液相色谱柱的应用 ppt课件
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液相色谱法ppt课件
二、液相色谱分离原理及分类 和气相色谱一样，液相色谱分离系统也由两相——固定
相和流动相组成。液相色谱的固定相可以是吸附剂、化学键 合固定相（或在惰性载体表面涂上一层液膜）、离子交换树 脂或多孔性凝胶；流动相是各种溶剂。被分离混合物由流动 相液体推动进入色谱柱。根据各组分在固定相及流动相中的 吸附能力、分配系数、离子交换作用或分子尺寸大小的差异 进行分离。色谱分离的实质是样品分子（以下称溶质）与溶
分子筛及聚酰胺等。非极性吸附剂最常见的是活性炭。 极性吸附剂可进一步分为酸性吸附剂和碱性吸附剂。酸性
吸附剂包括硅胶和硅酸镁等，碱性吸附剂有氧化铝、氧化
21
第四节 液—固色谱法
镁和聚酰胺等。酸性吸附剂适于分离碱，如脂肪胺和芳香胺。 碱性吸附剂则适于分离酸性溶质，如酚、羧和吡咯衍生物等。
各种吸附剂中，最常用的吸附剂是硅胶，其次是氧化铝。
5
第一节 概 述
等，作为分析时选择余地大；而气相色谱并不可 能的。
③ 液相色谱通常在室温下操作，较低的温度，一般 有利于色谱分离条件的选择。 （3）由于液体的扩散性比气体的小105倍，因此，溶质 在液相中的传质速率慢，柱外效应就显得特别重要；而 在气相色谱中，柱外区域扩张可以忽略不计。 （4）液相色谱中制备样品简单，回收样品也比较容易， 而且回收是定量的，适合于大量制备。但液相色谱尚缺 乏通用的检测器，仪器比较复杂，价格昂贵。在实际应 用中，这两种色谱技术是互相补充的。
所用的固定相柱效低，分析周期长。而现代液相色谱法引用 了气相色谱的理论，流动相改为高压输送（最高输送压力可 达4.9107Pa）;谱（每米塔板数可达几 万或几十万）；同时柱后连有高灵敏度的检测器，可对流
1
第一节 概 述
出物进行连续检测。因此，高效液相色谱具有分析速度快、 分离效能高、自动化等特点。所以人们称它为高压、高速、 高效或现代液相色谱法。
相和流动相组成。液相色谱的固定相可以是吸附剂、化学键 合固定相（或在惰性载体表面涂上一层液膜）、离子交换树 脂或多孔性凝胶；流动相是各种溶剂。被分离混合物由流动 相液体推动进入色谱柱。根据各组分在固定相及流动相中的 吸附能力、分配系数、离子交换作用或分子尺寸大小的差异 进行分离。色谱分离的实质是样品分子（以下称溶质）与溶
分子筛及聚酰胺等。非极性吸附剂最常见的是活性炭。 极性吸附剂可进一步分为酸性吸附剂和碱性吸附剂。酸性
吸附剂包括硅胶和硅酸镁等，碱性吸附剂有氧化铝、氧化
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第四节 液—固色谱法
镁和聚酰胺等。酸性吸附剂适于分离碱，如脂肪胺和芳香胺。 碱性吸附剂则适于分离酸性溶质，如酚、羧和吡咯衍生物等。
各种吸附剂中，最常用的吸附剂是硅胶，其次是氧化铝。
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第一节 概 述
等，作为分析时选择余地大；而气相色谱并不可 能的。
③ 液相色谱通常在室温下操作，较低的温度，一般 有利于色谱分离条件的选择。 （3）由于液体的扩散性比气体的小105倍，因此，溶质 在液相中的传质速率慢，柱外效应就显得特别重要；而 在气相色谱中，柱外区域扩张可以忽略不计。 （4）液相色谱中制备样品简单，回收样品也比较容易， 而且回收是定量的，适合于大量制备。但液相色谱尚缺 乏通用的检测器，仪器比较复杂，价格昂贵。在实际应 用中，这两种色谱技术是互相补充的。
所用的固定相柱效低，分析周期长。而现代液相色谱法引用 了气相色谱的理论，流动相改为高压输送（最高输送压力可 达4.9107Pa）;谱（每米塔板数可达几 万或几十万）；同时柱后连有高灵敏度的检测器，可对流
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第一节 概 述
出物进行连续检测。因此，高效液相色谱具有分析速度快、 分离效能高、自动化等特点。所以人们称它为高压、高速、 高效或现代液相色谱法。
waters-e高效液相色谱ppt课件
4.使用缓冲溶液时，做完样品后应立即用甲醇水溶液冲洗。 5.长时间不用仪器，应该将柱子取下用堵头封好保存，注意不能用纯水冲洗及
保存柱子，而应该用有机相(如甲醇等)，因为纯水极性太强且易长霉。 。 6.开机时，流速和柱压要逐渐增加。 7.要注意柱子的PH值范围，不得注射强酸强碱的样品，特别是碱性样品。
流动相流出检测器可被送至废液瓶，或按需被收集。 当流动相含有一个分开的化合物谱带，高效液相色谱可以收集含有纯
化的化合物的该洗脱组分，用于进一步分析。
注意高压管路和附件用来连接泵、进样器、色谱柱和检测器单元，形 成流动相、样品和化合物分离谱带的通路。
