防腐剂复配对溶血性金黄色葡萄球菌抑菌效果研究

基金项目：河南省基础与前沿技术研究计划项目（项目编号：082300430050）。

通讯作者：黄现青（1977—），男，河南安阳人，博士，副教授，主要从事于食品微生物安全控制方面的研究。

防腐剂复配对溶血性金黄色葡萄球菌抑菌效果研究

黄现青，高晓平，李苗云，张秋会，赵改名，孙灵霞

（河南农业大学食品科学技术学院/河南省肉制品加工与质量安全控制重点实验室，郑州450002）

摘要：选择不同的防腐剂，通过药敏纸片法、最小抑菌浓度（MIC ）法测定金黄色葡萄球菌对其敏感性，利

用正交设计筛选最佳防腐剂组合，并对获得的最佳防腐剂组合抑菌效果进行验证。结果表明，金黄色葡萄球菌对乳酸钠、山梨酸钾不敏感，而对乳酸链球菌素（Nisin ）、聚赖氨酸、尼泊金乙酯较为敏感，MIC 分别为0.005、0.005和0.313mg /mL 。正交试验结果表明，当Nisin 、聚赖氨酸和尼泊金乙酯浓度分别为0.01、0.02、0.125mg /mL 时效果最佳，可使基质中金黄色葡萄球菌降低7.64个数量级。选择这一最佳组合显示，在室温（25ħ）里脊肉、牛乳中细菌数在经过4d 放置后，仅仅分别增长2.78、1.86个数量级，而猕猴桃汁细菌数降低了0.73个数量级。

关键词：防腐剂；金黄色葡萄球菌；抑菌

微生物广泛分布于自然界，食品是天然的微生物培养基，极易受到微生物的污染，当环境条件适宜时，他们就会迅速生长繁殖，造成食品的腐败与变质，不仅降低了食品的营养和卫生质量，而且还会危害到人体的健康。金黄色葡萄球菌是细菌类腐败菌中与食品腐败关系极为密切的一种菌，该菌为兼性厌氧、过氧化氢酶阳性的球菌，可以发酵葡萄糖、分解甘露醇，卵磷脂酶阳性，可产生肠毒素等多种毒素及血浆凝固酶，人食入被

该菌污染的食品后可引起食物中毒［1］

。所以，对该种菌

的抑菌研究有着重要的意义。

乳酸链球菌素（Nisin ）、聚赖氨酸、山梨酸钾、乳酸钠、尼泊金乙酯均是食品中常用的防腐剂，但是抑菌特点不同，鲜见关于复配防腐剂抑制金黄色葡萄球菌作用效果研究。鉴于金黄色葡萄球菌对食品安全的威胁，以及复配可降低单一防腐剂过量使用的风险，本文用Nisin 、聚赖氨酸、山梨酸钾、乳酸钠、尼泊金乙酯5种防腐剂对金黄色葡萄球菌的抑菌效果加以研究，并对防腐剂的最佳配比进行优化，旨在为商业应用提供科学依据。

1

材料与方法

1.1

材料

Nisin 、聚赖氨酸，浙江银象生物工程有限公司；

山梨酸钾、乳酸钠、尼泊金乙酯，均为食品级；牛肉浸膏、蛋白胨，购自北京双旋WSW 培养基制品厂；

平板计数琼脂，由北京奥博星生物技术有限责任公司提供；溶血性金黄色葡萄球菌标准株，购自中科院微生物所。1.2方法1.2.1

培养基的配制

LB 液体培养基（牛肉膏0.5%、蛋白胨1%、氯化钠0.5%、pH 7.2—7.4）、LB 固体培养基（在LB 液体培养基中加入1.5%琼脂粉）、平板菌落计数琼脂（称取23.5g 加入到1L 蒸馏水中加热煮沸溶解后分装），均于121ħ灭菌15min ，冷却后备用。1.2.2

敏感性测定

敏感性测定分别采用药敏纸片法和最小抑菌浓度法（MIC ），参照文献［2］进行。1.2.3

正交试验设计

选取3种敏感性较高、MIC 较小的防腐剂，设计3因素3水平正交试验，筛选最优防腐剂复配组合。1.2.4

应用试验

利用优化后的最佳配方，以肉糜（双汇冷鲜肉供应的新鲜里脊肉打碎制得）、牛乳（河南农大好好吧配送，无任何防腐剂）、果汁（购买超市新鲜猕猴桃，自己加工制得）为基质，于25ħ放置不同时间，研究其对溶血性金黄色葡萄球菌的抑制效果。1.3

