烟草转基因步骤

植物材料：Nicotiana benthamiana

菌种：GV3101

载体：Cam35S-gfp

第一天：

准备菌液，Culture a single colony in liquid LB + 50 mg/L Kanamycin + 60 mg/L Gentamicin

第三天：

转化

准备植物材料

1.无菌烟草材料，生长4-5周，完全展开叶片；

2.切成0.6cm到0.8cm见方叶盘；

3.用重悬液RM重悬离心收集的农杆菌菌体（2500 g，5 min），重悬至OD600=0.5~0.8；

4.将叶盘转入农杆菌重悬液中，28℃侵染30 min；

5.倒掉农杆菌菌液，将叶盘转到固体RM培养基上，覆盖无菌滤纸。

共培养：

在黑暗中25℃培养3天。

洗涤：

共培养后，将叶盘转到一个50ml圆底离心管中，用含有1000 mg/L特美丁RM溶液洗涤3 min，用RM溶液洗两次，每次3分钟。

筛选和分化培养：

1.用滤纸将叶盘表面吸干；

2.将叶盘放置到筛选RM培养基，10个叶盘一个皿；

3.黑暗中培养2周，转移至光下培养；

4.每3周继代一次。

生根

1.将分化愈伤转移至生根培养基；

2.成苗。

RM培养基：（固体加8 g/L Agar）

MS盐

B5 Vitamins

30 g/L 蔗糖

BA 2.0 mg/L

NAA 0.2 mg/L

PH 5.6

筛选培养基：

除上述成分外，加特美丁终浓度300 mg/L，潮霉素50 mg/L。