高 检将效测电器信液连号相接转计换色算为谱机色数谱如据图站 ，何在，工显高示效作屏液上相展色现谱出系来统。单元先记录电信号，再
液相色谱的基本流程图
流动相
进样阀 泵
色谱柱
泵输液 进样
分离
检测器
检测
AB C
DE
G
F
记录
液 液相相流色色动谱谱相实：的验种所类各需及的部配基比分本，参示等数度-意-或亦梯图称度色谱条件
固定相：色谱柱类型及内径、长短 流动相输送系统参数：流速 检测器参数：紫外检测波长，灵敏度等 温度控制 进样量
四元梯度洗脱的溶剂输送动进样系统 柱温箱 液晶显示器 内置的柱塞杆密封垫清洗系统 溶剂瓶托盘 键盘用户界面及软盘驱动器
打开电源至on位置，开机依次接通 2695 分离单元、检测
2器开、机计算机和打印机的电源。接通后，约 20s 仪器开始自
检，约 1min 后，显示主屏幕，此时继续各部件的初始化。
溶 流【剂动M管相en理脱u/气系St确a统tu认s的所】有，准溶进备剂入管“路St都at充us满（溶1 剂），”按屏幕
保存柱子，而应该用有机相(如甲醇等)，因为纯水极性太强且易长霉。 。 6.开机时，流速和柱压要逐渐增加。 7.要注意柱子的PH值范围，不得注射强酸强碱的样品，特别是碱性样品。
流动相流出检测器可被送至废液瓶，或按需被收集。 当流动相含有一个分开的化合物谱带，高效液相色谱可以收集含有纯
化的化合物的该洗脱组分，用于进一步分析。
注意高压管路和附件用来连接泵、进样器、色谱柱和检测器单元，形 成流动相、样品和化合物分离谱带的通路。
高 检将效测电器信液连号相接转计换色算为谱机色数谱如据图站 ，何在，工显高示效作屏液上相展色现谱出系来统。单元先记录电信号，再
液相色谱的基本流程图
流动相
进样阀 泵
色谱柱
泵输液 进样
分离
检测器
检测
AB C
DE
G
F
记录
液 液相相流色色动谱谱相实：的验种所类各需及的部配基比分本，参示等数度-意-或亦梯图称度色谱条件
固定相：色谱柱类型及内径、长短 流动相输送系统参数：流速 检测器参数：紫外检测波长，灵敏度等 温度控制 进样量
四元梯度洗脱的溶剂输送动进样系统 柱温箱 液晶显示器 内置的柱塞杆密封垫清洗系统 溶剂瓶托盘 键盘用户界面及软盘驱动器
打开电源至on位置，开机依次接通 2695 分离单元、检测
2器开、机计算机和打印机的电源。接通后，约 20s 仪器开始自
检，约 1min 后，显示主屏幕，此时继续各部件的初始化。
溶 流【剂动M管相en理脱u/气系St确a统tu认s的所】有，准溶进备剂入管“路St都at充us满（溶1 剂），”按屏幕
《液相色谱技术》课件
通过液相色谱技术，可以检测环境中的有毒有害物质，如农药、酚类等，为环境治理和保护提供科学依据。
生态毒理学研究
液相色谱技术可以用于研究环境污染物对生物体的毒理学效应，有助于了解环境污染对生态系统的危害。
液相色谱技术的未来发展与挑战
高效液相色谱法（HPLC）
HPLC是液相色谱技术中的一种，具有高分离效能、高灵敏度、高选择性等优点，被广泛应用于生物医药、环境监测、食品安全等领域。随着技术的不断发展，HPLC的分离柱、检测器等关键部件也在不断改进，提高了分离效果和检测灵敏度。
智能化与自动化：随着机器人技术和自动化控制技术的发展，液相色谱技术的操作将更加智能化和自动化。未来的液相色谱仪将更加便捷、高效，能够实现自动化进样、自动优化分离条件等功能，大大提高分析效率。
感谢观看
THANKS
流动相的准备与更换
根据实验要求，准备好适量的流动相，并定期更换以保证实验结果的准确性。
定期清洗进样器、色谱柱和检测器，保持仪器表面清洁。
日常保养
定期校准
常见故障排除
对仪器进行定期校准，确保检测结果的准确性。
遇到问题时，应先检查电源、管线连接等基本情况，再根据仪器手册排查故障。
03
02
01
液相色谱技术的实验设计
色谱柱
检测色谱柱流出的组分，并将其转化为电信号，便于记录和检测。
检测器
用于采集、处理、分析和存储色谱数据。
数据处理系统
数据处理与分析
采集色谱数据，进行峰识别、定量和合适的流速、检测波长等参数，开始色谱分离。
进样
将样品注入进样器，设定进样量，启动进样程序。
准备工作
检查仪器是否正常，准备好流动相、色谱柱和样品。
样品前处理的挑战：液相色谱技术对于样品的要求较高，需要进行适当的前处理以去除杂质、提高分离效果。目前常用的样品前处理方法包括沉淀、萃取、吸附等，但这些方法操作繁琐、耗时长且效果不稳定。为解决这一问题，新型的样品前处理技术如固相萃取、免疫吸附等正在不断发展，以提高样品处理的效率和效果。
生态毒理学研究
液相色谱技术可以用于研究环境污染物对生物体的毒理学效应，有助于了解环境污染对生态系统的危害。
液相色谱技术的未来发展与挑战
高效液相色谱法（HPLC）
HPLC是液相色谱技术中的一种，具有高分离效能、高灵敏度、高选择性等优点，被广泛应用于生物医药、环境监测、食品安全等领域。随着技术的不断发展，HPLC的分离柱、检测器等关键部件也在不断改进，提高了分离效果和检测灵敏度。
