主要包括α-螺旋(39.14%)、无规则卷曲(36.28%)、延伸链(16.23%)和β-转角(8.35%),三级结构与二级结构预测结果基本一致。
蛋白互作分析结果显示,CKMT2蛋白与半胱氨酸和甘氨酸富含蛋白3(cysteine and glycine-rich protein 3,CSRP3)、M型肌酸激酶(creatine kinase M-type, CKM)、磷酸甘油酸变位酶2(phosphoglycerate mutase 2,PGAM2)等蛋白存在相互作用。
组织表达谱结果显示,CKMT2基因在简州大耳羊心脏中表达量最高,显著高于其他组织(P<0.05);在背最长肌中表达量较高,显著高于脾脏和臂三头肌(P<0.05)。
时序表达谱结果显示,简州大耳羊CKMT2基因在成肌细胞诱导分化4 d时表达水平达到峰值,显著高于0、6 d(P<0.05)。
研究基因功能的实验方案
基因功能研究一般先用生物信息学分析对基因的结构和功能做预测，然后就要对我们的推测进行验证，如何验证一个基因的功能，目前最常用的基因功能研究策略为功能获得与功能失活。
1、功能获得策略是指将基因直接导入某一细胞或个体中，通过该基因在机体内的表达，观察细胞生物学行为或个体表型遗传性状的变化，从而鉴定基因的功能。
常用的功能获得的具体方法有基因过表达技术以及CRISPR-SAM技术等。
2、基因的过表达技术：基因过表达技术是指将目的基因构建到组成型启动子或组织特异性启动子的下游，通过载体转入某一特定细胞中，实现基因的表达量增加的目的，可以使用的载体类型有慢病毒载体，腺病毒载体，腺相关病毒载体等多种类型。
当基因表达产物超过正常水平时，观察该细胞的生物学行为变化，从而了解该基因的功能。
基因过表达技术可用于在体外研究目的基因在DNA、RNA和蛋白质水平上的变化以及对细胞增殖、细胞凋亡等生物学过程的影响。
可使用产品：过表达慢病毒、cDNA克隆（可用作ORF克隆）CRISPR-SAM技术：CRISPR-SAM系统由三部分组成：第一个部分是dCas9与VP64融合蛋白；第二个部分是含2个MS2 RNA adapter的sgRNA；第三个是MS2-P65-HSF1激活辅助蛋白。
CRISPR-SAM系统借助dCas9-sgRNA的识别能力，通过MS2与MS2 adapter的结合作用，将P65/HSF1/VP64等转录激活因子拉拢到目的基因的启动子区域，成为一种强效的选择性基因活化剂，从而达到增强基因表达的作用。
可使用产品：全基因Cas9 SAM-慢病毒文库2、功能获得两种方法的比较：基因的过表达技术与CRISPR-SAM技术都能达到基因表达的上调，但是由于基因的过表达技术使用的载体容量的限制，导致基因的过表达技术只能用于研究一定长度内的基因。
而CRISPR-SAM技术是通过增强目的基因启动子的转录而实现基因的过表达，可以不受基因大小的限制。
杨树UGT198基因的生物信息学分析、基因克隆及功能初探
杨树UGT198基因的生物信息学分析、基因克隆及功能初探杨改霞;王春雨;龙连香;王世杰;顾丽姣【期刊名称】《西南农业学报》【年(卷),期】2024(37)1【摘要】【目的】研究UGT198基因是否参与调控烟草抗虫性,为未来探索其参与调控杨树抗虫性奠定基础。
【方法】前期通过分析公共转录组数据发现PtrUGT198基因在杨树响应虫害的转录组中高调表达,对其进行生物信息学及进化分析。
以107杨为材料,克隆UGT198基因,构建过量表达载体,利用农杆菌介导法转化烟草获得过量表达转基因株系。
通过棉铃虫饲虫试验初步验证UGT198基因是否参与调控抗虫性,分析UGT198基因在调控抗虫性中发挥的功能。
【结果】PtrUGT198基因完整的ORF区为1440 bp,编码479个氨基酸,理论分子量为53.14 kDa,等电点为5.92,编码不稳定疏水性蛋白。
PtrUGT198蛋白的二级结构α⁃螺旋占41.75%,β⁃折叠占14.61%,β⁃转角占7.10%,无规卷曲占6.53%。
PtrUGT198蛋白不存在跨膜区,预测其不属于膜蛋白,为非分泌性蛋白,该蛋白的磷酸化修饰以丝氨酸为主。
同源序列对比结果显示PtrUGT198蛋白的C末端存在高度保守的植物次生产物糖基转移酶(Plant secondary product glycosyltransferase,PSPG)基序。
系统进化树分析发现,PtrUGT198蛋白与同属植物毛白杨、银白杨和胡杨亲缘关系最近,其次和模式植物烟草有较近的亲缘关系。
成功克隆杨树UGT198基因,构建pNC⁃UGT198基因过量表达载体,并转化烟草获得过量表达转基因株系,进行饲虫实验,得到高表达量烟草相对抗虫。
【结论】首次成功克隆了UGT198基因,并初步解析其调控抗虫性的功能,为深入了解UGT198基因调控杨树抗虫机理提供参考价值。
【总页数】9页(P14-22)【作者】杨改霞;王春雨;龙连香;王世杰;顾丽姣【作者单位】河北农业大学林学院/河北省林木种质资源与森林保护重点实验室【正文语种】中文【中图分类】S72【相关文献】1.小麦VP基因的克隆、生物信息学分析及功能初探2.杨树HSP90基因的克隆及生物信息学分析3.运用基因组和EST数据库进行电子克隆分离杨树功能基因的策略4.陆地棉GhUGT76C1基因克隆、生物信息学分析及功能初探因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
基因功能研究方法
3.2 反义RNA技术 反义RNA 技术是利用基因重组技术,构建人工表达载 体,使其离体或体内表达反义RNA ,反义RNA 能与靶mRN A形成较稳定的二聚体,从而抑制靶基因的表达。其作 用机理可能在DNA 复制、转录及翻译多水平上抑制靶 基因的表达。
23
3.3 核酶技术
核酶(Ribozyme) 技术是一类具催化活性的特殊RNA 分 子,通过碱基配对原则特异性灭活靶RNA 分子。可裂解 与其互补的mRNA及在DNA内插入DNA片段构成三链结构， 单个核酶分子可以结合多个mRNA 分子并使之在特定部 位断裂,而其本身具有较稳定的空间结构,不易受RNase 攻击,因而催化效率比反义RNA 高。常见的核酶有锤头 状、发夹状和斧头状三种,应用最多的是锤头状核酶。
5
芯片的制作
• 目前常用的基因芯片制作方法：
•
接触点样法、喷黑法、原位合成法。
• 接触点样法：是将样品直接点在基体上，其优点是仪器结 构简单、容易研制，是一种快速、经济、多功能的仪器， 可以在3.6cm2面积内点上10000个cDNA。不足之处是每个 样品都必须合成好、经过纯化、事先保存的。
6
• 喷黑法:是以定量供给的方式，通过压电晶体或其他推进 形式从很小的喷嘴内把生物样品喷射到玻璃载体上。同样 需要合成好的纯样品，包括cDNA、染色体DNA片段和抗体。 在1cm2面积上可喷射10000个点。
3
原理: 将成千上万条DNA片段(cDNA、表达序列标 签(expressed sequence tag ,EST) 或特异的寡核苷 酸片段) 按横行纵列方式有序点样在固相支持物上。 固相支持物为硝基纤维膜或尼龙膜时称为微阵列。固 相支持物改为指甲盖大小的玻片或硅片时所形成的微 阵列就称为DNA芯片。
新基因功能研究的策略和方法
文档仅供参考，如有不当之处，请联系改正。
利用转基因技术，则可将外源基因引入动物体 内，建立携带而且能够遗传给子代旳转基因动物 模型，经过对转基因动物旳表型分析研究外源基 因旳功能，目前已经利用转基因技术建立了数千 种转基因动物，而且还能够经过在携带外源基因 旳载体上加上组织特异性开启子等手段，从而控 制外源基因在特定旳时间或特定旳组织器官体现。 利用转基因动物来研究基因功能旳优势在于它是 一种在活体水平上旳多维旳研究体系，能够从分 子到个体水平进行多层次、多方位旳研究。
同步，因为人类全基因组测序已经完毕，所以与其完全同源基因组DNA
文档仅供参考，如有不当之处，请联系改正。
序列及其染色体定位信息，而无需进行荧光原位 杂交等基因染色体定位技术，进而还可经过分析 其内含子、外显子序列及其调整位点，推测其可 能旳基因体现调控方式。即经过此法拟定了富含 亮氨酸反复序列蛋白新基因旳基因组DNA序列及 其染色体定位。
文档仅供参考，如有不当之处，请联系改正。
文档仅供参考，如有不当之处，请联系改正。
此类技术中最常用旳主要为反义寡核苷酸 （ASON）、核酶和RNA干扰（RNAi）技术。
然而，涉及这3种技术在内旳该类技术均具有 诱导干扰素和其他细胞因子体现等非特异性效应， 另外，它们也会因为作用与和靶分子序列相近旳分 子而产生脱靶效应，其中，ASON因使用剂量大，其 非特异性效应最大；而RNAi旳这两种副效应最小。
用expay软件分析氨基酸序列同源性
文档仅供参考，如有不当之处，请联系改正。
主要是经过联网或数据库行蛋白质是基因功 能旳体现者和施行者，而蛋白质旳构造则是蛋白质 执行生物学功能旳基础，所以对新基因所编码蛋白 质旳功能域分析将对推测新基因功能提供极其有价 值旳信息。目前，已经有大量被发觉旳蕴藏于蛋白 质构造中旳与特定生物学活性有关旳所谓保守模体。