菌落计数

菌落总数的测定：按照GB /T4789.2-2010，采用平板倾注法［3］。

12中国食物与营养第18卷2结果与分析

2.1敏感性测定结果

利用药敏纸片法测定不同防腐剂对溶血性金黄色葡

萄球菌抑菌圈的大小，确定溶血性金黄色葡萄球菌对不

同防腐剂的敏感性，结果见表1。由表1可知，Nisin、

聚赖氨酸、尼泊金乙酯对溶血性金黄色葡萄球菌有抑菌

作用，在浓度为20mg/mL时抑菌圈直径分别是9.5mm、

10mm和11mm。

表1抑菌圈直径单位：mm

浓度（mg/mL）Nisin聚赖氨酸

尼泊金

乙酯

乳酸钠

山梨

酸钾

209.51011——

108.578.5——

5——7——

以96孔微量酶标板测定MIC，利用GF-M2000酶标仪在492nm处测定吸光度值，结果表明，Nisin、聚赖氨酸、尼泊金乙酯的MIC分别为0.005、0.005、0.313mg/mL。

本次数据的分析是为正交试验做准备，以确定正交试验所需要的各种防腐剂的适宜浓度。根据敏感性测试和酶标仪的MIC测定结果，确定正交试验的三因素为Ni-sin、聚赖氨酸和尼泊金乙酯。另外，根据国标GB2760－2007对此几种防腐剂的限量：Nisin在果汁、牛乳、肉类及其制品分别为0.2、5.0、0.5g/kg；尼泊金乙酯LD

50

为5g/kg，ADI为0—10mg/kg；聚赖氨酸尚未规定。由此，确定正交试验的三因素水平。

2.2正交试验结果

正交试验设计见表2，试验结果见表3。根据表3极差值分析，尼泊金乙酯的抑菌效果最为明显，聚赖氨酸次之，Nisin最弱。由表3显示，Nisin的水平一、聚赖氨酸和尼泊金乙酯的水平二的抑菌效果在正交系列中最好，故选择该3种防腐剂的此3种水平进行应用试验研究，即Nisin0.01mg/kg、聚赖氨酸0.02mg/kg、尼泊金乙酯0.125mg/kg。

表2正交试验因素与水平

水平

因素

Nisin

（mg/mL）

聚赖氨酸

（mg/mL）

尼泊金乙酯

（mg/mL）

10.010.020.039

20.010.020.039

30.06250.1250.25

表3正交试验结果

试验号Nisin聚赖氨酸

尼泊金

乙酯

细菌数

（cfu/mL）1111 3.36

21221

3133 4.3

4212 3.66

5223 3.05

6231 3.49

7313 2.65

8321 3.59

9332 2.69

100008.64

k

1

2.89

3.22 3.48

k

2

3.4 2.55 2.45

k

3

2.98

3.5 3.33

极差R0.510.95 1.03

因素主次顺序C＞B＞A

优组合A1B2C2

2.3应用试验的结果

室温（25ħ）处理3种样品菌落计数结果见表4。由表4可知，3种样品在室温贮藏加入最佳防腐剂配比后可有效地减缓细菌的增殖，里脊肉、牛乳中细菌数在经过4d放置后，仅仅分别增长2.78、1.86个数量级，而猕猴桃汁细菌数还减少了0.73个数量级，3种样品的腐败速度以牛乳最快，而猕猴桃汁最慢，可能与猕猴桃中含有丰富的维生素C、具有防腐效果有关［4］。

表4复配防腐剂对不同食品介质的抑菌效果

时间（d）猕猴桃汁（logCFU/mL）里脊肉（logCFU/mL）牛乳（logCFU/mL）

对照试验对照试验对照试验

0 4.17 4.17 4.98 4.98 6.12 6.12

2 5.26 4.26＞9.007.15＞9.00 6.58

47.38 3.74—7.76—7.98注：—表示未检测

3结论

根据敏感性测试及MIC酶标测定结果显示，金黄色葡萄球菌对乳酸钠、山梨酸钾不敏感，而对Nisin、聚赖氨酸、尼泊金乙酯较为敏感，在浓度为20mg/kg时抑菌圈直径分别是9.5mm、10mm和11mm；MIC分别为