智能化与自动化：随着机器人技术和自动化控制技术的发展，液相色谱技术的操作将更加智能化和自动化。未来的液相色谱仪将更加便捷、高效，能够实现自动化进样、自动优化分离条件等功能，大大提高分析效率。
感谢观看
THANKS
流动相的准备与更换
根据实验要求，准备好适量的流动相，并定期更换以保证实验结果的准确性。
定期清洗进样器、色谱柱和检测器，保持仪器表面清洁。
日常保养
定期校准
常见故障排除
对仪器进行定期校准，确保检测结果的准确性。
遇到问题时，应先检查电源、管线连接等基本情况，再根据仪器手册排查故障。
03
02
01
液相色谱技术的实验设计
色谱柱
检测色谱柱流出的组分，并将其转化为电信号，便于记录和检测。
检测器
用于采集、处理、分析和存储色谱数据。
数据处理系统
数据处理与分析
采集色谱数据，进行峰识别、定量和合适的流速、检测波长等参数，开始色谱分离。
进样
将样品注入进样器，设定进样量，启动进样程序。
准备工作
检查仪器是否正常，准备好流动相、色谱柱和样品。
样品前处理的挑战：液相色谱技术对于样品的要求较高，需要进行适当的前处理以去除杂质、提高分离效果。目前常用的样品前处理方法包括沉淀、萃取、吸附等，但这些方法操作繁琐、耗时长且效果不稳定。为解决这一问题，新型的样品前处理技术如固相萃取、免疫吸附等正在不断发展，以提高样品处理的效率和效果。
液相色谱柱的应用-PPT
—H2O”，由于乙腈的毒性大，价格贵，通常优先考虑
“甲醇—H2O”流动相。
2. 正相色谱常用的流动相及其冲洗强度的顺序是：
正己烷＜乙醚＜乙酸乙酯＜异丙醇
最常用的是正已烷，
不同混合溶剂的粘度比较
柱填料基质
高pH下, 硅胶会溶解
低pH下, 键合相会断裂
化学修饰困难
孔结构复杂, 孔径不均匀，
导致柱效不够高, 有机溶剂
衡状态, 对于梯度淋洗尤为重要
孔径 --- 对色谱分离的影响
大孔的填料颗粒可以延长溶质大分子在填
料表面滞留的时间, 达到充分分离, 改善
峰形
样品 MW 2, 000, 选择 100Å 的孔径
样品 MW > 2, 000, 选择 300Å 的孔径
比表面积的比较
比表面积与孔径的影响
大孔径填料适用于大分子分析
移动速率不一样，从而产生色谱分离。
(必要条件)
分配过程
分配系数 - K
K=
CS
Cm
K= 常数
（T恒定）
Cm =组分在流动相中的浓度
Cs = 组分在固定相中的浓度
容量因子k
是指在一定条件下，组分在两相间达到分配平衡时的质量比。
在实际工作中，常应用另一表征色谱分配平衡过程的重要参数——
容量因子(capacity factor)，也称分配比(partition ratio)，以 k 表示。
色谱柱的构造
柱填料：
液相色谱柱的分离作用是在填料与流动相之
间进行的，柱子的分类是依据填料类型而定。常用
颗粒粒径在3—10 µm的范围内。
正相柱：多以硅胶为柱填料。另一类正相填料是
硅胶表面键合—CN，-NH2等官能团即所谓的键合
“甲醇—H2O”流动相。
2. 正相色谱常用的流动相及其冲洗强度的顺序是：
正己烷＜乙醚＜乙酸乙酯＜异丙醇
最常用的是正已烷，
不同混合溶剂的粘度比较
柱填料基质
高pH下, 硅胶会溶解
低pH下, 键合相会断裂
化学修饰困难
孔结构复杂, 孔径不均匀，
导致柱效不够高, 有机溶剂
衡状态, 对于梯度淋洗尤为重要
孔径 --- 对色谱分离的影响
大孔的填料颗粒可以延长溶质大分子在填
料表面滞留的时间, 达到充分分离, 改善
峰形
样品 MW 2, 000, 选择 100Å 的孔径
样品 MW > 2, 000, 选择 300Å 的孔径
比表面积的比较
比表面积与孔径的影响
大孔径填料适用于大分子分析
移动速率不一样，从而产生色谱分离。
(必要条件)
分配过程
分配系数 - K
K=
CS
Cm
K= 常数
（T恒定）
Cm =组分在流动相中的浓度
Cs = 组分在固定相中的浓度
容量因子k
是指在一定条件下，组分在两相间达到分配平衡时的质量比。
在实际工作中，常应用另一表征色谱分配平衡过程的重要参数——
容量因子(capacity factor)，也称分配比(partition ratio)，以 k 表示。
色谱柱的构造
柱填料：
液相色谱柱的分离作用是在填料与流动相之
间进行的，柱子的分类是依据填料类型而定。常用
颗粒粒径在3—10 µm的范围内。
正相柱：多以硅胶为柱填料。另一类正相填料是
硅胶表面键合—CN，-NH2等官能团即所谓的键合
高效液相色谱操作步骤ppt课件
2：冲洗进样系统
a:清洗手动进样阀，将手动进样阀的扳手逆时针扳 到头，用一次性平头微量注p射pt课器件完吸整 入2~4ml的50%甲 14
十二：关机
依次关闭检测器的氘灯 将高压泵的流速降为“0” 关闭检测器开关 关闭高压泵开关 关闭仪器色谱工作站 关闭检测器电源开关 关闭高压泵电源开关 关闭柱温箱电源开关 关闭电脑开关 关闭稳压电源开关 并在仪器使用登记本上记录p环pt课境件完温整 度、湿度、仪器工 15