野蚕孵化酶基因的克隆与生物信息学分析
（ 录号 ： ６０６ ） 登 Ｊ ２３６ 。 Ｎ
Ｂ ａｄ Ｅ Ｏ Ｆ编码 ２ 个氨基酸残基 ， 白质的分 ｍ ｎＨ Ｒ ４ ９ 蛋
子质量（ 为 ３ ．７ｋ 等电点 （Ｉ 为 ５ ５ 。Ｎ端存在 ｍ） ３５ Ｄ， ｐ） ．５ ｌ ６个氨基酸的信号肽 ， 其切割位点位 于 Ａａ 与 Ｔ ｒ 间 ｌ ｈ。 。 （ ） 图３ 。第 ９ — ４ ２ ２２氨基酸残基间的序列是锌依赖金属 蛋 白酶功能域 ， 这与 Ａ ｔ ｉ ｆ ｙ功能域相似。在 １７ ｓ ｃ ￣ｌ ａｎ ａ ８
ｊ ｎ １０８ Ｃ ｉ ） ｉ ｇ ２ １ ， ｈｎ ａ ２ ａ Ａ ｓ ａｔ Ｂ ａｓｏ Ｔ—Ｐ Ｒ ｔ ｈ ｏ ｇ ， ｅｃ ｎｄａ８５ｂ ｉ ｌ ｇ ）ｈｔ ｉｇｅｚｍ Ｈ ）ｇｎ ｏ ｅｅ ｂ ｏｏ ｂｔ ｃ： ｙｍｅｎ ｆ ｒ Ｒ Ｃ ｃｎｌ ｅ ｏ ｗ ｌ ｅ ８ ｐ（ｎ ｅ ｔ ａ ｈｎ ｎｙ ｅ（ Ｅ ｅｅｆ ｍ ｔ ｍ ｒ ｆ ｙ ｏ ｎｈ ｃ ｒ ｈ ｙ Ｃ ｉ ｓ ｉ ｉ ｗ ｒ （ ｏ ｂｘｍ ｎａ／ａ ， ｎ ｉ ｇｎ ａ ｅｉｎｔ ｓ ｍ ｎＨ （ ｎ ａ ｋａｃｓｉ ： Ｎ ２ ３６ ． ｍ ｎ － ｈｎ ｅｗｌ ｓｋ ｏ ｅ ｄ ｌ ｍ Ｂ ｍ ｙ ａ ｄ ｒ ） ａｄｔ ｓ ｅｅｗ ｓ ｓ ａ ｄａ ａ ｄ Ｅ Ｇ Ｂ ｎ ｃｅｓ ｎ Ｊ ６０ ６ ） Ｂ ａ ｄ ｎ ｈ ｄ ｇ ｅ Ｂ ｅ ｏ
家蚕drk基因的克隆及生物信息学分析
的研究发现 ， 自身的 Ｓ 的结构域可与 Ｄ Ｋ蛋 白竞争结合 其 Ｈ Ｒ ＳｖＲ Ｋ区域 ， ｅ Ｔ 由于 Ｄ Ｋ与 ＳｖＲ Ｋ区域结合从而导致 细胞 Ｒ ｅ Ｔ 中游离的 Ｓ Ｃ ３ Ｅ增加 ， ０ ｓ６ 进而加大了 Ｓ Ｃ ３ Ｅ与 Ｓ Ａ ０ Ｓ６ Ｔ Ｔ的结 合概率 ， 进一步抑制 Ｊ Ｋ—Ｓ Ａ Ａ Ｔ Ｔ通路 。 ＪＫ ＳＡ Ａ ／ Ｔ Ｔ通路相关 蛋 白结构及基 本功能在 生物体 中具 保守性 ， 多个物种 的 Ｊ Ｋ ｓ Ａ Ａ ／ Ｔ Ｔ途径所 涉及 的相关基 因也得 到 了鉴定 。家蚕是鳞翅 目昆虫的模式种 ， 也是重 要的经济 昆 虫， 但对 Ｊ Ｋ Ｓ Ａ Ａ ／ Ｔ Ｔ途径中相关基 因的克 隆和鉴定 方面 的研
究 还 没 有 报 道 。为 了 探 讨 家 蚕 Ｊ Ｋ Ｓ Ａ Ａ ／ Ｔ Ｔ途 径 相 关 基 因 功 能， 比较 不 同物 种 Ｊ Ｋ Ｓ Ａ Ａ ／ Ｔ Ｔ途 径 的差 异 ， 研 究 在 电子 克 隆 本
模型 已建立 ， 体过程为 ： 总 胞外信号 与细胞表面受体 的结合 ，
导致与受体关联 的 Ｊ Ｋ Ａ ｓ激活 ， 后这 些激 酶 自我 磷酸 化 以 然 及磷酸化它们关联 的受体形成 Ｓ Ａ ｓ Ｓ ： ｓ ｏ ｏｏｙｒ— Ｔ Ｔ 的 Ｈ （ｒ ｈｍ ｌ ｃ ｇ ｅ ｇ ｎ一 ） ｉ ２ 结构域 的共位点 。通 常 ， ｏ 在形 成受￣ ／Ａ ｋＪ Ｋ复合物之 前 ，Ｔ Ｔ Ｓ Ａ ｓ以非活化的单体形式存在于细胞质 中， 一旦形成受 ￣／ Ａ ｋＪ Ｋ复合物 ，Ｔ Ｔ 分子 被磷 酸化形 成二 聚体 ， ＳＡｓ 这一 二 聚
白结合被 二 聚化 及酪 氨 酸磷 酸化 ， 与受 体 下游 激 酶 （ ｏ — ｄｗ ｎ
ｓ ｅｍ ｏ ｃｐｏ ｉａｅ ， Ｒ 蛋 白的 Ｓ ２域 结 合 后 激 活 ｔ ａ ｆｒ ｅｔｒｋｎｓｓ Ｄ Ｋ） ｒ ｅ Ｈ
小菜蛾p38MAPK基因的克隆与生物信息学分析
小菜蛾p38MAPK基因的克隆与生物信息学分析作者：胡霞谷希树刘晓琳等来源：《山东农业科学》2013年第08期摘要：小菜蛾（Plutella xylostella L）是一种危害十字花科植物的世界性害虫，研究其基因功能为寻找新的小菜蛾防治方法具有重要意义。
本研究克隆了小菜蛾p38 MAPK基因的开放阅读框（ORF），并根据其DNA序列推导出了蛋白一级结构，发现该基因编码一个含有349个氨基酸残基的蛋白。
通过SMART网站分析发现该蛋白在第20～304位氨基酸残基区域存在着一个典型的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶结构域，说明它是一个潜在的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶。
Blast比对发现Pxp38基因与家蚕Bmp38基因、酿酒酵母ScHOG1基因、人类Homo sapiensp38 基因在蛋白一级结构上的相似性分别是917%、516%和786%，说明p38 MAPK基因在进化上具有较高的保守性。
关键词：小菜蛾；p38基因；MAPK；丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶；生物信息学分析中图分类号：Q785：Q969.42+5.2 文献标识号：A 文章编号：1001-4942（2013）08-0015-04小菜蛾（Plutella xylostella L）属鳞翅目（Lepidoptera）菜蛾科（Plutellidae），其分布范围广，繁殖能力强，主要取食十字花科植物，严重危害蔬菜生产[1，2]。
由于小菜蛾的抗药性发展十分迅速，因此，寻找新的防治方法已经变得十分迫切[3，4]。
为了更好地实现小菜蛾的防治，需要更多地了解小菜蛾的基因尤其是耐药基因及响应外界刺激相关基因的生物学功能[5～。
2012年福建农林大学的尤民生教授等[7]领导的国际合作小组第一次完成了小菜蛾的全基因7]组序列图谱的绘制，这为小菜蛾基因功能的研究以及发展新的防治手段揭开了新的篇章，具有重要意义。
本研究就是在小菜蛾全基因组测序的基础上完成的。
蛋白质在细胞内发挥生物学功能经常需要磷酸化和去磷酸化修饰，细胞中具有磷酸化修饰功能的酶是蛋白激酶[8]。
功能性基因组学分析在生物学研究中的应用研究进展
功能性基因组学分析在生物学研究中的应用研究进展随着基因组测序技术的发展，我们已经成功完成了许多生物物种的基因组测序，包括人类、德国鸟、小鼠等等。
我们可以利用这些数据，分析其中每个基因的功能和相互关系，来揭示生物的内在机制和生命活动的规律，这就是功能性基因组学分析的范畴。
本文将围绕着这个主题，介绍其在生物学研究中的应用研究进展。
1. 重要的研究平台生物信息学软件与数据库是功能性基因组学分析的重要支撑平台。
如NCBI数据库是一个生物学信息公共资源，里面包含了多种类型的生物数据，例如基因组、转录组、蛋白质组、组蛋白修饰等。
此外，生物信息学软件也是生物学家进行分析、建模、预测和仿真的必要工具。
例如，生物学家可以运用RNAseq、ATACseq、CHIPseq等技术对各种样本进行分析，进而获得基因的表达、染色质修饰信息，以及基因座的甲基化水平等。
同时，还可以借助生物信息学软件对分析结果进行可视化和分享，便于生物学家更深层次的探索。
2. 功能性基因组学分析在疾病研究中的应用功能性基因组学分析在疾病研究中的应用是相当广泛的。
例如，基因突变可以导致肝癌等肿瘤的发生，如何找到和这些病因相关的基因变异呢？FuncPred (功能组)是一种在线生物信息学工具箱，它可以用于分析SNP的影响功能、蛋白质结构和致病性等。
此外，还可以运用“功能通路”和“基因本体”（Gene Ontology），将SNP功能注释成通路和功能项。
这些生物学知识在疾病的诊断、治疗和预防等方面都有着重要的应用。
3. 功能性基因组学分析在农业领域的应用除了在医学领域，功能性基因组学分析同样适用于农业领域。
例如，我们可以将模式生物Arabidopsis thaliana的基因组测序数据与已知的基因功能进行比较，从而找到的与农作物耐受性、适应性和抗挫折性等相关的基因家族。
此外，也可以使用关联分析将新测序物种和现有的基因组信息进行比对，从而发现和叶肢、营养元素吸收等相关的基因。
小麦ＴａＭＡＰＫ１_基因的克隆及其功能研究
麦类作物学报 ２０２３，４３（５）：５３７－５４４ＪｏｕｒｎａｌｏｆＴｒｉｔｉｃｅａｅＣｒｏｐｓｄｏｉ：１０．７６０６／ｊ．ｉｓｓｎ．１００９ １０４１．２０２３．０５．０１网络出版时间：２０２３ ０４ ２５网络出版地址：ｈｔｔｐｓ：／／ｋｎｓ．ｃｎｋｉ．ｎｅｔ／ｋｃｍｓ／ｄｅｔａｉｌ／６１．１３５９．Ｓ．２０２３０４２５．０９１６．００２．ｈｔｍｌ小麦犜犪犕犃犘犓１基因的克隆及其功能研究张潇予，吴保为，张思雨，马猛，刘香利，赵惠贤（西北农林科技大学生命科学学院，陕西杨凌７１２１００）摘 要：丝裂原活化蛋白激酶（ＭＡＰＫ）在植物生长发育与逆境应答过程中具有重要作用。
为探究小麦ＭＡＰＫ基因在植物生长发育中的作用，利用生物信息学分析其编码蛋白的序列和结构，发现该基因编码的蛋白含有一个保守的催化丝氨酸／苏氨酸磷酸化的激酶结构域，属于丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶。
