分小鼠肝脏原代细胞-整理版

1、在前一天晚上铺三明治培养基的下层胶：

100ml超纯水+114ul冰醋酸，然后到细胞房超净台用0.22um的滤膜过滤后加入1.6ml 的I型鼠尾胶原后铺板

6-well plate：1000ul

12-well plate：500ul

24-well plate：250ul

96-well plate：30ul

铺板后晃荡混匀，打开盖子置于超净台中，开紫外灯过夜，第二天吸弃上层液体，收起plate备用（若要放置长时间，则要用封口膜）；

2、在前一天确认buffer1、beffer2（未加酶）是否准备好

Buffer1：1*EBSS，0.5mM EGTA，无Ca、Mg；

Buffer2：1*EBSS，0.2mg/ml 胶原酶IV，10mM HEPES（500ml；1.191g），2mM CaCl（500ml；

0.11g）

两种buffer都用NaHCO3调pH至7.3~7.5，不可低于7.3；

3、当天上午器材灭菌，两个铁饭盒，one for剪刀，小镊子，橡胶管，细线，another for三

个筛子，2把弯头镊子,1把剪刀；两个fisher瓶子装过滤后的buffer1,buffer2；

4、准备30ml的WEM（或DMEM）置于4°，盛放剥下的肝脏；预先打开37°水浴槽两个；

buffer1,buffer2过滤除菌，并置于37°中预热；检查泵是否正常工作；

※灌流一只20g左右的小鼠肝脏，buffer1需100ml即够，buffer2需60ml，加0.18mg/ml 的胶原酶IV。

5、解剖腹腔与胸腔之间的部分，找到门静脉顺行插管，（橡皮管内径为4.8mm），先用buffer1灌注，调节流速为3.1rpm（约5ml/min），灌流6min。然后用buffer2，调节流速为3.1rpm，将60mlbuffer2灌完（最好控制在8min内）；

6、剪下肝脏组织放至预先放在4°冰箱的WEM中；

去细胞房预冷离心机

7、准备4-5个10cm dish，将肝脏并WEM一并倒入dish清洗一下，转入倒有DMEM的dish

中，用镊子轻轻撕去肝脏表面一层膜（撕时要抖动，以便干细胞掉下来），再将肝脏转入新dish中继续撕；

8、将dish中的细胞悬液倒入筛子中，用新dish盛接，筛下来的细胞悬液转移至50ml离心

管；

9、初步离心，50g，2min，4°，吸弃上清；

离心过程中配制梯度离心液：5ml 10*PBS + 45ml percoll + 50ml DMEM

10、加25ml梯度离心液重悬（先加2ml重悬，再补加）：

1500rpm 8min，4°，吸弃上清；

离心过程中配制PM液

11、加30ml DMEM重悬

50g，2min，4°，吸弃上清；

12、重复步骤11（可不重复）；

13、加入PM 5ml（根据细胞量来决定加多少），混匀后计数

6孔板，2ml，5*10E5个/ml

14、4h后换PM液（PM要预热）

24h后换成FM液（若铺上胶则不能预热）。

※若铺上胶则提前半天将上胶置于4℃