分析速度快等。
拧紧色谱柱的接口
ppt课件完整
6
四：放置流动相
1：将储存流动相的贮 2：更换仪器泵头里清 液瓶放置于贮液瓶架上 洗瓶中的超纯水（以确 保仪器外回路系统清洁 和良好的工作状态）
清洗瓶
ppt课件完整
7
五：开机
依次打开： 稳压器 柱温箱 高压泵 检测器 计算机电源开关
ppt课件完整
2：设定分析方法的方
法文件（文件名称，表
示浓度的单位）
3：设定样品分析表
简（而标言准之名称：、软测件定的次各数种、设置；繁杂但不复杂
样品名称、编号）
ppt课件完整
11
九：进样分析
1：启动设置程序文件、 设定分析方法的方法文 件、设定样品分析表按 照样品分析表的顺序， 用平头微量注射器将经 过0.45um滤膜过滤的标 准溶液和样品溶液逐次 注入六通进样阀中，
头）进入高效液相色谱 用一次性注射器和一次
仪样品液都必须经过样 性滤头过滤后，加入2ml
品过滤装置过滤
具塞试管中备用。
一次性滤头：由机系、水系组成；
滤膜的孔径为0.45um
ppt课件完整
5
三：色谱柱的连接
将色谱柱按流动相流动 方向即色谱柱标示箭头
a:清洗手动进样阀，将手动进样阀的扳手逆时针扳 到头，用一次性平头微量注p射pt课器件完吸整 入2~4ml的50%甲 14
十二：关机
依次关闭检测器的氘灯 将高压泵的流速降为“0” 关闭检测器开关 关闭高压泵开关 关闭仪器色谱工作站 关闭检测器电源开关 关闭高压泵电源开关 关闭柱温箱电源开关 关闭电脑开关 关闭稳压电源开关 并在仪器使用登记本上记录p环pt课境件完温整 度、湿度、仪器工 15
分析速度快等。
拧紧色谱柱的接口
ppt课件完整
6
四：放置流动相
1：将储存流动相的贮 2：更换仪器泵头里清 液瓶放置于贮液瓶架上 洗瓶中的超纯水（以确 保仪器外回路系统清洁 和良好的工作状态）
清洗瓶
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五：开机
依次打开： 稳压器 柱温箱 高压泵 检测器 计算机电源开关
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2：设定分析方法的方
法文件（文件名称，表
示浓度的单位）
3：设定样品分析表
简（而标言准之名称：、软测件定的次各数种、设置；繁杂但不复杂
样品名称、编号）
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九：进样分析
1：启动设置程序文件、 设定分析方法的方法文 件、设定样品分析表按 照样品分析表的顺序， 用平头微量注射器将经 过0.45um滤膜过滤的标 准溶液和样品溶液逐次 注入六通进样阀中，
头）进入高效液相色谱 用一次性注射器和一次
仪样品液都必须经过样 性滤头过滤后，加入2ml
品过滤装置过滤
具塞试管中备用。
一次性滤头：由机系、水系组成；
滤膜的孔径为0.45um
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三：色谱柱的连接
将色谱柱按流动相流动 方向即色谱柱标示箭头
色谱柱原理及使用ppt课件
（3）再将色谱柱正向连接，不接检测器。用水-有机相（90：10～95:5），以0.3～ 0.6ml/min流速冲洗20～30min。（目的是冲洗出柱出口端无机杂物与筛板孔杂物， 使筛板正常）
（4）连接检测器，开启柱温达30℃～40℃，用水-有机相（90：10～ 95:5），以0.3～0.6ml/min流速冲洗4h以上。（目的是充饱和色谱柱，去 除柱内空气） （5）用水-有机相（10：90～5:95），以0.3～0.6ml/min流速冲洗2h以上 [或在120min内以水-有机相（95:5→0:100）梯度变化，以0.3～ 0.6ml/min流速冲洗]→再用100%有机溶剂，以0.3～0.6ml/min流速冲洗 1h以上→最后用100%有机溶剂，以1ml/min流速冲洗1h以上。（目的是 老化色谱柱） （6）在平衡前根据水相-有机相的比例，首先调整水-有机相的比例接近流 动相水相-有机相的比例，以1ml/min流速冲洗30左右（目的是相平衡过 渡）。如果流动相中含有缓冲盐，决不可在柱老化后立即用流动相平衡， 必需先用90%以上水进行预平衡30min以上，否则，会导致缓冲盐在柱内 析出结晶，严重时会将新柱永久不可逆地损坏。
+
色谱柱原理及使用
பைடு நூலகம்
+
1.2 液相色谱柱的结构及其主要功能
液相色谱柱由柱管、压帽、卡套（密封环）、筛板（滤
片）、接头、螺丝（封头）与柱填料等组成。
柱管：多用不锈钢制成，若果使用时柱压不高于70 kg/cm2时， 也可采用厚壁玻璃或石英管，管内壁要求有很高的光洁度。用 于柱填料的装填。 压帽：即色谱柱两端套合于柱管端外壁的塑性圆柱帽，中部有
