液相色谱柱的应用 ppt课件
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LOGO 高效液相色谱培训系列
液相色谱柱的应用
ppt课件
1
目
录
一、液相色谱分离原理
二、液相色谱柱的结构
三、液相色谱柱的选择
四、色谱柱的使用
五、 分析条件的影响
六、色谱柱的维护
2
ppt课件
一、 HPLC分离原理
样品组分在流动相和固定相之间进行分配，
由于不同组分在流动相和固定相之间的交 互作用能力(吸附.分配.离子交换.分子尺 寸等)不同，使得不同组分在色谱柱上的 移动速率不一样，从而产生色谱分离。 (必要条件)
15
ppt课件
色谱柱的构造
.色谱柱管
常用内壁抛光的不锈钢管作色谱柱的柱管以获 得高柱效。使用前柱管先用氯仿、甲醇、水依次清洗， 再用50%的HNO3对柱内壁作钝化处理。钝化时使用 HNO3在柱管内至少滞留10min，以在内壁形成钝化 的氧化物涂层。
色谱柱规格
内径：常用4.6mm，2.1mm
柱长：常用50，100，150，250cm
3
ppt课件
分配过程
4
ppt课件
分配系数 - K
K= CS
Cm
K= 常数 （T恒定）
Cm =组分在流动相中的浓度 Cs = 组分在固定相中的浓度
5
ppt课件
容量因子k
是指在一定条件下，组分在两相间达到分配平衡时的质量比。 在实际工作中，常应用另一表征色谱分配平衡过程的重要参数—— 容量因子(capacity factor)，也称分配比(partition ratio)，以 k 表示。
k = Ms / Mm Ms为组分在固定相中的质量， Mm为组分在流动相中的质量
k tR t0 t0
由保留时间计算出容量因子，即可由实验测定容量因子k
6
ppt课件
色谱理论：塔板理论--柱分离效能指标
7
ppt课件
色谱理论：速率理论--影响柱效的因素
速率理论是荷兰学者范·弟姆特于1956年
连接管通过空心螺钉、压环后尽量用力 插到底，然后顺时针拧紧空心螺钉，直到拧不 动为止。
如色谱柱通过流动相加压后有漏液现象， 请用扳手继续顺时针拧1／4圈，直至不漏液 为止。
22
ppt课件
连接接管必须注意：
螺母坡度不匹配，密封性差
如果伸出的管线长度过长，可能漏液
死体积区
如果伸出的管线长度不够，可能产生死体积
色谱柱的构造
柱填料：
液相色谱柱的分离作用是在填料与流动相之 间进行的，柱子的分类是依据填料类型而定。常用 颗粒粒径在3—10 µm的范围内。
正相柱：多以硅胶为柱填料。另一类正相填料是 硅胶表面键合—CN，-NH2等官能团即所谓的键合 相硅胶。
反相柱：主要是以硅胶为基质，在其表面键合十 八烷基官能团(ODS)的非极性填料。
0.0 0.5 1.0 1.5
2.0
Time (min)
色谱柱: StableBond SB-C18,
18
ppt课件
液相色谱柱的构造
在两端柱接头内，柱管两端各放置一 片不锈钢滤片(或滤网)，用于封堵柱填料不 被流动相冲出柱外而流失。空柱各组件均为 不锈钢材质，能耐受一般的溶剂作用。但由 于含氯化物的溶剂对其有一定的腐蚀性，故 使用时要注意，柱及连接管内不能长时间存 留此类溶剂，以避免腐蚀。
19
ppt课件
27/10/2019
13
ppt课件13
高性能－UltiMate 3000 x2 三元梯度系统
独特的双梯度泵：两个三元 梯度泵封装在一个机箱内
有六通道脱气机的 溶剂架
带温控选项的自动 进样器
独特的柱温箱可放置两个柱 切换阀
14
可变波长或二极管矩阵 紫外可见光检测器
ppt课件
二、色谱柱的结构和安装
液相色谱柱的应用
– 进样周期15 秒 – 进样阀耐压1000 bar
TCC-3000RS 柱温箱
– 5-110 °C 温度范围 – 柱后冷却
DAD-3000RS检测器
– 全波长扫描范围数据采集速率100 Hz
Acclaim® 2 µm色谱柱
– 耐压800 bar
Chromeleon® CMS软件及时获得结果
11
ppt课件
液相色谱的基本流程图
流动相
进样阀 泵
色谱柱
检测器
AB C
DE
G
F
泵输液 进样Hale Waihona Puke Baidu
分离
检测
12
记录
ppt课件
UltiMate 3000 RSLC 快速分离液相
HPG-3x00RS 泵
– 在整个流速范围下保持800 bar高压 – 最高流速达到5 ml/min
WPS-3000RS 自动进样器
提出的, 表述了影响柱效的因素及提高柱效的多
种途径，其核心是速率方程（也称范·弟姆特方程
式）。
速率方程
H = A + B/u +C·u
H：理论塔板高度；
u：流动相的线速度
8
ppt课件
色谱理论：速率理论--影响柱效的因素
H = A + B/u +C·u
9
ppt课件
色谱理论：分离度
常用的其他的反相填料还有键合C8、C4、C2、 -NH2、苯基等。