系统进化分析结果表明，小麦ＭＡＰＫ基因与拟南芥ＭＡＰＫ１为直系同源基因，故将其命名为ＴａＭＡＰＫ１。
进一步通过转基因方法创建了以野生型拟南芥Ｃｏｌ ０为背景的ＴａＭＡＰＫ１过表达株系（ＴａＭＡＰＫ１ ＯＥ）和以拟南芥ＡｔＭＡＰＫ１基因功能缺失纯合突变体ｍａｐｋ１为遗传背景的ＴａＭＡＰＫ１回补系（ＴａＭＡＰＫ１ ｃｏｍ），并对其进行表型观察和产量性状调查，结果发现，突变体ｍａｐｋ１的抽薹时间比Ｃｏｌ ０提前２．８ｄ，ＴａＭＡＰＫ１ ｃｏｍ的抽薹时间与Ｃｏｌ ０无显著变化；与Ｃｏｌ ０相比，突变体ｍａｐｋ１的株高、总分枝数、种子大小、单株种子重量和单株生物量均显著提高，而ＴａＭＡＰＫ１ ｃｏｍ和ＴａＭＡＰＫ１ ＯＥ株系的种子大小、单株和种子重量和单株生物量均显著减少。
关键词：小麦；ＴａＭＡＰＫ１；抽薹时期；种子大小；单株种子重量中图分类号：Ｓ５１２．１；Ｓ３３０ 文献标识码：Ａ 文章编号：１００９ １０４１（２０２３）０５ ０５３７ ０８犆犾狅狀犻狀犵犪狀犱犉狌狀犮狋犻狅狀犪犾犃狀犪犾狔狊犻狊狅犳犠犺犲犪狋犜犪犕犃犘犓１犌犲狀犲犣犎犃犖犌犡犻犪狅狔狌，犠犝犅犪狅狑犲犻，犣犎犃犖犌犛犻狔狌，犕犃犕犲狀犵，犔犐犝犡犻犪狀犵犾犻，犣犎犃犗犎狌犻狓犻犪狀（ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ，ＮｏｒｔｈｗｅｓｔＡ＆ＦＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｙａｎｇｌｉｎｇ，Ｓｈａａｎｘｉ，７１２１００，Ｃｈｉｎａ）犃犫狊狋狉犪犮狋：ＭＡＰＫｓｐｌａｙａｎｉｍｐｏｒｔａｎｔｒｏｌｅｉｎｐｌａｎｔｇｒｏｗｔｈ，ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｎｄｓｔｒｅｓｓｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ．Ｉｎｏｒｄｅｒｔｏｅｘｐｌｏｒｅｔｈｅｒｏｌｅｏｆｗｈｅａｔ犕犃犘犓ｇｅｎｅｉｎｐｌａｎｔｇｒｏｗｔｈａｎｄｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，ｔｈｅｓｅｑｕｅｎｃｅａｎｄｓｔｒｕｃｔｕｒｅｏｆＭＡＰＫｗｅｒｅａｎａｌｙｚｅｄｕｓｉｎｇｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓｍｅｔｈｏｄｓ．ＴｈｅｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔａｌｌＭＡＰＫｐｒｏｔｅｉｎｓｃｏｎｔａｉｎａｃｏｎｓｅｒｖｅｄｋｉｎａｓｅｄｏｍａｉｎｃａｔａｌｙｚｉｎｇｔｈｅｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎｏｆｓｅｒｉｎｅ／ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ，ｂｅｌｏｎｇｅｄｔｏｓｅｒｉｎｅ／ｔｈｒｅｏｎｉｎｅｐｒｏｔｅｉｎｋｉｎａｓｅｓ．Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃａｎａｌｙｓｉｓｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｗｈｅａｔ犕犃犘犓ｇｅｎｅｓｗｅｒｅｏｒｔｈｏｌｏｇｏｕｓｔｏ犃狉犪犫犻犱狅狆狊犻狊ＭＡＰＫ１，ｄｅｓｉｇｎａｔｅｄａｓＴａＭＡＰＫ１．Ｉｎａｄｄｉｔｉｏｎ，ＴａＭＡＰＫ１ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓ ｓｉｏｎｌｉｎｅｓ（ＴａＭＡＰＫ１ ＯＥ）ｗｉｔｈｔｈｅｗｉｌｄ ｔｙｐｅ犃狉犪犫犻犱狅狆狊犻狊Ｃｏｌ ０ａｓｔｈｅｇｅｎｅｔｉｃｂａｃｋｇｒｏｕｎｄａｎｄＴａＭＡＰＫ１ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎｌｉｎｅｓ（ＴａＭＡＰＫ１ ｃｏｍ）ｗｉｔｈｔｈｅ犃狉犪犫犻犱狅狆狊犻狊ＡｔＭＡＰＫ１ｌｏｓｓ ｏｆ ｆｕｎｃｔｉｏｎｍｕｔａｎｔｍａｐｋ１ａｓｔｈｅｇｅｎｅｔｉｃｂａｃｋｇｒｏｕｎｄｗｅｒｅｃｒｅａｔｅｄｂｙｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｍｅｔｈｏｄｓ．Ｔｈｅｐｈｅｎｏｔｙｐｅｏｂｓｅｒｖａ ｔｉｏｎａｎｄｙｉｅｌｄｔｒａｉｔｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅｂｏｌｔｉｎｇｔｉｍｅｏｆｍａｐｋ１ｗａｓ２．８ｄａｙｓｅａｒｌｉｅｒｔｈａｎｔｈａｔｏｆＣｏｌ ０，ａｎｄｔｈｅｂｏｌｔｉｎｇｔｉｍｅｏｆＴａＭＡＰＫ１ ｃｏｍｈａｓｎｏｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｃｈａｎｇｅ，ｃｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈｔｈａｔｏｆＣｏｌ ０．ＣｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈＣｏｌ ０，ｐｌａｎｔｈｅｉｇｈｔ，ｂｒａｎｃｈｅｓｐｅｒｐｌａｎｔ，ｓｅｅｄｓｉｚｅ，ｓｅｅｄｗｅｉｇｈｔ，ａｎｄｂｉ ｏｍａｓｓｐｅｒｐｌａｎｔｗｅｒｅｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｉｎｃｒｅａｓｅｄｆｏｒｍａｐｋ１，ｗｈｉｌｅｔｈｅｓｅｅｄｓｉｚｅ，ｓｅｅｄｗｅｉｇｈｔａｎｄｂｉｏｍａｓｓｐｅｒｐｌａｎｔｏｆｔｈｅＴａＭＡＰＫ１ ｃｏｍａｎｄＴａＭＡＰＫ１ ＯＥｌｉｎｅｓｗｅｒｅｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｒｅｄｕｃｅｄｂｙｄｉｆｆｅｒｅｎｔｄｅ ｇｒｅｅｓ．犓犲狔狑狅狉犱狊：Ｗｈｅａｔ；ＴａＭＡＰＫ１；Ｂｏｌｔｉｎｇｔｉｍｅ；Ｓｅｅｄｓｉｚｅ；Ｓｅｅｄｗｅｉｇｈｔｐｅｒｐｌａｎｔ收稿日期：２０２２ ０４ ０８ 修改日期：２０２２ ０６ ２０基金项目：国家自然科学基金项目（３２０７２００３）；陕西省重点研发专项（２０２１ＮＹ ０７９）第一作者Ｅ ｍａｉｌ：Ｘｉａｏｙｕｚｈａｎｇ０５２＠１６３．ｃｏｍ通讯作者：赵惠贤（Ｅ ｍａｉｌ：ｈｘｚｈａｏ２１２＠１６３．ｃｏｍ）Copyright©博看网. All Rights Reserved. 丝裂原活化蛋白激酶（ｍｉｔｏｇｅｎ ａｃｔｉｖａｔｅｄｐｒｏｔｅｉｎｋｉｎａｓｅ，ＭＡＰＫ）是真核生物中普遍存在的一类保守丝氨酸／苏氨酸类蛋白激酶。
功能基因组学的研究方法和应用
功能基因组学的研究方法和应用功能基因组学是一个集成了基因组学、生物信息学和生物学的学科，研究的目的是解析基因组的结构和功能，从而了解生物体内各种生物过程的分子机制。
在生命科学领域，功能基因组学的研究已成为一项前沿的研究热点，得到了广泛的关注和重视。
本文将从以下几个方面来介绍功能基因组学的研究方法及其应用。
一、研究方法1. 基因组数据分析在功能基因组学研究中，重要的一步就是基因组数据分析。
基因组数据包括基因序列、蛋白质编码序列、基因表达和突变等信息，通过对这些数据进行分析，可以识别出关键的基因和生物过程，从而深入了解生物体内的分子机制。
2. 蛋白质相互作用网络分析蛋白质相互作用网络是指蛋白质之间的相互作用关系图，是功能基因组研究中一个重要的工具。
通过分析蛋白质相互作用网络，可以识别出关键的调节因子和信号通路，帮助我们了解生物体内各种生物过程的分子机制。
3. 组学方法组学是一种研究体内分子水平的学科，如基因组学、转录组学、蛋白质组学和代谢组学等。
在功能基因组学的研究中，组学方法可以帮助我们了解生物体内各个层级的分子机制，便于我们深入研究生物体内各种生物过程的分子机制。
二、应用1. 新药研发功能基因组学研究为新药研发提供了先进的技术手段。
通过基因组数据分析和突变筛选等技术，可以识别出潜在的新药靶点和药物作用通路，为新药的开发提供了重要的基础数据。
2. 个体化医疗功能基因组学研究可用于实现个体化医疗目标。
通过对个体基因组数据的个性化分析，可以为医生提供有针对性的治疗方案。
例如，对于某些癌症病人，个性化药物治疗可能是更有效的治疗方式。
3. 基因检测功能基因组学研究为基因检测提供了一种高效、灵敏的方法。
基因检测可以在早期诊断疾病，提供有效的治疗和预防措施。
例如，基因检测可以在癌症早期发现病变，为患者提供早期治疗，大大提高治疗效果和生存率。
结论在现代医学和生命科学领域，功能基因组学的研究将带来更多的重要发现。
生物信息学序列分析利用生物信息学进行功能基因电子隆技术
在对目的基因进行克隆时所采取的策略十分重要， 其途径大致分为： 正向遗传学途径 反向遗传学途径 电子克隆(in silicon cloning)——一种全新的方法。