小孔，多为聚四氟乙烯制成，用于固定筛板。
密封环：位于接头螺旋环内壁的弹性环，多为聚四氟乙烯制成， 用于色谱柱两端压帽与柱外壁的密封。
（4）连接检测器，开启柱温达30℃～40℃，用水-有机相（90：10～ 95:5），以0.3～0.6ml/min流速冲洗4h以上。（目的是充饱和色谱柱，去 除柱内空气） （5）用水-有机相（10：90～5:95），以0.3～0.6ml/min流速冲洗2h以上 [或在120min内以水-有机相（95:5→0:100）梯度变化，以0.3～ 0.6ml/min流速冲洗]→再用100%有机溶剂，以0.3～0.6ml/min流速冲洗 1h以上→最后用100%有机溶剂，以1ml/min流速冲洗1h以上。（目的是 老化色谱柱） （6）在平衡前根据水相-有机相的比例，首先调整水-有机相的比例接近流 动相水相-有机相的比例，以1ml/min流速冲洗30左右（目的是相平衡过 渡）。如果流动相中含有缓冲盐，决不可在柱老化后立即用流动相平衡， 必需先用90%以上水进行预平衡30min以上，否则，会导致缓冲盐在柱内 析出结晶，严重时会将新柱永久不可逆地损坏。
+
色谱柱原理及使用
பைடு நூலகம்
+
1.2 液相色谱柱的结构及其主要功能
液相色谱柱由柱管、压帽、卡套（密封环）、筛板（滤
片）、接头、螺丝（封头）与柱填料等组成。
柱管：多用不锈钢制成，若果使用时柱压不高于70 kg/cm2时， 也可采用厚壁玻璃或石英管，管内壁要求有很高的光洁度。用 于柱填料的装填。 压帽：即色谱柱两端套合于柱管端外壁的塑性圆柱帽，中部有
小孔，多为聚四氟乙烯制成，用于固定筛板。
密封环：位于接头螺旋环内壁的弹性环，多为聚四氟乙烯制成， 用于色谱柱两端压帽与柱外壁的密封。
液相色谱柱的应用PPT学习课件
二、色谱柱的结构和安装
液相色谱柱的应用
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色谱柱的构造
.色谱柱管
常用内壁抛光的不锈钢管作色谱柱的柱管以获 得高柱效。使用前柱管先用氯仿、甲醇、水依次清洗， 再用50%的HNO3对柱内壁作钝化处理。钝化时使用 HNO3在柱管内至少滞留10min，以在内壁形成钝化 的氧化物涂层。
k = Ms / Mm Ms为组分在固定相中的质量， Mm为组分在流动相中的质量
k tR t0 t0
由保留时间计算出容量因子，即可由实验测定容量因子k
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色谱理论：塔板理论--柱分离效能指标
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色谱理论：速率理论--影响柱效的因素
速率理论是荷兰学者范·弟姆特于1956年
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色谱连接注意事项
1.尽量减少死体积
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连接管线与接头
色谱柱规格
内径：常用4.6mm，2.1mm
柱长：常用50，100，150，250cm
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色谱柱的构造
色谱柱管由柱接头、柱管及滤片组装而成。 柱接头采用低死体积结构，柱接头两端是
螺纹组件连接，中间放置压环用于密封。为了尽 量减少柱外死体积，在安装色谱柱时，用 Φ1.57mm连接管通过空心螺钉压环后要尽量插 到底，然后再拧紧空心螺钉。
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样品组分的分离
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液相色谱的基本流程图
流动相
进样阀 泵
色谱柱
检测器
AB C
DE
G
液相色谱基本原理与应用ppt课件
一、液相色谱定义
高效液相色谱是在经典液相色谱基础上， 引入了气相色谱的理论，在技术上采用了 高压泵、高效固定相和高灵敏度检测器， 因而具备速度快、效率高、灵敏度高、操 作自动化的特点。
病原体侵入机体，消弱机体防御机能 ，破坏 机体内 环境的 相对稳 定性， 且在一 定部位 生长繁 殖，引 起不同 程度的 病理生 理过程
三、HPLC在各领域的主要应用
• 环境：常见多环芳烃、多氯联苯、硝基化 合物、酚类化合物、邻苯二甲酸脂、有机 农药等。
• 农业：土壤矿物成分、肥料、饲料添加剂、 茶叶等农产品中无机和有机成分等。
• 食品：有机酸、氨基酸、糖、维生素、脂 肪酸、香料、甜味剂、防腐剂、人工色素、 病原微生物、霉菌毒素、多核芳烃等。
病原体侵入机体，消弱机体防御机能 ，破坏 机体内 环境的 相对稳 定性， 且在一 定部位 生长繁 殖，引 起不同 程度的 病理生 理过程