20
ppt课件
液相色谱柱的安装
色谱柱的安装： 拆开柱包装盒，确认色谱柱的类型、尺寸、
出厂日期以及柱内贮存的溶剂。
21
ppt课件
液相色谱柱的安装
按柱管上标示的流动相流向， (如条件允 许，建议在柱前使用保护柱)；柱的出口与检 测器连接。连接管是外径为1.57mm、内径 为0.1-0.3mm的链接管。
16
ppt课件
色谱柱的构造
色谱柱管由柱接头、柱管及滤片组装而成。 柱接头采用低死体积结构，柱接头两端是
螺纹组件连接，中间放置压环用于密封。为了尽 量减少柱外死体积，在安装色谱柱时，用 Φ1.57mm连接管通过空心螺钉压环后要尽量插 到底，然后再拧紧空心螺钉。
17
ppt课件
色谱柱子的构造
不同厂家和型号的柱 子会有一定的差别
23
ppt课件
色谱连接注意事项
1.尽量减少死体积
24
ppt课件
连接管线与接头
1
10 mL 柱外体积
样品:
1
1. 苯丙胺酸
50 mL 柱外体积（管线） 2. 5-苯基-3, 6-二氧-2-哌嗪乙酸
3. Asp-Phe
4. 天冬甜素
3 2
4
3 2
4
0.0
0.5 1.0 1.5 2.0
Time (min)
分离度：两个相邻组分的保留值之差与其平均 峰宽之比。
R=2（TR2-TR1）/（W2+W1） 计算表明：
1：R<0.8时，两组分不能完全分离 2：R=1时，两组分峰重叠约2%
3：R=1.5时，两组分峰完全分离。 R值越大分离越好，反之则峰重叠愈多。
降低柱温、增加柱长可使R提高。
10
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样品组分的分离
液相色谱柱的应用
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1
目
录
一、液相色谱分离原理
二、液相色谱柱的结构
三、液相色谱柱的选择
四、色谱柱的使用
五、 分析条件的影响
六、色谱柱的维护
2
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一、 HPLC分离原理
样品组分在流动相和固定相之间进行分配，
由于不同组分在流动相和固定相之间的交 互作用能力(吸附.分配.离子交换.分子尺 寸等)不同，使得不同组分在色谱柱上的 移动速率不一样，从而产生色谱分离。 (必要条件)
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色谱柱的构造
.色谱柱管
常用内壁抛光的不锈钢管作色谱柱的柱管以获 得高柱效。使用前柱管先用氯仿、甲醇、水依次清洗， 再用50%的HNO3对柱内壁作钝化处理。钝化时使用 HNO3在柱管内至少滞留10min，以在内壁形成钝化 的氧化物涂层。
色谱柱规格
内径：常用4.6mm，2.1mm
柱长：常用50，100，150，250cm
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分配过程
4
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分配系数 - K
K= CS
Cm
K= 常数 （T恒定）
Cm =组分在流动相中的浓度 Cs = 组分在固定相中的浓度
5
ppt课件
容量因子k
是指在一定条件下，组分在两相间达到分配平衡时的质量比。 在实际工作中，常应用另一表征色谱分配平衡过程的重要参数—— 容量因子(capacity factor)，也称分配比(partition ratio)，以 k 表示。
k = Ms / Mm Ms为组分在固定相中的质量， Mm为组分在流动相中的质量
k tR t0 t0
由保留时间计算出容量因子，即可由实验测定容量因子k
6
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色谱理论：塔板理论--柱分离效能指标
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色谱理论：速率理论--影响柱效的因素
速率理论是荷兰学者范·弟姆特于1956年
连接管通过空心螺钉、压环后尽量用力 插到底，然后顺时针拧紧空心螺钉，直到拧不 动为止。
如色谱柱通过流动相加压后有漏液现象， 请用扳手继续顺时针拧1／4圈，直至不漏液 为止。
22
ppt课件
连接接管必须注意：
螺母坡度不匹配，密封性差
如果伸出的管线长度过长，可能漏液
死体积区
如果伸出的管线长度不够，可能产生死体积
色谱柱的构造
柱填料：
液相色谱柱的分离作用是在填料与流动相之 间进行的，柱子的分类是依据填料类型而定。常用 颗粒粒径在3—10 µm的范围内。
正相柱：多以硅胶为柱填料。另一类正相填料是 硅胶表面键合—CN，-NH2等官能团即所谓的键合 相硅胶。