正向遗传学是指通过生物个体或细胞的基因组的自 发突变或人工诱变，寻找相关的表型或性状改变， 然后从这些特定性状变化的个体或细胞中找到对应 的突变基因，并揭示其功能。功能性克隆(functional cloning)、表型克隆(phonetypical cloning)等，如：遗 传病基因的克隆。
2.6 cDNA微阵列或芯片(DNA microarray or chip)技术
近年发展起来的又一新的分子生物学研究技术，其实验 包括6个步骤：将cDNA克隆加工为可供点印的材料；将 cDNA克隆(或寡核苷酸)点印到载体上；样品RNA的分离 (总RNA或mRNA)；探针的制备(例如cDNA的合成和标 记)；标记的探针DNA与载体上的DNA杂交；杂交结果的 成像和图象分析。主要应用于：基因表达水平的检测； 通过比较组织细胞基因的表达谱差异，可以发现新的可 能致病基因或疾病相关基因；可进行基因点突变、多态 性检测及染色体结构研究。其最为主要的优点是：可自 动、高效、同时检测目的材料中大量基因的表达情况； 并几乎可用于所有核酸杂交技术的领域。
然后以该D于植物基因的克隆，由于可供利用的转座子 的种类太少，而转座子在不同的植物中转座的频 率和活性相差很大，并且需要筛选大量的个体来 鉴定转座子突变个体，限制了转座子标签法的应 用范围。
二、电子克隆基因 （In silico cloning）
1. 功能性克隆(functional cloning) 1.1 纯化后克隆 若研究者可得到足够多的纯化目的蛋白以用于制备 了免疫 筛选方法外，也可根据目的蛋白的生物学功能，利 用同位素标记的配体来筛选受体表达的阳性克隆。
草莓果实FaSDR基因的克隆、生物信息学及表达分析
同发育 时期 的果实 为试 验材 料 ，从 克 隆、 生物 信 息学及 表达 分析 草 莓果 实 Ｆ ａ Ｓ Ｄ Ｒ特 性 。结 果表 明 ， Ｆ ａ Ｓ ＤＲ基 因含 有 ８ ０ ４ ｂ ｐ 开放 阅读 框 ，编码 ２ ６ ７ 个 氨基酸 的多肽 ，含 有典型 的脱 氢酶保守功 能结构域 。 半 定量 Ｒ Ｔ － Ｐ Ｃ Ｒ分析证 实 ，在 草莓果 实 发育过 程 中，Ｆ ａ Ｓ ＤＲ基 因的表达 量 随着果 实的 着 色快 速升 高 ，
中国园艺文摘
２ ０ １ ５ 年第９ 期
草莓果 实 Ｆ ａ Ｓ Ｄ Ｒ基 因的克 隆 、生物 信息学及表达分析
杨 东晓 ，侯柄 竹 ，沈元月
（ 北京农 学院 植物科 学技术 学院农 业应用新 技术北京市重 点实验室 ，北 京 １ ０ ２ ２ ０ ６ ）
摘 要 ：为探 索草莓果 实 中短链脱 氢酶还原 酶基 因 Ｆ ａ Ｓ Ｄ Ｒ在草 莓果 实发育 中的作 用 ，以‘ 北农香 ’不
Hale Waihona Puke Ｔ１ Ｓ ｉ ｍｐ ｌ ｅ Ｃ ｌ ｏ ｎ ｉ ｎ ｇ Ｋｉ ｔ （ 北京全式金生物技术有 限公 司） 载体连 接后转化 Ｅ ｃ ｏ ｌ ｉ Ｄ Ｈ５ ０ 【 感 受态细胞 ，蓝 白 斑筛选后 ，进行菌液 Ｐ Ｃ Ｒ检测 目的片段后测序 。
１ 材 料与方法
１ ． １ 试 验材 料 试 验 材料 为 ‘ 北 农香 ’草 莓 ，干 ２ ０ １ ５ 年 取 自北
Ａ Ｔ Ｇ Ｇ Ｇ Ｇ Ａ Ｇ Ｔ Ｃ Ｃ Ｔ ＧＣ Ｔ ＧＣ Ａ－ ３ ’ ，下游 ：５ ’ 一 Ｔ Ｃ ＡＣ Ａ Ｔ ＡＴ ＡＡ ＧＡ ＡＣ ＧＣ ＡＴ － ３ ’ 。以 Ａ ｃ ｔ ｎ 作 为 内参基 因 ， ｉ 根据 Ｇ ｅ ｎ ｅ ｂ ａ ｎ ｋ发表 的序 列 合 成 特 异性 引物 ：上 游
青杄PsbO基因cDNA序列克隆及生物信息学分析
青杄PsbO基因cDNA序列克隆及⽣物信息学分析OEE1(oxygen -evolving enhancer protein 1,MSP,33kD 蛋⽩)是由核基因锰簇稳定外周蛋⽩PsbO 基因编码的定位于叶绿体的33kD 蛋⽩,结合在类囊体膜内的光系统Ⅱ的外缘,是与放氧关系最为密切的外周蛋⽩,在维持光系统Ⅱ复合体的稳定⽅⾯发挥重要作⽤[1].⾃从Yamamoto 等第⼀次从光系统Ⅱ膜上纯化出OEE1蛋⽩之后[2],对该蛋⽩以及编码该蛋⽩的PsbO 基因的研究⼀直都未停⽌过.光合系统是对外界逆境响应最为敏感的部分,极易引发产⽣活性氧,造成光合系统破坏,出现光抑制情况.Mn 簇是否稳定对光系统Ⅱ光抑收稿⽇期：2012-02-24；修回⽇期：2012-03-29基⾦项⽬：国家转基因⽣物新品种培育科技重⼤专项资助项⽬（2009ZX08009-062B ）作者简介：刘亚静(1987-),⼥,河北衡⽔⼈,硕⼠研究⽣,主要从事植物抗逆基因的克隆和功能研究,E -mail ：liuyajing1987@/doc/8a553b4e83c4bb4cf6ecd17c.html ；*通讯作者：张凌云（1973-）,⼥,北京林业⼤学森林培育学科副教授,主要从事植物发育与⽣殖⽣物学研究,E -mail ：lyzhang73@/doc/8a553b4e83c4bb4cf6ecd17c.html .青杄PsbO 基因cDNA 序列克隆及⽣物信息学分析刘亚静,李长江,孙帆,张凌云*(北京林业⼤学森林培育与保护教育部重点实验室,中国北京100083)摘要：利⽤RACE 技术从已有的青杄均⼀化cDNA ⽂库中克隆得到青杄（Picea wilsonii ）PsbO 基因cDNA 的全长,并⽤⽣物信息学的⽅法对该cDNA 的核苷酸序列、氨基酸序列的相似性,及编码蛋⽩PwPsbO 的理化性质、亲⽔性/疏⽔性、⼆级和三级结构,PwPsbO 基因进化树等进⾏了预测和分析.采⽤实时荧光定量PCR （RT -qPCR ）技术,测定了青杄不同组织中的PsbO 基因的相对表达⽔平.结果发现：青杄PsbO 基因编码346个氨基酸,预测相对分⼦质量为36.6kD,理论pI 值为5.29,属于可溶性蛋⽩.⼆级和三级结构预测表明其含有较多的α螺旋、β折叠和随机卷曲结构.RT -qPCR 发现该基因在青杄针叶和茎中表达量最⾼.这些结果为青杄中PsbO 基因的初步功能研究奠定了基础.关键词：青杄；PsbO 基因；RACE ；⽣物信息学中图分类号：Q781⽂献标识码：A⽂章编号:1007-7847(2012)03-0201-06cDNA Cloning and Bioinformatic Analysis of PsbO Genefrom Picea wilsoniiLIU Ya -jing,LI Chang -jiang,SUN Fan,ZHANG Ling -yun *（Key laboratory of Forest Silviculture and Conservation of the Ministry of Education,Beijing Forestry University,Beijing100083,China ）Abstract ：Full -length cDNA sequence of PsbO gene was acquired from normalized cDNA library of Piceawilsonii by RACE methods.Prediction on physical and chemical properties,hydrophobicity,phylogenetic tree ,secondary and tertiary structure of amino acid were analyzed by bioinformatics.The relative expression level of PwPsbO in different tissues using quantitative real time PCR (RT -qPCR)was measured.The results showed that PwPsbO gene encodes 346aminoacids.Its molecular weight is 36.6kD and the theoretical pI is 5.29.It is a hydrophilic protein.The secondary and tertiary structure of PwPsbO is mainly composed of alpha helix,random coil and extended strand.The higher expression level of PwPsbO was observed in needles and stems.The aim of this study is to lay a foundation for the function of PsbO in Picea wilsonii .Key words ：Picea wilsonii ；PsbO ；RACE ；bioinformatics（Life Science Research ，2012，16（3）：201～206）第16卷第3期⽣命科学研究Vol．16No．