病原体侵入机体，消弱机体防御机能 ，破坏 机体内 环境的 相对稳 定性， 且在一 定部位 生长繁 殖，引 起不同 程度的 病理生 理过程
病原体侵入机体，消弱机体防御机能 ，破坏 机体内 环境的 相对稳 定性， 且在一 定部位 生长繁 殖，引 起不同 程度的 病理生 理过程
多环芳烃标准品色谱图
mV 900
萘 苊
800
700
600
二 苯 并a，h蒽 苯 并g，h，i苝 茚 苯1，2，3-cd苝
苯 并a蒽 屈 苯 并b荧 蒽 苯 并k荧 蒽 苯 并a芘
500
荧蒽
苊烯
400
芴 菲
蒽 芘
300
200
100
0
3 -100
6
9
12
15
18
高效液相色谱是在经典液相色谱基础上， 引入了气相色谱的理论，在技术上采用了 高压泵、高效固定相和高灵敏度检测器， 因而具备速度快、效率高、灵敏度高、操 作自动化的特点。
病原体侵入机体，消弱机体防御机能 ，破坏 机体内 环境的 相对稳 定性， 且在一 定部位 生长繁 殖，引 起不同 程度的 病理生 理过程
三、HPLC在各领域的主要应用
• 环境：常见多环芳烃、多氯联苯、硝基化 合物、酚类化合物、邻苯二甲酸脂、有机 农药等。
• 农业：土壤矿物成分、肥料、饲料添加剂、 茶叶等农产品中无机和有机成分等。
• 食品：有机酸、氨基酸、糖、维生素、脂 肪酸、香料、甜味剂、防腐剂、人工色素、 病原微生物、霉菌毒素、多核芳烃等。
病原体侵入机体，消弱机体防御机能 ，破坏 机体内 环境的 相对稳 定性， 且在一 定部位 生长繁 殖，引 起不同 程度的 病理生 理过程
病原体侵入机体，消弱机体防御机能 ，破坏 机体内 环境的 相对稳 定性， 且在一 定部位 生长繁 殖，引 起不同 程度的 病理生 理过程
病原体侵入机体，消弱机体防御机能 ，破坏 机体内 环境的 相对稳 定性， 且在一 定部位 生长繁 殖，引 起不同 程度的 病理生 理过程
多环芳烃标准品色谱图
mV 900
萘 苊
800
700
600
二 苯 并a，h蒽 苯 并g，h，i苝 茚 苯1，2，3-cd苝
苯 并a蒽 屈 苯 并b荧 蒽 苯 并k荧 蒽 苯 并a芘
500
荧蒽
苊烯
400
芴 菲
蒽 芘
300
200
100
0
3 -100
6
9
12
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气相色谱仪和液相色谱仪的使用ppt课件
（动画）
2.色谱法分类
气相色谱：流动相为气体（称为载气）。
按分离柱不同可分为：填充柱色谱和毛细管柱色谱；
按固定相的不同又分为：气固色谱和气液色谱
液相色谱
液相色谱：流动相为液体（也称为淋洗液）。 按固定相的不同分为：液固色谱和液液色谱。 离子色谱：液相色谱的一种，以特制的离子交换树脂为固 定相，不同pH值的水溶液为流动相。
(2) 梯度淋洗装置
外梯度:
利用两台高压输液泵， 将两种不同极性的溶剂按一 定的比例送入梯度混合室， 混合后进入色谱柱。
内梯度:
一台高压泵, 通过比例 调节阀,将两种或多种不同 极性的溶剂按一定的比例抽 入高压泵中混合。
(3) 进样装置
流路中为高压力工作状态，
通常使用耐高压的六通阀进样装置，
其结构如图所示：
2. 固定相及分离柱
气相色谱中的固定液原则上都可以用于液相色谱，其 选用原则与气相色谱一样。
选择合适的固定相，降低填料粒度可显著提高柱效， 但在高效液相色谱中，分离柱的制备是一项技术要求非常 高的工作，一般很少自行制备。
选择短柱、细内径提高分析速度；
研制高效柱填料是一活跃领域。
3. 流动相及流动相的极性
分配系数 K
组分在固定相和流动相间发生的吸附、脱附，或溶解、 挥发的过程叫做分配过程。在一定温度下，组分在两相间 分配达到平衡时的浓度（单位：g / mL）比，称为分配系数， 用K 表示，即：
组分在固定相中的浓度 K 组分在流动相中的浓度
分配系数 K的讨论
组分在固定相中的浓度 K 组分在流动相中的浓度
分在称之为色谱分离柱中的两相间不断进行着的 分配过程。
其中的一相固定不动，称为固定相； 另一相是携带试样混合物流过此固定相的 流体（气体或液体），称为流动相。
2.色谱法分类
气相色谱：流动相为气体（称为载气）。
按分离柱不同可分为：填充柱色谱和毛细管柱色谱；
按固定相的不同又分为：气固色谱和气液色谱
液相色谱
液相色谱：流动相为液体（也称为淋洗液）。 按固定相的不同分为：液固色谱和液液色谱。 离子色谱：液相色谱的一种，以特制的离子交换树脂为固 定相，不同pH值的水溶液为流动相。
(2) 梯度淋洗装置
外梯度:
利用两台高压输液泵， 将两种不同极性的溶剂按一 定的比例送入梯度混合室， 混合后进入色谱柱。
内梯度:
一台高压泵, 通过比例 调节阀,将两种或多种不同 极性的溶剂按一定的比例抽 入高压泵中混合。
(3) 进样装置
流路中为高压力工作状态，
通常使用耐高压的六通阀进样装置，