反相柱：主要是以硅胶为基质，在其表面键合十 八烷基官能团(ODS)的非极性填料。
0.0 0.5 1.0 1.5
2.0
Time (min)
色谱柱: StableBond SB-C18,
18
ppt课件
液相色谱柱的构造
在两端柱接头内，柱管两端各放置一 片不锈钢滤片(或滤网)，用于封堵柱填料不 被流动相冲出柱外而流失。空柱各组件均为 不锈钢材质，能耐受一般的溶剂作用。但由 于含氯化物的溶剂对其有一定的腐蚀性，故 使用时要注意，柱及连接管内不能长时间存 留此类溶剂，以避免腐蚀。
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27/10/2019
13
ppt课件13
高性能－UltiMate 3000 x2 三元梯度系统
独特的双梯度泵：两个三元 梯度泵封装在一个机箱内
有六通道脱气机的 溶剂架
带温控选项的自动 进样器
独特的柱温箱可放置两个柱 切换阀
14
可变波长或二极管矩阵 紫外可见光检测器
ppt课件
二、色谱柱的结构和安装
液相色谱柱的应用
– 进样周期15 秒 – 进样阀耐压1000 bar
TCC-3000RS 柱温箱
– 5-110 °C 温度范围 – 柱后冷却
DAD-3000RS检测器
– 全波长扫描范围数据采集速率100 Hz
Acclaim® 2 µm色谱柱
– 耐压800 bar
Chromeleon® CMS软件及时获得结果
11
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液相色谱的基本流程图
流动相
进样阀 泵
色谱柱
检测器
AB C
DE
G
F
泵输液 进样Hale Waihona Puke Baidu
分离
检测
12
记录
ppt课件
UltiMate 3000 RSLC 快速分离液相
HPG-3x00RS 泵
– 在整个流速范围下保持800 bar高压 – 最高流速达到5 ml/min
WPS-3000RS 自动进样器
提出的, 表述了影响柱效的因素及提高柱效的多
种途径，其核心是速率方程（也称范·弟姆特方程
式）。
速率方程
H = A + B/u +C·u
H：理论塔板高度；
u：流动相的线速度
8
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色谱理论：速率理论--影响柱效的因素
H = A + B/u +C·u
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色谱理论：分离度
常用的其他的反相填料还有键合C8、C4、C2、 -NH2、苯基等。
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液相色谱柱的安装
色谱柱的安装： 拆开柱包装盒，确认色谱柱的类型、尺寸、
出厂日期以及柱内贮存的溶剂。
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ppt课件
液相色谱柱的安装
按柱管上标示的流动相流向， (如条件允 许，建议在柱前使用保护柱)；柱的出口与检 测器连接。连接管是外径为1.57mm、内径 为0.1-0.3mm的链接管。
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色谱柱的构造
色谱柱管由柱接头、柱管及滤片组装而成。 柱接头采用低死体积结构，柱接头两端是
螺纹组件连接，中间放置压环用于密封。为了尽 量减少柱外死体积，在安装色谱柱时，用 Φ1.57mm连接管通过空心螺钉压环后要尽量插 到底，然后再拧紧空心螺钉。
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色谱柱子的构造
不同厂家和型号的柱 子会有一定的差别
23
ppt课件
色谱连接注意事项
1.尽量减少死体积
24
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连接管线与接头
1
10 mL 柱外体积
样品:
1
1. 苯丙胺酸
50 mL 柱外体积（管线） 2. 5-苯基-3, 6-二氧-2-哌嗪乙酸
3. Asp-Phe
4. 天冬甜素
3 2
4
3 2
4
0.0
0.5 1.0 1.5 2.0
Time (min)
分离度：两个相邻组分的保留值之差与其平均 峰宽之比。
R=2（TR2-TR1）/（W2+W1） 计算表明：
1：R<0.8时，两组分不能完全分离 2：R=1时，两组分峰重叠约2%
3：R=1.5时，两组分峰完全分离。 R值越大分离越好，反之则峰重叠愈多。
降低柱温、增加柱长可使R提高。
10
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样品组分的分离