32012年6⽉Life Science ResearchJun.2012⽣命科学研究2012年制产⽣活性氧的过程会产⽣重要影响.PsbO可能直接影响Cl-在光系统Ⅱ放氧反应中与活性位点的结合或者作⽤的发挥[3].将PsbO蛋⽩从膜上去除会导致在低Cl-浓度下Mn簇4个Mn原⼦中的2个从膜上脱落[4].另有许多证据表明PsbO 蛋⽩与CP47之间存在结合,保护CP47免受限制性蛋⽩酶的降解,去除PsbO蛋⽩以后,CP43、Cytb559的α亚基易被胰蛋⽩酶剪切[4,5].拟南芥的PsbO2涉及在⾼光条件下调节D1蛋⽩的运转,具有维持光系统Ⅱ的功能[6].因此,OEE1蛋⽩很有可能参与光合放氧⽣物在光照胁迫时的保护机制[5,7].杨传平等应⽤SSH技术研究盐胁迫下柽柳相关基因的表达情况,获得了36个盐胁迫响应基因,其中就包括PsbO蛋⽩基因[8].Sugihara K等发现⽊榄在500mmol/L NaCl胁迫下OEE1蛋⽩表达的表达增强[9].这些研究表明PsbO蛋⽩很可能参与逆境条件下的胁迫响应过程.最近,有关⼈员预测PsbO蛋⽩可能也发挥包括酶活性调节、反应中⼼蛋⽩翻转的调控、类囊体膜结构的调整等功能[10,11],这可能预⽰着PsbO在其它更多⽅⾯的新功能的发现.本⽂以青杄为研究对象,成功克隆得到青杄中PsbO基因的全长cDNA,利⽤⽣物信息学的⽅法对该cDNA核苷酸序列、氨基酸序列的相似性、理化性质、亲⽔性/疏⽔性、⼆级和三级结构、进化树等进⾏了预测和分析,并⽤RT-qPCR⽅法分析了PsbO基因在青杄不同组织中的相对表达⽔平,旨在为进⼀步进⾏PsbO基因的功能研究奠定科学基础.1材料与⽅法1.1实验材料多年⽣青杄（Picea wilsonii）的花粉和针叶,由中科院植物所北京植物园提供.供试花粉于室温下⾃然风⼲,贮藏于-20℃冰箱.供试针叶⽤液氮速冻,贮藏于-80℃超低温冰箱.⽤Gateway技术构建青杄cDNA⽂库,由英俊⽣物公司构建.两年⽣青杄的根、茎、叶⽤于进⾏RT-qPCR实验.Taq DNA聚合酶、DL2000购买于中国TAN-GENG公司,pDONR222载体购买于美国Invitro-gen公司,反转录试剂盒购买于加拿⼤Fermentas 公司,荧光定量PCR试剂盒购买于美国KAPA公司,pEASY-T1购买于中国全式⾦公司,其它试剂均购于美国Promega公司.1.2实验⽅法1.2.1利⽤RACE PCR获取PwPsbO基因的末端序列以多年⽣青杄cDNA⽂库（本实验室已构建）为模板,利⽤PsbO的EST序列中特异引物与PDONR222两端的载体引物进⾏5′-RACE与3′-RACE实验.5′-RACE实验利⽤上游引物5PR-L 与下游引物5PR-R(见表1),3′-RACE实验利⽤上游引物3PR-L与下游引物3PR-R(见表1)进⾏扩增.通过EST⽚端与5′端、3′端序列的拼接,得到PsbO基因的全长cDNA序列.1.2.2PwPsbO基因的⽣物信息学分析利⽤DNAMAN软件进⾏PwPsbO的cDNA 序列编码框预测及蛋⽩翻译.通过NCBI(http：///doc/8a553b4e83c4bb4cf6ecd17c.html /)与TRIR(http：///doc/8a553b4e83c4bb4cf6ecd17c.html /)⽹站中的BLASTn与BLASTp⼯具进⾏核酸序列与蛋⽩序列的同源性分析,⽤CLUSTALX软件进⾏多序列⽐对,⽤MEGA5进⾏系统树的构建；利⽤ExPASy(http：///doc/8a553b4e83c4bb4cf6ecd17c.html /tools/)中的Compute pI/Mw⼯具(http：// /doc/8a553b4e83c4bb4cf6ecd17c.html /compute_pi/)预测其等电点和相对分⼦质量,利⽤ProtScale⼯具(http：///doc/8a553b4e83c4bb4cf6ecd17c.html /protscale/)计算蛋⽩的疏⽔性图谱；利⽤TMHMM⼯具(http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMH-MM-2.0/)预测蛋⽩是否跨膜；利⽤SWISS-MODEL ⼯具来预测蛋⽩的⼆级和三级结构.1.2.3利⽤RT-qPCR进⾏PwPsbO基因的组织表达分析利⽤Aidlab公司RNA提取试剂盒提取两年⽣青杄的根、茎、叶与多年⽣青杄的种⼦和花粉的RNA.利⽤Fermentas公司的RevertAid TM First Strand cDNA Synthesis Kit合成双链cDNA.根据PwPsbO的CDS设计特异引物QRT-L、QRT-R(见表1).选⽤青杄EF-1α基因为内参基因,并设计引物EF-1α-L和EF-1α-R(见表1).利⽤KAPA公司的SYBR FAST qPCR Kit（ABI prismTM）在ABI StepOnePlus实时荧光定量PCR仪进⾏RT-qPCR 实验,分析PwPsbO在青杄5种不同组织中的相对表达情况.2结果2.1通过RACE实验获取PwPsbO的cDNA全长对5′RACE和3′RACE实验获取的⽚段进⾏202第3期刘亚静等：青杄PsbO 基因cDNA 序列克隆及⽣物信息学分析图1PwPsbO 的核苷酸序列和氨基酸序列氨基酸序列⽤单个字母表⽰,下划线标记为转录起始密码⼦ATG 和转录终⽌密码⼦TGA ；氨基酸碳末端⽤星号表⽰,PolyA 信号⽤⿊体表⽰.Fig.1Nucleotide sequences and deduced sequence of a -mino acid residues of PwPsbOThe amino acid residues are indicated by a single letter code.A potential translation initiation codon (ATG)and a termination codon are underlined ；the C terminal of se -quence of amino acid residues is marked with asterisk ；the potential polyadenylation signal sites are marked inbold.测序,并且将测序结果与EST ⽚段拼接获取cDNA 全长(图1).设计引物PsbO -L 与PsbO -R,⽤PCR 扩增PwPsbO 的编码区,将⽚段连接pEASY -T1载体上酶切和测序进⾏鉴定.2.2PwPsbO 的氨基酸组成与理化性质分析应⽤DNAMAN 对PwPsbO 的全长cDNA 序列进⾏分析发现：PwPsbO 的全长cDNA 共1260bp,在54bp 出现起始密码⼦ATG,在1092bp 处发现终⽌密码⼦TGA,在1248bp 处出现PolyA 尾巴,编码区由1041bp 核酸组成,编码346个氨基酸（核苷酸和氨基酸序列见图1）.应⽤Compute pI/Mw ⼯具预测相对分⼦质量为36.6kD,理论pI 值为5.29.2.3PwPbsO 推导的氨基酸序列的的疏⽔/亲⽔性分析氨基酸的疏⽔性和亲⽔性是氨基酸的固有特性,蛋⽩结构的稳定性在很⼤程度上依赖于氨基酸的疏⽔特性.我们利⽤ProtScale ⼯具(http ：///doc/8a553b4e83c4bb4cf6ecd17c.html /protscale/)计算蛋⽩的疏⽔性图谱,对PwPbsO 蛋⽩的疏⽔性和亲⽔性进⾏了分析.发现第159位的赖氨酸（Lys ）、160位天冬酰胺酸（Asn ）、163位的脯氨酸（Pro ）疏⽔性最差是-2.467,79位的丙氨酸（Ala ）疏⽔性最强是2.256.⼤部分的氨基酸属于亲⽔性氨基酸,因此预测PwPbsO 为可溶性蛋⽩（见图2）.2.4PwPsbO 基因与多种植物的序列⽐对及系统进化树分析我们将PwPsbO 蛋⽩的氨基酸序列与拟南芥、⽟⽶、杨树、⽊榄、⽑⽵、葡萄等物种（表2）的序列进⾏了多序列⽐对,发现PwPsbO 蛋⽩和其他PsbO 蛋⽩类似,含有较多的α螺旋以及β折叠结构[12]（图3）.并⽤MEGA5进⾏了系统树的构建（图4）.结果发现,青杄PsbO 基因和⽑⽵、⽟⽶的亲缘关系最近.2.5PwPsbO 的⼆、三级结构分析我们利⽤GOR4在线⼯具做了PwPsbO 蛋⽩的⼆级结构预测,发现该氨基酸序列含有23.99%的α螺旋结构（Alpha helix）,21.97%的β折叠（Extended strand ）,54.05%的随机卷曲（Random coil ）,这个结果（见图5）和以往的研究成果基本类似,但具体的结构尚需实验印证.应⽤SWISS -MODEL ⼯具来预测PwPsbO 蛋⽩的三维结构也得到了类似的结果（图6）.