其结构如图所示：
2. 固定相及分离柱
气相色谱中的固定液原则上都可以用于液相色谱，其 选用原则与气相色谱一样。
选择合适的固定相，降低填料粒度可显著提高柱效， 但在高效液相色谱中，分离柱的制备是一项技术要求非常 高的工作，一般很少自行制备。
选择短柱、细内径提高分析速度；
研制高效柱填料是一活跃领域。
3. 流动相及流动相的极性
分配系数 K
组分在固定相和流动相间发生的吸附、脱附，或溶解、 挥发的过程叫做分配过程。在一定温度下，组分在两相间 分配达到平衡时的浓度（单位：g / mL）比，称为分配系数， 用K 表示，即：
组分在固定相中的浓度 K 组分在流动相中的浓度
分配系数 K的讨论
组分在固定相中的浓度 K 组分在流动相中的浓度
分在称之为色谱分离柱中的两相间不断进行着的 分配过程。
其中的一相固定不动，称为固定相； 另一相是携带试样混合物流过此固定相的 流体（气体或液体），称为流动相。
《液相色谱》幻灯片PPT
思考题：
1.正相色谱 2.反相色谱 3.化学键和固定相 4.洗脱剂及其作用
离子对色谱
强极性有机酸、有机碱的别离分析
将一种〔或多种〕与溶质离子电荷相反的离子〔对离子或反离子〕加到流动 相中使其与溶质离子结合形成疏水性离子对化合物，使其能够在两相之间进 展分配；
阴离子别离：常采用烷基铵类，如氢氧化四丁基铵或氢氧化十六烷基三甲铵 作为对离子；
〔2〕亲水性固定液常采用疏水性流动 相，即流动相的极性小于固定相的极性，称 为正相液液色谱法，极性柱也称正相柱。
〔3〕假设流动相的极性大于固定液的
2. 流动相类别
按流动相组成分：单组分和多组分； 按极性分：极性、弱极性、非极性； 按使用方式分：固定组成淋洗和梯度淋洗。 常用溶剂： 己烷、四氯化碳、甲苯、乙酸乙酯、乙醇 、乙腈、水。 采用二元或多元组合溶剂作为流动相可以灵活调节流动 相的极性或增加选择性，以改进别离或调整出峰时间。
一、液相色谱固定相
stationary phase of HPLC
二、液相色谱流动相
mobile phase of HPLC
一、液相色谱固定相 stationary phases of LC
1. 液-液色谱及键合相色谱固定相
〔1〕全多孔型担体
由氧化硅、氧化铝、硅藻土等制成的多孔球
体；早期采用100μm的大颗粒，外表涂渍固定液，
薄壳键合型；微粒硅胶 键合型〔键合离子交换基团〕
树脂类别： 〔1〕 阳离子交换树脂〔强酸 性、弱酸性〕 〔2〕 阴离子交换树脂〔强碱 性、弱碱性〕
4. 空间排阻别离固定相
〔1〕软质凝胶 葡聚糖凝胶、琼脂凝胶等。多孔网状构造； 水为流动相。适用于常压排阻别离。
〔2〕半硬质凝胶 苯乙烯-二乙烯基苯交联共聚物，有机凝胶； 非极性有机溶剂为流动相，不能用丙酮、乙醇等极性溶剂
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ppt课件
色谱连接注意事项
1.尽量减少死体积
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ppt课件
连接管线与接头
1
10 mL 柱外体积
样品:
1
1. 苯丙胺酸
50 mL 柱外体积（管线） 2. 5-苯基-3, 6-二氧-2-哌嗪乙酸
3. Asp-Phe
4. 天冬甜素
3 2
4
3 2
4
0.0
0.5 1.0 1.5 2.0
Time (min)
16
ppt课件
色谱柱的构造
色谱柱管由柱接头、柱管及滤片组装而成。 柱接头采用低死体积结构，柱接头两端是
螺纹组件连接，中间放置压环用于密封。为了尽 量减少柱外死体积，在安装色谱柱时，用 Φ1.57mm连接管通过空心螺钉压环后要尽量插 到底，然后再拧紧空心螺钉。
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ppt课件
色谱柱子的构造
不同厂家和型号的柱 子会有一定的差别
连接管通过空心螺钉、压环后尽量用力 插到底，然后顺时针拧紧空心螺钉，直到拧不 动为止。
如色谱柱通过流动相加压后有漏液现象， 请用扳手继续顺时针拧1／4圈，直至不漏液 为止。
22
ppt课件
连接接管必须注意：
螺母坡度不匹配，密封性差
如果伸出的管线长度过长，可能漏液
死体积区
如果伸出的管线长度不够，可能产生死体积
分离度：两个相邻组分的保留值之差与其平均 峰宽之比。
R=2（TR2-TR1）/（W2+W1） 计算表明：
1：R<0.8时，两组分不能完全分离 2：R=1时，两组分峰重叠约2%
3：R=1.5时，两组分峰完全分离。 R值越大分离越好，反之则峰重叠愈多。
降低柱温、增加柱长可使R提高。
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ppt课件
样品组分的分离
LOGO 高效液相色谱培训系列
液相色谱柱的应用
ppt课件
1
目
录
一、液相色谱分离原理
二、液相色谱柱的结构