表1cDNA 克隆和RT -qPCR 所⽤引物序列Table 1The primers used in the cDNA cloning andRT -qPCRPrimers 5PR -L 5PR -R 3PR -L 3PR -R QRT -L QRT -R EF -1α-L EF -1α-R PsbO -L PsbO -RSequencesCAGTCTTAAGCTCGGGCCCCA CAGCGCGGATCCTGTTGCGAGG CCTCGCAACAGGATCCGCGCTG CTGCCAGGAAACAGCTATGAC ATGGCCGCGTCCCTCGCAACAG AAGGCCCTTGAGAGGTTCGAGG AACTGGAGAAGGAACCCAAG AACGACCCAATGGAGGATAC ATGGCCGCGTCCCTCGCAACAG TCAATTTGTGCATACCATGGG203⽣命科学研究2012年图3不同植物的PsbO 蛋⽩多序列⽐对结果Fig.3The multiple protein sequences alignment result表2PwPsbO 的同源基因Table 2Homological genes of PwPsbO图2PwPsbO 蛋⽩的疏⽔性分析图谱Fig.2Hydrophobic analysis of PwPsbOProtScale output for user sequenoe2.52.01.51.00.5-0.50-1.0-1.5-2.0-2.5S c o r ePosition50100150200250300Hphob./Kyte &DoolittleSpeciesArabidopsis thanliana Populus trichocarpa Bruguiera gymnorhiza Zea maysPhyllostachys edulis Vitis viniferaNicotiana benthamianaAccession AT5G66570AT3G50820XP_002310188AB043960ACG31595ABV57472XP_002274796AAX53163 Gene AtPsbO 1AtPsbO 2PtPsbO BgPsbO ZmPsbO PePsbO VvPsbO NbPsbO 1E value e -126e -125003e -1802e -9700204第3期图8PwPsbO 基因在两年⽣青杄的相对表达情况Fig.8Transcript accumulation of PwPsbO in 2-year -old trees图7青杄各组织RNA 提取结果Fig.7The result of RNA of five tissues in Picea wilsonii图6由SWISS -MODEL ⼯具预测的PwPsbO 蛋⽩的三级结构Fig.6The tertiary structure of protein PwPsbO present -ed by SWISS -MODEL图4不同植物间PbsO 基因系统树Fig.4Polygenetic tree of PbsO about 8kinds of differ -ent plantsBgOEP1NbPSBO1VvPSBO1AtPSBO1AtPSBO2PwPSBO1ZmOEP1PePSBO0.0250100150200250图5PwPsbO 蛋⽩的⼆级结构预测图紫⾊代表随机卷曲,红⾊代表α螺旋结构,蓝⾊代表β折叠.Fig.5The secondary structure of protein PwPsbO presented by GOR4The part of purple/red/blue represent the random coil/alpha helix/extended strand. 28S 18Srootstemneedlespollenseedrootstemneedles pollenseed0.51.01.52.02.53.03.5R e l a t i v e e x p r e s s i o n2.6PwPsbO 基因在不同组织中的表达情况分别提取青杄根、茎、叶、花粉、种⼦5种组织的总RNA.经过1.2％琼脂糖凝胶电泳(110V,15min),18S 和28S 条带明显(图7).接下来我们对所提取的RNA 进⾏OD 260/280检测分析,OD 值⼤⼩介于1.8～2.0之间,说明提取的总RNA 纯度⽐较好,可以⽤于后续实验．将上⼀步提取的各组织RNA 通过加拿⼤Fermentas 公司的RevertAid TM First Strand cDNA Synthesis Kit 合成双链cDNA 试剂盒反转录为cDNA.利⽤KAPA 公司的SYBR FAST qPCR Kit （ABI prism TM ）在ABI StepOnePlus 实时荧光定量PCR 仪进⾏RT -qPCR 实验.设置阴性对照和空⽩对照,每次试验设置3个重复,得到PsbO 基因在不同组织中表达情况的RT -qPCR 的结果（图8）.结果显⽰,PsbO 基因在青杄的茎和叶中的表达量最⾼.3结论与讨论以青杄cDNA ⽂库为模板的RACE 实验是基于EST 保守序列和pDONR222载体上特异的引物进⾏的,因此cDNA 全长是由PsbO 的末端序列和EST 序列进⾏拼接⽽来的,进⽽完成基因的克隆.本研究成功获得了青杄PsbO 基因的cDNA 序列并推导出了它的氨基酸序列.青杄PsbO 基因的全长cDNA 共1260bp,包括1041bp 的完整的53bp 的5′⾮翻译区(5′site untranslated re -gion,5′-UTR),368bp 的3′⾮翻译区(3′-UTR)以及刘亚静等：青杄PsbO 基因cDNA 序列克隆及⽣物信息学分析205⽣命科学研究2012年poly(A)尾巴.青杄PsbO基因编码346个氨基酸,预测相对分⼦质量为36.6kD,理论pI值为5.29.青杄PsbO蛋⽩的⼆级结构预测表明此蛋⽩含有23.99%的α螺旋结构（alpha helix）,21.97%的β折叠结构（extended strand）,54.05%的随机卷曲结构（random coil）,三级结构以⽆规则卷曲为主,α螺旋和β折叠主要分布在PsbO蛋⽩的外围.三级结构中形成了⼀个圆桶形的结构域,可以推测锰离⼦在该区域螯合.这个结果和以往的研究成果基本类似,但具体的结构尚需实验印证.⽬前已有研究使⽤⼩⾓度的X射线观测了低分辨率下野⽣型菠菜PsbO蛋⽩.该蛋⽩在溶解状态时以单分⼦状态存在[13].这也和本研究预测的Pw-PsbO蛋⽩为可溶性蛋⽩⼀致.最新的研究表明psbo突变植物的光合系统Ⅱ放氧复合体的稳定性存在多样缺陷.真核⽣物中的PsbO蛋⽩可能通过与锰离⼦、钙离⼦以及氯离⼦的联系影响光系统Ⅱ放氧过程的氧化还原反应[14].⽬前已经在拟南芥、⽔稻、⼩麦、菠菜、烟草、番茄等许多植物中发现PsbO基因具有多个拷贝的现象,这说明PsbO在响应⾼光胁迫过程中,可能存在⼀种通过调控D1蛋⽩周转达到提⾼植物抗性的机制,⽽且有关研究也发现某些逆境条件上调PsbO基因的表达,表明PsbO基因可能在提⾼植物抗逆性⽅⾯具有⼀定的作⽤.我国特有树种青杄（Picea wilsonii）是⼀种品质⾮常优良的树种,性强健、适应⼒强、耐阴性强、耐寒性强,PsbO基因是否在逆境响应中发挥作⽤,还需要进⼀步研究.本研究⾸次从中国特有树种青杄中克隆得到了PwPsbO基因的cDNA全长,并应⽤⽣物信息学的⽅法初步预测了该基因的⼀些性质和结构⽅⾯的特征,这对继续研究PwPsbO如何保持光系统Ⅱ的稳定性以及在逆境胁迫响应中的功能等⽅⾯具有⼀定的意义.参考⽂献(References)：[1]于勇,翁俊,徐春和.植物光系统Ⅱ放氧复合体外周蛋⽩结构和功能的研究[J].植物⽣理学报（YU Yong,WENG Jun,XU Chun-he.The progress in the investigation on the structure and function of the extrinsic proteins of photosystem II[J].Acta Phytophysiologica Sinica）,2001,27(6)：441-450.[2]YAMAMOTO Y,NAKAYAMA S,COHN C L,et al.Highly ef-ficient purificaiton of the33-,24-,and18-kDa proteins inspinach photosystemⅡby butanol/water phase partitioningand high performance liquid chromatography[J].Archives of Bio-chemistry and Biophysics,1987,255（1）：156-161.[3]POPELKOVA H,YOCUM C F.PsbO,the manganese-stabiliz-ing protein：analysis of the structure-function relations thatprovide insights into its role in photosystemⅡ[J].Journal of P-hotochemistry and Photobiology B,2011,104(1-2)：179-190.[4]BRICKER T M.Oxygen evolution in the absence of the33kDa manganese-stabilizing protein[J].Biochemistry,1992,31（19）：4623-4628.[5]MIYAO M,MURATA M,LAVOREL I,et al.Effects of the33kDa protein on the state transitions in photosynthetic oxygenevolution[J].Biochimica et Biophysica Acta Bioenergetics,1987,890（2）：151-159.[6]KO Murakami,KENTARO Ifuku,ATSUSHI Takabayashi,etal.Functional dissection of two Arabidopsis PsbO proteins Ps-bO1and PsbO2[J].FEBS Journal,2005,272（9）：2165-2175. [7]张素萍,屠铁成,翁俊,等.Mn簇对光系统Ⅱ光抑制产⽣超氧⾃由基的影响[J].科学通报(ZHANG Su-ping,TU Tie-cheng,WENG Jun,et al.The influence that Mn cluster canproduce free oxygen radical in photosystemⅡin the conditionof photoinhibition[J].Chinese Science Bulletin),2001,17(46)：1431-1434.[8]杨传平,王⽟成,刘桂丰,等.应⽤SSH技术研究NaHCO3胁迫下柽柳基因的表达[J].遗传学报(YANG Chuan-ping,WANGYu-cheng,LIU Gui-feng,et al.Study on gene expression ofTamarix under NaHCO3stress using SSH technology[J].Jour－nal of Genetics and Genomics),2004,3(9)：926-933.[9]SUGIHARA K,HANAGATA N,DUBINSKY Z,et al.Molecu-lar characterization of cDNA encoding oxygen evolving en-hancer protein1increased by salt treatment in the mangrove,Bruguiera gymnorhiza[J].Plant and Cell Physiology,2000,41（11）：1279-1285.[10]POPELKOVA H,BOSWELL N,YOCUM C.Probing the to-pography of the photosystemⅡoxygen evolving complex：PsbOis required for efficient calcium protection of the manganesecluster against dark-inhibition by an artificial reductant[J].Pho-tosynthesis Research,2011,110(2)：111-121.[11]BRICKER T M,FRANKEL L K.Auxiliary functions of the PsbO,PsbP and PsbQ proteins of higher plant PhotosystemⅡ：acritical analysis[J].Journal of Photochemistry and PhotobiologyB,2011,104(1-2)：165-178.[12]SONOYAMA M,MOTOKJ A,OKANIOTO G,et al.Secondary structure and thermostability of the phosystemⅡmanganese-stabilizing protein of the thermophilic cyanobacterium,Syne-chococcus elongates[J].Biochimica et Biophysica Acta,1996, 1297（2）：167-170.[13]SLOWIK D,ROSSMANN M,KONAREV P V,et al.Structural investigation of PsbO from plant and cyanobacterial photosys-temⅡ[J].Journal of Molecular Biology,2011,407(1)：125-137.[14]ROOSE J L,YOCUM C F,POPELKOVA H.Binding stoi-chiometry and affinity of the manganese-stabilizing protein af-fects redox reactions on the oxidizing side of photosystemⅡ[J]. Biochemistry,2011,50(27)：5988-5998.206。
基因克隆原理及实验介绍
859bp
859bp
336bp
336bp
336bp
2700bp 2700bp 2700bp
1485bp
339bp 339bp 339bp
498bp 498bp 498bp
质粒载体 pcDNA3.1+3flag pcDNA3.1+3flag pcDNA3.1+3flag
pcDNA3.1+3flag
T4 DNA Ligase Total
• 混匀，4℃过夜或常温条件下反应4h
用量 13-15μl 2-4μl
2μl 1μl 20μl
整理课件
23
引物设计
pCR
回收纯化
双酶切
连接
转化
挑菌
提质粒
测序
将连接产物通过转化转入到感受态大肠杆菌中，从而使连接产物（重组质粒）在大肠杆菌中大量复制
LB培养基配制
2μl
enzyme 1
2μl
enzyme 2
2μl
enzyme 2
2μl
dd H2O
补至50μl
dd H2O
补至50μl
*根据质粒浓度（如pcDNA3.1+3flag浓度为455ng/μl，4000bp，反应体积约为9μl）
• 混匀，37℃孵育4-6h（6h以上更佳）整理课件
22
引物设计
pCR
回收纯化
双酶切
连接
转化
挑菌
提质粒
测序
通过凝胶电泳验证目的DNA、质粒是否酶切成功，并通过胶回收DNA及质粒（切去 的片段除外）最终回收体积为30μl
通过连接使目的DNA导入质粒中，为下一步转染准备
Procedure
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
功能基因的克隆及其生物信息学分析摘要：随着多种生物全基因组序列的获得，基因组研究正从结构基因组学<structural genomics）转向功能基因组学(functional genomics>的整体研究。
功能基因组学利用结构基因组学研究获得的大量数据与信息评价基因功能(包括生化功能、细胞功能、发育功能、适应功能等>，其主要手段结合了高通量的大规模的实验方法、统计和计算机分析技术[1]，它代表了基因分析的新阶段，已成为21世纪国际生命科学研究的前沿。
功能基因组学是利用基因组测序获得的信息和产物，发展和应用新的实验手段，通过在基因组或系统水平上全面分析基因的功能，使生物学研究从对单一基因或蛋白的研究转向多个基因或蛋白同时进行系统的研究，是在基因组静态的组成序列基础上转入对基因组动态的生物学功能学研究[2]。
如何研究功能基因，也成为我们面临的一个课题，本文就克隆和生物信息学分析在研究功能基因方面的应用做一个简要的阐述。
关键词：功能基因、克隆、生物信息学分析。
1.功能基因的克隆1.1 图位克隆方法图位克隆又称定位克隆，它是根据目标基因在染色体上确切位置，寻找与其紧密连锁的分子标记，筛选BCA克隆，通过染色体步移法逐步逼近目的基因区域，根据测序结果或用BAC、YAC克隆筛选cDNA表达文库寻找候选基因，得到候选基因后再确定目标基因。
优点是无需掌握基因产物的任何信息，从突变体开始，逐步找到基因，最后证实该基因就是造成突变的原因。
通过图位克隆许多控制质量性状的单基因得以克隆，最近也有报道某些控制数量性状的主效基因<控制蕃茄果实大小的基因克隆[3]、控制水稻成熟后稻谷脱落基因克隆[4]以及小麦 VRN2 基因克隆[5]等）也通过图位克隆法获得。