三、液相色谱柱的色谱柱的维护
2
ppt课件
一、 HPLC分离原理
样品组分在流动相和固定相之间进行分配，
由于不同组分在流动相和固定相之间的交 互作用能力(吸附.分配.离子交换.分子尺 寸等)不同，使得不同组分在色谱柱上的 移动速率不一样，从而产生色谱分离。 (必要条件)
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ppt课件
液相色谱柱的构造
在两端柱接头内，柱管两端各放置一 片不锈钢滤片(或滤网)，用于封堵柱填料不 被流动相冲出柱外而流失。空柱各组件均为 不锈钢材质，能耐受一般的溶剂作用。但由 于含氯化物的溶剂对其有一定的腐蚀性，故 使用时要注意，柱及连接管内不能长时间存 留此类溶剂，以避免腐蚀。
19
ppt课件
15
ppt课件
色谱柱的构造
.色谱柱管
常用内壁抛光的不锈钢管作色谱柱的柱管以获 得高柱效。使用前柱管先用氯仿、甲醇、水依次清洗， 再用50%的HNO3对柱内壁作钝化处理。钝化时使用 HNO3在柱管内至少滞留10min，以在内壁形成钝化 的氧化物涂层。
色谱柱规格
内径：常用4.6mm，2.1mm
柱长：常用50，100，150，250cm
提出的, 表述了影响柱效的因素及提高柱效的多
种途径，其核心是速率方程（也称范·弟姆特方程
式）。
速率方程
H = A + B/u +C·u
H：理论塔板高度；
u：流动相的线速度
8
ppt课件
色谱理论：速率理论--影响柱效的因素
H = A + B/u +C·u
9
ppt课件
色谱理论：分离度
常用的其他的反相填料还有键合C8、C4、C2、 -NH2、苯基等。
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ppt课件
液相色谱柱的安装
色谱柱的安装： 拆开柱包装盒，确认色谱柱的类型、尺寸、
出厂日期以及柱内贮存的溶剂。
21
ppt课件
液相色谱柱的安装
按柱管上标示的流动相流向， (如条件允 许，建议在柱前使用保护柱)；柱的出口与检 测器连接。连接管是外径为1.57mm、内径 为0.1-0.3mm的链接管。
k = Ms / Mm Ms为组分在固定相中的质量， Mm为组分在流动相中的质量
k tR t0 t0
由保留时间计算出容量因子，即可由实验测定容量因子k
6
ppt课件
色谱理论：塔板理论--柱分离效能指标
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ppt课件
色谱理论：速率理论--影响柱效的因素
速率理论是荷兰学者范·弟姆特于1956年
27/10/2019
13
ppt课件13
高性能－UltiMate 3000 x2 三元梯度系统
独特的双梯度泵：两个三元 梯度泵封装在一个机箱内
有六通道脱气机的 溶剂架
带温控选项的自动 进样器
独特的柱温箱可放置两个柱 切换阀
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可变波长或二极管矩阵 紫外可见光检测器
ppt课件
二、色谱柱的结构和安装
液相色谱柱的应用
– 进样周期15 秒 – 进样阀耐压1000 bar
TCC-3000RS 柱温箱
– 5-110 °C 温度范围 – 柱后冷却
DAD-3000RS检测器
– 全波长扫描范围数据采集速率100 Hz
Acclaim® 2 µm色谱柱
– 耐压800 bar
Chromeleon® CMS软件及时获得结果
0.0 0.5 1.0 1.5
2.0
Time (min)
色谱柱: StableBond SB-C18,
色谱柱的构造
柱填料：
液相色谱柱的分离作用是在填料与流动相之 间进行的，柱子的分类是依据填料类型而定。常用 颗粒粒径在3—10 µm的范围内。
正相柱：多以硅胶为柱填料。另一类正相填料是 硅胶表面键合—CN，-NH2等官能团即所谓的键合 相硅胶。
反相柱：主要是以硅胶为基质，在其表面键合十 八烷基官能团(ODS)的非极性填料。
11
ppt课件
液相色谱的基本流程图
流动相
进样阀 泵
色谱柱
检测器
AB C
DE
G
F
泵输液 进样
分离
检测
12
记录
ppt课件
UltiMate 3000 RSLC 快速分离液相
HPG-3x00RS 泵
– 在整个流速范围下保持800 bar高压 – 最高流速达到5 ml/min
WPS-3000RS 自动进样器
3
ppt课件
分配过程
4
ppt课件
分配系数 - K
K= CS
Cm
K= 常数 （T恒定）
Cm =组分在流动相中的浓度 Cs = 组分在固定相中的浓度
5
ppt课件
容量因子k
是指在一定条件下，组分在两相间达到分配平衡时的质量比。 在实际工作中，常应用另一表征色谱分配平衡过程的重要参数—— 容量因子(capacity factor)，也称分配比(partition ratio)，以 k 表示。