1.2 同源序列克隆目的基因首先根据已知的基因序列设计PCR引物，在已知材料中扩增到该片段，并经克隆测序验证，利用放射性同位素标记或其他非同位素标记该PCR片段作为探针，与待研究材料的cDNA文库杂交，就可以获得该基因cDNA克隆，利用克隆进一步筛选基因组文库，挑选阳性克隆，亚克隆并测序，从中就可以筛选到该基因的完整序列。
1.3结合连锁和连锁不平衡的分析方法结合连锁和连锁不平衡的分析方法是未知基因克隆研究领域发展的新方向[6 ]。
(Linkage disequilibrium, LD>。
与连锁分析不同, 连锁不平衡分析可以利用自然群体中历史发生的重组事件。
历史上发生的重组使连锁的标记渐渐分布到不同的同源染色体上,这样就只有相隔很近的标记才能不被重组掉,从而形成大小不同的单倍型片段(Haplotype block>。
这样经过很多世代的重组, 只有相隔很近的基因, 才能仍处在相同的原始单倍型片段上, 基因间的连锁不平衡才能依然存在。
所以基于连锁不平衡分析,可以实现目的基因的精细定位。
林木大多为自由授粉的异交物种,所以连锁不平衡程度很低, 林木基因组中的LD可能会仅局限于非常小的区域, 这就为目的基因的精细定位提供了可能, 结合SNP 检测技术, 科学家甚至可以将效应位点直接与单个的核苷酸突变关联起来,进行数量性状寡核苷酸(Quantitative trait nucleotide, QTN>作图。
当然除了相隔很近的基因, 某些相隔较远的基因, 由于受相同的选择压力, 也可能产生连锁不平衡。
但通过家系分析, 首先可以进行目的基因的粗略定位, 将目的基因首先限定到一个较小的区域, 只针对该区域内的SNP 进行相关性分析, 从而消除非由连锁引起的连锁不平衡干扰。
随着林木全基因组测序的发展,连锁图谱与LD 分析相结合的方法将是在林木中实现未知基因克隆的最有效的方法[6]。
1.4电子克隆近年来又兴起一种新的基因克隆方法--电子克隆，它是近年来伴随着基因组计划和EST计划发展起来的基因克隆新方法，它的主要原理是利用日益发展的生物信息学技术，借助电子计算机的巨大运算能力，通过EST或基因组的序列组装和拼接,利用RT-PCR的方法快速获得功能基因,具有投入低、速度快、技术要求低和针对性强等优点[7]。
1.4.1利用EST数据库信息首先选择感兴趣的水稻, EST作为查询探针，搜索水稻dbEST数据库，找到部分重叠的EST进行拼接，然后再以拼接好的EST重叠群为新的查询探针，继续搜索dbEST库,直到没有新的EST可供拼接为止，最后根据拼接好的完整序列设计PC R引物，通过RT-PCR的方法获得目的cDNA克隆并进行序列测定验证[7]。
图1为利用EST数据库信息克隆水稻功能基因的实验流程。
图1 利用水稻 EST数据库进行电子克隆的策略1.4.2利用基因组信息利用基因组信息资料进行电子克隆的最大优点就是基因的克隆不受作物发育时期或特殊环境条件的限制:可以用来源于任何时期或组织的水稻和其他物种的EST或全长cDNA序列作为信息探针搜索位于GenBank或者我国华大公布的水稻基因组序列:随后根据内含子的规则通过人工拼接或相应的计算机软件预测:可以得到该基因完整的开放读码框,根据拼接的序列结果设计PCR引物:进一步采取RT-PCR的方法获得目的基因的cDNA克隆并进行序列测定[7]。
具体实验流程见图22 生物信息学分析生物信息学(bioinformatics>是在生命科学、计算机科学和数学的基础上逐步发展而形成的一门新兴交叉学科，是为理解各种数据的生物学意义，运用数学与计算机科学手段进行生物信息的收集、加工、存储、传播、分析与解读的科学[8-10]。
由于历史原因，有的研究者也使用计算生物学(computationalbiology>或计算分子生物学(computational molecular biology> 等不同的术语。
在后基因组时代，生物信息学的研究内容主要可分为两个重要组成部分：基因组信息学和蛋白质组信息学[11]。
后基因组时代，除了继续序列和结构分析外，更多的研究力量则投入到功能分析，也就是分析研究遗传型到表型的过程[12]。
2.1 基因序列同源性比对及其应用基因序列同源性的比对，对于分析基因组DNA序列以及完成新基因的染色体定位也是极为便捷的。
将确定的新基因的编码基因序列作为参照，对于GenB ank数据库中高通量基因序列(htgs>数据库中基因组DNA序列进行同源性对比，当发现与新基因的cDNA序列完全同源的基因组DNA序列时，根据Chambon原则，内含子(intron>的序列总是以GT开始，以AG结束，就可以确定该基因的基因组DNA序列的结构，及外显子(exon>-内含子序列结构。
因为在htgs数据库收录的基因组DNA序列，其染色体的来源是十分清楚的，因此就很容易、很方便地将该基因组进行染色体的定位，而不再需要进行荧光原位杂交(FISH>的常规的基因染色体定位技术。
可见基因的生物信息学技术的发展对于基因组DNA序列的确定和在染色体上的定位是多么重要。
迟光红等在香蕉中获得一个柠檬酸合酶基因的cDNA序列。
用NCBIBlastx分析，得出它具有植物柠檬酸合酶基因的特征结构域，并与其他植物中柠檬酸合酶基因的同源性较高，进一步证明了该cDNA编码香蕉中的柠檬酸合酶[13]。
李学农等通过Internet查询美国国家生物信息中心数据库，数据库采用BLAST，依据Genecard和Ense-mbl获得将MGC39325基因定位于人染色体8q12[14]。
2.2 结构分析与功能预测结构分析的研究重点在于研究蛋白质的空间结构。
利用分子模拟技术结合计算机图形技术可以更形象、更直观地研究蛋白质等生物大分子的结构，蛋白质的空间结构的更清晰的表述和研究对揭示蛋白质的结构和功能的关系、总结蛋白质结构的规律、预测蛋白质肽链折叠和蛋白质结构等，都是有力的帮助和促进。
同时，也可以对已经被测定的生物大分子的三维结构进行显示和编辑操作。
分子模型的建立为下一步进行的分子模拟以及了解结构与功能的关系打下了基础。
蛋白质结构预测是利用已知的一级，二级序列来构建蛋白质的立体结构模型，对蛋白质进行结构预测需要具体问题具体分析，在不同的已知条件下对于不同的蛋白质采取不同的策略。
杨波等以LRP16 基因转录产物为目标序列，在人类基因组数据库中搜索开放阅读框<ORF），利用计算机辅助系统预测LRP16蛋白的一级结构、二级结构和三级结构；利用结构域搜索 LRP16 编码蛋白的同源或相似结构蛋白[15]。
2.3 蛋白质的同源性检索及系统发生进化树分析将推导出的蛋白质序列登录到NCBI网站( http：//www．ncbi．nlm．n ih．gov />上，用BL AST程序进行序列的同源性检索[16-18]。
王安娜等。
结果发现大豆的C4H蛋白质与绿豆、马铃薯、棉、辣椒、橄榄、烟草、律草属啤酒花等的 C 4 H蛋白质有着很显著的同源性。
在BLA ST p分析的基础上，选择与其同源性较高的几条序列做聚类分析，对C4H蛋白和其他C4H蛋白的同源性做进一步分析。
在DNAMA N 6.0 的Treeview显示的结果。
结果表明大豆C4H和绿豆的C4H亲缘关系最近，同源性达95％，来自于同一个分枝；其次是紫苜蓿、红车轴草、鹰嘴豆、豌豆,来自同—个次分枝[19]。
参考文献[1] 黎裕、王天宇、贾继增. 植物功能基因组学的发展现状与发展趋势. 生物技术通报 2000；6-10[2] 刘斌.生命科技的前沿领域，HIGH TECHNOLOGYANDINDUSTRIALIZATIONAUGUST 2006；48-54[3] Frary A, Nesbitt T.C, Frary A, Grandillo S, van der Knaap E, Cong B, Liu J, Meller J, Elber R, Alpert KB, TanksleySD. Fw2.2: A quantitative trait locus key to the evolution of tomato fruit size. Science, 2000, 289(期>: 85–88.[4] Li C, Zhou A, Sang T. Rice domestication by reducing shattering. Science, 2006, 311(5266>: 1936–1939.[5] Yan L, Loukoianov A, Blechl A, Tranquilli G, Ramakrishna W, SanMiguel P,Bennetzen JL, Echenique V, Dubcovsky J. The wheat VRN2 gene is a flowering repressor down-regulated by vernalization. Science, 2004, 303(5664>: 1640–1644.[6] 尹佟明 HEREDITAS (Beijing> 2018年7月, 32(7>: 677―684.[7] 黄骥张红生曹雅君钱晓茵杨金水水稻功能基因的电子克隆策略. 中国水稻科学,2002,16(4>。